Wir erkennen die Unterstützung der NIH Zuschüsse R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation und das Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin.

HINWEIS: Ethische Aussage: Alle Forschungs mit Wirbeltieren wurde nach Protokollen von der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) zugelassen geführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Geben Sie 10 ml des im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zellentrennmedium (das Polysaccharose und Natriumdiatrizoat enthält, auf eine Dichte von 1,077 g / ml eingestellt) auf RT in einem 50 ml konischen Röhrchen kommen. </li><li> Vorbereitung Durchflusszytometrie (FACS) mit Puffer 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2% fötalem Kälberserum (FCS). Nehmen Sie ein 50 ml Aliquot und dieses aliquoten bei RT für den Einsatz zu halten während des Dichtegradienten Zelltrennmedien Schritt. </li><li> Haben Sie einen Eimer mit Eis bereit, isolierten Gewebe und Zellen in während der Isolierungsverfahren beizubehalten. </li></ol> 2. Bereiten Kultur Medien <ol><li> Vorbereitung Basalmedium: MEM (Minimal Essential Medium) ohne Phenolrot (500 ml), Glutamat (1x), FCS (10x), 10.000 Einheiten / ml Penicillin (1x). </li><li> Filtern Basalmedium mit einem 0,22 um-Filter. </li><li> Bereiten Knochenmark-Makrophagen-Induktionsmedien: <ol><li> Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien. </li><li> In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration. </li><li> Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml. </li><li> Nicht filtern die endgültige Lösung von Knochenmark-Makrophagen-stimulierende Medien. </li></ol></li><li> Bereiten Osteoklasten Induktionsmedien: <ol><li> Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien. </li><li> In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration </li><li> Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml. </li><li> Hinzufügen RANKL bei 10 ng / ml. </li><li> Nicht filtern die endgültige Lösung von Osteoklasten Induktionsmedien. </li></ol></li></ol> 3. Knochenmark-Isolation <ol><li> Euthanize einer C57BL / 6-Maus,Verwendung von Kohlendioxid Inhalationsverfahren, gefolgt durch zervikale Dislokation. HINWEIS: Nagetiere müssen von geschultem Personal mit geeigneten Technik, Ausrüstung und Agenten eingeschläfert werden. </li><li> Position und sichern Sie die Maus auf eine Dissektion Bord und Spray mit 70% Alkohol. </li><li> Präparieren Sie die Oberschenkelknochen, Schienbeine, Oberarmknochen und Wirbelsäule. <ol><li> Beginnen Sie mit der Maus in Rückenlage. Einen Einschnitt vertikal entlang der unteren Extremität und beginnen durch Sezieren entlang der Länge des Oberschenkelknochens und des Schienbeins durch Division Weichgewebe-Anhänge. Schließlich verrenken Knochen vom Knie und Hüftgelenk Knochen vollständig aus dem Skelett zu befreien. </li><li> Gehen Sie, um einen Einschnitt entlang der Länge der oberen Extremitäten, den Oberarmknochen zu isolieren machen. Verrenken den Humerus an der Schulter und Ellenbogengelenke durch Sezieren Weichgewebe Kapselansatz. </li><li> Schließlich drehen Sie die Maus über, so dass die Maus liegt auf dem Bauch. Machen Sie eine Hautschnitt entlang der Länge der Wirbelsäule, in der Mittellinie. Beachten Sie die paravertebralen WeichGewebe auf jeder Seite der Wirbelsäule und Einschnitt entlang der knöchernen Rand der Wirbelsäule, Sezieren durch die paravertebralen Weichgewebemasse. Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt über der Wirbelsäule an der Basis des Halses, und am Ende der Wirbelsäule, genau proximal zum Schwanz Insertion, die Befreiung der Wirbelsäule vom Weichteilbefestigung. </li></ol></li><li> Sobald die Knochen geerntet werden, halten sie in FACS-Puffer auf Eis. </li><li> Verwenden Sie Seidenpapier, um Muskeln und Weichteile von den Knochen zu reinigen. </li><li> Legen Sie die gereinigten Knochen in einen Mörser und Stößel mit 3 ml FACS-Puffer. </li><li> Crush die Knochen sanft im Stößel und Mörser. </li><li> Absaugen der blutigen Flüssigkeit und Überführung in eine 50 ml konischen Röhrchen, indem die Lösung durch ein 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> 5 ml FACS-Puffer, um das zerkleinerte Knochen und weitere zerquetschen. Wieder, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und Transfer zum 50 ml konischen Röhrchen durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb. </li><li> Die Knochen twi Typischerweise zerquetschence zu dreimal in frischem FACS-Puffer mit einem Mörser und Stößel, jedes Mal Zugabe von weiteren 5 ml frischem FACS-Puffer, bis die Flüssigkeit hinterlässt keine Flecken rot. </li><li> Zentrifugieren des Knochenmarks Lösung bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten. </li></ol> 4. Gradiententrennung von Knochenmarkszellen <ol><li> Aspiration des Überstands und Resuspension in 10 ml FACS-Puffer (bei RT gehalten). </li><li> Nehmen Sie die 50 ml konischen Röhrchen, enthaltend 10 ml von im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zelltrennmedium (RT). </li><li> Schicht die Knochenmark-Lösung auf den Dichtegradienten Zellseparationsmedium. Tun Sie dies langsam mit Hilfe eines elektrischen Pipette. Winkel der Pipettenspitze gegen die Innenfläche in der Nähe der Spitze der konischen Rohr und Neigung der konischen Rohr auf ca. 30 °. Eine langsame Geschwindigkeitseinstellung für die Pipette vorsichtig vertreiben die Knochenmarklösung, um nicht den Dichtegradienten Zelltrennungsmedium stören. HINWEIS: Letztlich wird essein eine klare Definition zwischen den beiden Lösungen (Mobillösung und Dichtegradienten Zellseparation Media-Lösung). </li><li> Mit einem RT Zentrifuge Zentrifugation der Dichtegradienten Zelltrennmedien und Zelllösung in einem ausgewogenen Zentrifuge bei 200 xg für 15 min. Darüber hinaus entfernen Beschleunigung und Verzögerung an der Zentrifuge, um eine ausreichende Phasentrennung zu gewährleisten mit der Dichtegradienten Zelltrennmedien Gradienten. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen den bewölkten Mittelschicht, die die Knochenmarkzellen von Interesse enthält. </li><li> Übertragen diese Zellen in ein neues konisches Rohr. 20 ml zusätzliches FACS-Puffer (auf Eis gehalten), um die Zellen zu waschen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten. </li><li> Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 1 ml Makrophagen stimulierende Medien zur Zellzählung mit einer Zählkammer ermöglichen. </li></ol> 5. Zellzählung <ol><li> Nimm 10 &amp; mgr; l der Zelllösung und Mischenmit 10 ul Trypanblau. Last 10 ul der resultierenden Mischung auf einem Hämozytometer und erhalten die Zellzahl pro ml Lösung. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Platzieren 2 ml Makrophagen stimulierende Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Hinzufügen 200.000 Zellen in jede Vertiefung. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist zell Plattierungsdichte eine der wichtigsten Voraussetzungen für eine angemessene in vitro Kultivierung von Osteoklasten. </li><li> Die Platte und in einem regelmäßigen Inkubator behutsam schütteln bei 37 ° C. </li><li> Die Medien für 3 Tage nicht verändern. </li><li> Nach 3 Tagen in Makrophagen stimulierende Medien verändern die Medien, um Osteoklasten Medien. </li><li> Jenseits, ändern Sie die Medien täglich für 5-7 Tage, an welchem ​​Punkt, große, mehrkernige Osteoklasten sollte auf der Kulturplatte sichtbar sein. </li></ol> 7. Färbung