Die Autoren bedanken sich für die Finanzierung dieser Forschung Dank und Anerkennung des Medical Research Council - MRC-FAP Zuschuss Code G1000788-98812.

1.Scaffold Herstellung und Sterilisation <ol><li> Löse PCL in 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol, um eine 10% w / v-Konzentration zu ergeben. Dar. Wie in Bosworth et al, 9 elektrospinnen Polymerlösung (Parameter: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm) beschrieben und sammeln ausgerichteten Fasern auf dem Rand einer rotierenden Dorn (600 rpm). Mit einem Skalpell entfernen Sie das Farbband der gesammelten Fasern und dann schneiden Sie in kürzeren Längen - 3 cm (für Mulden und Rundgefäße) und 4 cm (für die Zellkultur-Einsätze) Längen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette tauchen einzelnen Streifen in destilliertem Wasser, und entfernen. </li><li> Halten Sie beide Enden zwischen Daumen und Zeigefinger; manuell drehen Sie den Streifen bis es ähnelt Faden. </li><li> Kurz tauchen diese fadenförmigen Gerüst in destilliertem Wasser und setzen auf saubere, nicht-faserförmigen Karte, um zu trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen statt einzeln in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml 50% v / v Ethanol in destilliertem Wasser. Schließen Sie den Deckel und lassen für 24 Std. Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter Laminar Flow: </li><li> Zeigen Mikrozentrifugenröhrchen in einer Sterilbank und saugen Sie den 50% v / v Lösung. Ersetzen mit 1 ml 70% v / v Ethanol in destilliertem Wasser, in der Nähe Deckel und lassen für 24 Stunden. </li><li> Wiederholung für 90% und 100% v / v Ethanol in destilliertem Wasser (1 ml Volumen). </li><li> Waschwarten zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 24 Stunden pro Waschung (2 × 1 ml). </li><li> PBS entfernen und ersetzen mit 1 ml Zellkulturmedien. Hinweis: Gerüste sind gebrauchsfertig nach dem 24-Stunden. </li></ol> 2. Bestimmen Gerüst Fläche und Anzahl der Zellen <ol><li> Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, den Durchmesser der elektrogesponnenen Garns entlang seiner Länge, um einen Mittelwert zu bestimmen. </li><li> Nehmen wir den Faden, um eine zylindrische Stange und den Oberflächen-Bereich mit: </li><li> A = Fläche, r = Radius und h = Länge Anmerkung: Die Oberfläche wurde berechnet, um 18.902 sein, 800 &amp; mgr; m 2. Ferner sei darauf hingewiesen, dass die tatsächliche Oberfläche größer sein wird als dieser Berechnung, wenn das Garn von Hunderten von feinen Fasern, die den Oberflächenbereich zu vergrößern wird zusammengesetzt sein. Folglich ist eine größere Anzahl von Zellen in der Lage, um das Gerüst zu befestigen. Allerdings bedeutet dies keine Auswirkungen auf einen direkten Vergleich zwischen den Testgruppen gemacht. </li><li> Bestimmung der maximalen Anzahl von Zellen, die an der freiliegenden Gerüstoberfläche anbringen könnte: Hinweis: Die Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, wurde der Durchmesser der humanen mesenchymalen Stammzellen bestimmt zu sein, 20 um (vorausgesetzt Zellen rund sind), also in diesem Fall, die Anzahl der Zellen = 60.200. </li></ol> 3. Gerüst Set-up - Zellkultureinsätze (1A) <ol><li> Unter laminaren Strömung, öffnen Sie die sterile 6-Well-Zellkultur-Einsätzen und trennen Sie die kürzeren Ringe mit Zähnen aus den breiteren beringten Körper. </li><li> Nehmen Sie den Ring mit den Zähnen nach oben. Hängen Sie einder 4 cm Gerüste über die Mitte des Rings sicherstellen, dass es Überschneidungen auf beiden Seiten. Nehmen Sie den beringten Körper und Position über dem Zahnkranz und Gerüst und nach unten drücken um sicherzustellen, das Gerüst bleibt in Position und liegt in der Mitte des Zellkultureinsatzes. </li><li> Setzen Sie den Zellkultureinsatz mit Gerüst in die Vertiefung einer 6-Well, niedrige Bindungsplatte. </li><li> 10 ml Kulturmedien zum Schafott. </li></ol> 4. Gerüst Aufbau - Trough (1B) <ol><li> Unter laminaren Strömung statt Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Tröge in einzelne Petrischalen und 10 ml Kulturmedien, um den Trog. </li><li> Mit einer Pinzette drapieren eine der 3 cm Gerüsten in den Trog, um sicherzustellen, ihre Länge liegt parallel zur längeren Kante der Mulde ist. </li></ol> 5. Gerüst Aufbau - Bioreaktor Fahrzeug (1C) <ol><li> Unter laminaren Strömung, verzichten 10 ml sterilem PBS durch den Bioreaktor SchiffesHaupthafen und lassen für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die PBS und ersetzen mit 8 ml Kulturmedien. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine der 3 cm Gerüste in den Behälter über den wichtigsten Hafen. </li><li> Schließen Sie den Haupthafen. </li></ol> 6. Zellzählung <ol><li> Kultur menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus dem Knochenmark nach Herstellerprotokoll bis zu Durchgang 4 vor der Ernte ab. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einer 75 cm 2 Kolben mit hMSCs aus dem Knochenmark (Durchgang 4, 80% Konfluenz) abgeleitet. </li><li> Mit 10 ml sterilem PBS und saugen Waschen Sie die Zellen. </li><li> 3 ml Trypsin und der Kolben wird bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen aus dem Kolben Oberfläche verdrängt. </li><li> 7 ml Kulturmedium, um das Enzym zu inaktivieren, und übertragen diese Gesamtvolumen (10 ml) in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Resuspendieren diese Zellsuspension durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um homogen zu dispergieren Zellen innerhalb derMedien und Grenze Zellagglomerate (10 ml Pipette). </li><li> Entfernen 20 ul der Zellsuspension und in ein Hämozytometer. </li><li> Stellen Sie das Hämocytometer unter einem Lichtmikroskop und Bild an x10 Ziel. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Rasterlinien und die Anzahl der Zellen in den 4 x 4 Plätze in jeder Ecke des Rasters und die innerhalb des Platzes fallen und die, die den rechten oder unteren Grenzlinie überqueren. Count für jeden Satz von 4 x 4 Plätze (4 Zählungen pro Netz). </li><li> Wiederholen Sie die Aufwirbelung und Zellzahl dreimal (Schritte von 6,6 bis 6,9). </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellzahl und bestimmen die Lautstärke für die Zell Aufwirbelung (Zellkonzentration 60.200 in 200 ul) erforderlichen Medien. Beispielsweise bestimmen die durchschnittliche Zellenanzahl aus dem Hämocytometer und dann bestimmen die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen aus den drei getrennten Zählungen. Multipliziert mit 1 x 10 4 bis Anzahl der Zellen pro ml und dann multiplizieren mit dem Gesamtvolumen der Zellsuspension zu geben, geben,tal Anzahl der Zellen. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um Volumen für Aufwirbelung erforderlichen Medien zu bestimmen: </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 241 xg für 5 min. </li></ol> 7. Zellaussaat <ol><li> Saugen Sie das Medium aus dem zentrifugierten Rohr Verlassen des Zellpellet und ersetzen mit dem berechneten Mediavolumen. </li><li> Die Zellen und Medien für eine ausgeglichene Mischung. </li><li> Mit einem P200 Gilson Pipette langsam verzichten 200 ul der Zellsuspension auf jedem Gerüst, indem Sie die Spitze der Pipette entlang der Gerüstfeldlänge und unterhalb des Medienflüssigkeitsoberfläche. Lassen Sie ungestört für 20 Minuten. </li><li> Für Bioreaktorgefäße, verzichten 200 ul der Zellsuspension durch den Haupthafen. Top-up die restlichen 2 ml Kulturmedium über die Spritze Ports, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben. </li></ol> 8. Experimentelle starten <ol><li> Übertragen Sie die Bioreaktorgefäße zum RCCS-4DQ Bioreaktor und soll bei 9 min drehen. </li><li> TranSFER die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf die Rüttelplatte und soll bei 30 Umdrehungen pro Minute drehen. </li><li> Übertragen Sie die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf dem Regal eines Zellbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 (statische Kultur) eingestellt. </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Bereiten Lösungen - Lyse-Puffer, 1x TE-Puffer, DNA-Standards und Zell-DNA Arbeitslösung - nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach 4 Stunden, entfernen Sie die Proben aus dem Inkubator und legen unter Laminar Flow. </li><li> Entfernen Sie die Medien-Fraktionen aus allen Proben und legen in getrennt bezeichneten Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 241 x g. Entfernen Sie den Überstand und 3 ml Lyse-Puffer. Resuspendieren die Lösung für das Aufbrechen des Zellpellets. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Gerüste und in Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Lyse-Puffer (für die Gerüste in den Bioreaktor Gefäße, entfernen Sie das Gerüst vor dem Ansaugen der michdia). Für Gerüste im Zellkultureinsätze statt, zunächst das Gerüst frei, indem das Gerüst in der Nähe des Einsatzes Rand mit einem Skalpell. </li><li> 3 ml Lyse-Puffer zu jedem Gerüstbehälter und kratzen die Oberfläche (heftig bewegen für die Bioreaktorgefäße). Entfernen Sie den Lysepuffer und legen in gesondert gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex jedem Zentrifugenröhrchen ca. 1 min auf eine ausreichende Bewegung der Zellen sicherzustellen und den Puffer und zur Lyse der Zellmembran zu fördern. </li><li> In einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen, fügen Sie 100 ul Lysepuffer für jede Probe Bruch - Gerüst, Medien und auch (duplizieren). </li><li> In der Dunkelheit, fügen Sie 100 ul der Zell-DNA-Lösung in jede Vertiefung Lysepuffer und vorsichtig mischen. </li><li> Umfassen Vertiefungen mit Lysepuffer, keine DNA und Zell-DNA-Lösung, um eine negative und positive Kontrolle für die Well-Platte bereitzustellen. </li><li> Mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenleser, die Absorption des guts mit 485 nm Anregungs- und 520 nm Emissions. </li><li> Vergleichen Sie die Daten mit der Standardkurve aus den DNA-Standards nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. </li></ol> 10. Rasterelektronenmikroskop (SEM) Fixation <ol><li> Führen Sie folgende Schritte unter Laminar Flow: Nach 4 Stunden, entfernen Sie alle Gerüste aus ihren Aufnahmen und innerhalb eines neuen 6-Well-Platte (getrennte Wells). </li><li> Zweimal mit PBS waschen Gerüste. </li><li> Führen Sie folgende Schritte auf dem offenen Bank: Zu jeder Vertiefung 2 ml 1,5% v / v Glutaraldehyd in PBS, um eine vollständige Abdeckung des Gerüstes zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 4 ° C für die Zellfixierung. </li><li> Entfernen Sie die Fixierungslösung und waschen Sie die Gerüste zweimal mit PBS. </li><li> Dehydratisieren die Gerüste mit steigenden Konzentrationen von Ethanol in destilliertem Wasser mit 50% v / v, gefolgt von 70% v / v und 90% v / v. Für jede Konzentration, die Gerüste in solutio voll eintauchenn (2 ml) und lassen Sie für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Entwässern in 100% Ethanol durch die vollständige Eintauchen in die Gerüste Lösung (2 ml) und lassen für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Chemisch trocknen die Gerüste mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in einem Abzug. Tauchen Sie die Gerüste in HMDS (2 ml) und lassen Sie für 5 min. Entfernen Sie die HMDS und wiederholen. </li><li> Entfernen Sie die HMDS und lassen Sie die Gerüste zum Trocknen. Montieren Sie die Gerüste auf handelsüblichen SEM Stubs (in diesem Fall Edelstahlstutzen mit Klebstoff Kohlenstoff Tabs). </li><li> Zur Erleichterung der Anzeige innerhalb des SEM, Mantel werden die Proben mit einem Gold Sputteranlage für 2 Minuten, um eine dünne und gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. </li><li> Prüfmuster im SEM und visualisieren die Zellaussaat Gerüste mit einem 5 keV Elektronenstrahl. </li></ol>

<ol>
	<li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells.">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li><li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR's.">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).</li><li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2/VEGF-A+signaling+pathway.">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li><li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li><li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds.">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li><li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering.">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li><li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair.">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li><li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds..">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds..</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li><li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular,+aligned,+and+contractile+blood+vessels.">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li><li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering:+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro.">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li><li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface.">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guan,+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase.">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li><li>Grant, D. S., Tashiro, K. -. I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro.">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li><li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+cell+seeding,+cultivation+parameters,+and+tissue+construct+characterization.">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Elektro