mit Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) <ol><li> Nach 5-7 Tagen in vitro cultur, saugen Sie den Medien aus der Kultur gut. </li><li> Vorsichtig mit 1x PBS dreimal waschen Brunnen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehydlösung und lassen für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Während dieser Zeit bereiten die TRAP-Färbung (das im Handel erhältlich ist) durch Vorwärmen auf 37 ° C. </li><li> Nach 1 Stunde in Para, absaugen Para und vorsichtig waschen 3 Mal mit 1x PBS. </li><li> 1 ml der vorgewärmten TRAP-Färbung in jedes Well der Platte zu gefärbt werden. </li><li> Die Platte wird in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 h, vor Licht geschützt. </li><li> Nach 1 Stunde, absaugen das TRAP-Färbung. </li><li> 3 mal mit vorgewärmten deionisiertem Wasser waschen die Vertiefungen geben. </li><li> Gegenfärbung der gut mit Gill Hämatoxylin (VORSICHT) für 1-2 min. </li><li> Bild Osteoklasten mit Hellfeldmikroskopie. </li><li> Waschen Vertiefungen mit entionisiertem Wasser, bis eine ausreichende Farbintensität des Flecks erreicht ist, typischerweise, wenn Kerne erscheinen Blue. </li></ol> 8. Osteoklasten Resorption Assay <ol><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen 24-Well-Polystyrol-Kulturschale, die entweder mit Knochen Substrat oder einem anorganischen kristallinen Calciumphosphat-Beschichtung vorbeschichtet ist. </li><li> Platz 2 ml Makrophagen stimulierende Medien in jedes Well. </li><li> Hinzufügen 200.000 frisch isolierte Knochenmarkszellen am Ende von Schritt 2 zu jeder Vertiefung erhalten. </li><li> Die Platte behutsam schütteln vor dem Einlegen in einem Brutschrank bei 37 ° C für 3 Tage. </li><li> Am Tag 3 Verändern Sie die Medien, um die Differenzierung von Osteoklasten Medien. </li><li> Führen Sie täglich Medienwechsel mit Osteoklastendifferenzierung Medien für 5-7 Tage. </li></ol> 9. Quantifizierung von Osteoklasten Resorptionsaktivität <ol><li> Nach 5-7 Tagen der in vitro-Kultur in der Osteoklastendifferenzierungsmedien auf einem mineralisierten Substrats, analysieren die mineralisierten Oberfläche, wie nachstehend beschrieben, um die Fähigkeit von Osteoklasten zu bilden resorpti beurteilenauf Gruben, ein Indikator für die Osteoklasten-Aktivität. </li><li> Saugen Sie Medien aus dem Resorption Assayplatte und fügen Sie 100 ul 10% Bleichmittel-Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 10% Bleichmittel-Lösung für 15 min bei RT. </li><li> 3 mal mit destilliertem Wasser waschen die Vertiefungen geben. </li><li> Absaugen restliche Wasser und schütteln Sie überschüssiges Wasser von der Platte und an der Luft trocknen für 3-5 Std. </li><li> Gegenfärbung der Platte mit einem im Handel erhältlichen Von Kossa-Färbung Kit zur leichteren Visualisierung des nicht resorbiert Substrat zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Hellfeldmikroskopie, um Bilder von repräsentativen Teilen der resorbiert Fläche zu nehmen. </li><li> Mit Bildanalyse-Software, die Berechnung der Prozentanteil der resorbierten Oberfläche für die Quantifizierung der Osteoklasten Resorptionsaktivität ermöglichen. </li></ol>

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Keiner der Autoren hat Offenlegung oder Interessenkonflikt zu erklären.

Eine Fähigkeit, leicht zu isolieren und zu kultivieren eine große Zahl von Osteoklasten in vitro wurde für die Hilfe, Verständnis für Knochenbiologie und Osteoklasten-vermittelten Krankheiten voranzutreiben verantwortlich. Es war die Identifizierung von RANKL, die zu diesem führen, als es vor kurzem als Hauptregulator der Osteoklastenbildung, Differenzierung und das Überleben von 16 bis 18 identifiziert. Es ist unsere Erfahrung, dass die in vitro-Kultivierung</...

Knochenumbau ist dynamisch und umfasst die Kopplung von Knochenbildung mit Knochenresorption 1. Diese stark regulierten Prozess ist für die Aufrechterhaltung der Skelett während normaler Homöostase verantwortlich ist und in Reaktion auf eine Verletzung und Krankheit. Osteoklasten sind einzigartig, mehrkernige Zellen, die fähig resorbierenden sowohl die organischen und anorganischen Matrizen von Knochen sind. Osteoklasten sind aus der Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark 2-5 abgeleitet. Anomalien in der Funktion oder Bildung von Osteoklasten in einer Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich gemeinsamer Erkrankungen wie Osteoporose führen. Die Fähigkeit, die Osteoklasten in vitro zu erzeugen hat signifikante Fortschritte im Verständnis von Knochen biology 6 erlaubt. Als Ergebnis werden neue therapeutische Mittel Schwellen Osteoklasten bedingten Krankheiten, die zur schweren Erkrankungen und Todesfälle verantwortlich sind, zu behandeln 7 </sup&gt;. Homöostatische Wartung der Knochenmasse und Kraft erfordert die konzertierte Aktion der knochenbildenden Osteoblasten und Knochen Osteoklasten 8,9. Knochenhomöostase ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich postmenopausalen Osteoporose verändert, bei denen erhöhte Osteoklastenaktivität führt zu pathogenen Verlust von Knochenmasse und Dichte 10. Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen menschlicher Krankheiten gibt es mehr Möglichkeiten, um die Rolle der Osteoklasten in menschlichen Knochenerkrankung 11-13 entziffern. Zahlreiche Protokolle für Osteoklastenkulturverfahren werden in der Literatur, mit vielen Variationen beschriebene 9,12,14. Xing und Kollegen beschreiben ähnliche Methodik auf die nachstehend beschriebenen, in ihrer Beschreibung osteoclastogenic Assays von murinen Knochenmarkszellen Protokoll. Allerdings, um die Knochenmarkzellen nach langen Knochen Ernte freizugeben, Xing et al. Spülen Markhöhle mit α-MEM komplette Medien14. Catalfamo untersucht die Wirkung von Hyperglykämie auf die Osteoklastenfunktion und beschreibt ein Verfahren, bei denen alle Zellen von Knochenmark mobilisiert Spülung kultiviert für 24 Stunden, wobei an diesem Punkt die nicht-adhärenten Zellen werden verworfen, 12, auch eine Technik von Boyle et al . 9 Die zuvor veröffentlichten Protokollen erfordern die Durchführung der Spülung des Knochenmarks, eine mühsame Praxis, die führt auch das Risiko einer Nadelstichverletzung und den Verlust wertvoller Knochenmark, so muß man die beiden Enden des Knochens schneiden. Das Protokoll, das wir beschreiben, führt die Verwendung von Mörser und Pistill zu Osteoklasten zu isolieren, die ähnlich dem Verfahren von Weischenfeldt et al Makrophagen Isolation 15. Unsere Erfahrung ist jedoch, dass Osteoklasten Isolierung und in vitro-Kultur unter Verwendung von früher veröffentlichten Verfahren ergibt unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die Osteoklasten-Produktion, was häufigin der Unfähigkeit, die Osteoklasten zu kultivieren. Daher haben wir ein Protokoll, das für die konsequente Trennung von Knochenmark der Maus eine große Anzahl von mehrkernigen Osteoklasten in vitro, mit einer ungefähren Ausbeute von 70-80% der Zellen anfänglich plattierten Form Makrophagen und Osteoklasten erzeugen kann anschließend in Gegenwart entwickelt, Osteoklasten Induktionsmedien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, die von Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark abgeleitet sind. Ihrer einzigartigen Fähigkeit, sowohl die organischen und anorganischen Matrices von Knochen resorbieren, bedeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Skelettumbau spielt. Gemeinsam sind Osteoblasten und Osteoklasten für die dynamische Kopplung Prozess, der sowohl die Knochenresorption und gemeinsam handeln, um den normalen Skelett während Gesundheit und Krankheit pflegen Knochenbildung beinhaltet verantwortlich. Als Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper, können Änderungen in der Osteoklastendifferenzierung oder Funktion in tiefgreifende Wirkungen im Körper führen. Krankheiten mit veränderter Osteoklasten-Funktion verbunden sind, können im Schweregrad von letalen neonatalen Erkrankung aufgrund eines Fehlers einen Markraum für Hämatopoese bilden reichen, um mehr häufigsten beobachteten Pathologien wie Osteoporose, bei denen eine übermäßige Knochenresorption durch Osteoklasten prädisponiert Formation zu brechen. ent &quot;&gt; Eine Fähigkeit, Osteoklasten in hoher Anzahl in vitro zu isolieren hat für bedeutende Fortschritte im Verständnis der Knochenumbauzyklus erlaubt und hat den Weg für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien, die Bekämpfung dieser Krankheiten geebnet. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu isolieren und zu kultivieren Osteoklasten aus Knochenmark der Maus, die eine große Zahl von Osteoklasten ergeben wird.

<html> Das Ziel dieses Verfahrens war die einfache Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten in vitro, typischerweise in einer Woche. Erfolgreiche Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten wurde mit Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung (1A) bestätigt. Große Osteoklasten werden als große, violette Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise ≥ 3 Kerne) visualisiert. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es üblich, Osteoklasten mit nicht weniger als 30 Keime pro Osteokl...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine.  Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro. 

Serie: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.