Fasermatrizen aus Biopolymeren hergestellt werden regelmäßig verwendet, um die Zellhaftung und Proliferation zu Biomaterial und / oder Tissue-Engineering-Anwendungen 11,12 unterstützt. In diesen Fällen sind die Matrizen oft dünne Blätter aus Fasern, die leicht bedecken die gesamte Basis einer Zellkultur-Well-Platte und sind somit in vollständigen Kontakt mit ausgesäten Zellen, welche die Zellhaftung verbessert. Wenn jedoch die von Biomaterialien, nicht vollständig die Basis der Platte mit Vertiefungen zu bedecken, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein Großteil der angesiedelten Zellen werden nicht in Kontakt mit dem Gerüst zu bleiben und letztendlich nicht in der Lage zu befestigen. Diese Studie untersuchte verschiedene Vorgehens Impfen von Zellen auf Gerüsten, die nicht decken die Basis der Platte mit Vertiefungen, um ein optimiertes Verfahren, das für zukünftige zellbasierten Experimenten empfohlen werden könnte bestimmen. Fünf verschiedene Set-ups untersucht (Abbildung 1): scaffolds (elektro Garn) statt mit Zellkultur-Einsätzen in geringen Bindungs ​​Well-Platten und entweder unter statischen Bedingungen gehalten oder bei 30 Upm geschüttelt; Gerüste in engen PTFE Wannen und hielt statisch oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt; und Gerüsten innerhalb Bioreaktorgefäße 9 UpM untergebracht. Bestimmen der Anzahl von Zellen, die an die elektro Garne durch DNA Assay halten hatten gezeigt, ein geringer Prozentsatz der Befestigung für alle Impfen Aufbauten (Abbildung 2); und dies wurde weiter aus rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (SEM) (Abbildung 3) bestätigt. Greatest Zellhaftung - 30% bzw. ~ 18.060 Zellen -wurde für Garne, die in Zellkultur-Einsätzen gehalten und zu einer kontinuierlichen Bewegung unterzogen wurden nicht beobachtet. Interessanterweise wurde niedrigsten Zellanheftung (15%) für Garne von Zellkultureinsätzen gehalten, sondern unter statischen Bedingungen gehalten wird, die darauf schließen ließen, dass die Aufnahme von Radialbewegung hat einen positiven Effekt auf halten Zellen in Kontakt mit dem Gerüst erreicht. Jedochist darauf hinzuweisen, dass eine kontinuierliche kreisFluss der Medien kann für die aus den REM-Aufnahmen beobachtet Zellagglomerate verantwortlich sein werden. Die Rüttelplatte auf die niedrigste Einstellung gesetzt - 30 Umdrehungen pro Minute - das ist eine Einschränkung zu diesem Set-up sein könnte. Mit einem langsameren radiale Bewegung kann helfen, zu verhindern oder zu reduzieren Zell Agglomeration und könnte auch zu verbessern Zellhaftung als Zellen weniger Kraft zu erleben. Zukünftige Experimente sollten sich auf die Optimierung der ideal-Geschwindigkeit für eine verbesserte Zellhaftung zu konzentrieren. Die Einbeziehung Bewegung für Garne innerhalb der Rinnen gehalten nicht in einem ähnlichen Trend ergeben, wobei beide Szenarien ergeben 18% Befestigung (~ 10.836 Zellen); wenn dies aufgrund der teilweisen Flotation der Gerüste innerhalb der Rinnen sein, da sie nicht an der Basis verankert ist (bei Mulden auf der Rüttelplatte platziert beobachtet). Teil Floating des Gerüsts werden alle Zellen, die zu dem Boden des Troges aus in Kontakt mit dem Material und anhaftende versenkt verhindern. Für tseinen besonderen Aufbau, der Trog in eine Petrischale untergebracht ist und insgesamt 10 ml Mediumvolumen aufgenommen. Die kleinen Abmessungen der Mulde so dass die Mehrzahl der Medien innerhalb der Petrischale vorhanden ist, und wenn es irgendeine Bewegung, können Zellen von der Rinne in die Petrischale Drift und bleiben vollständig unzugänglich des Gerüsts. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sollten weitere Experimente einen zusätzlichen Schritt in dem Protokoll ist, wobei die Enden der Gerüste sind an der Basis der Mulden mit sterilen feinen Nadeln fixierten umfassen, da dies ihre Flotation und Bewegung (insbesondere bei Gerüsten ausgesetzt wird Radialbewegung), die letztlich zu einer erhöhten Anzahl von Zellen, die Befestigung am Gerüst führen. 16% der Zellen, die innerhalb der Drehgefäßen vorhanden Garne beigefügt hatte. Obwohl es eine gut etablierte Technik für 3D-Kultur, hat Probleme mit dem Abbau von Gerüsten vom Haupthafen der Schiffe, die in lose attac geführt hat ergebenhed Zellen verloren gehen. Die Schiffe, die vollständig geöffnet werden würde, dieses Problem zu beseitigen; diese sind erhältlich, sind jedoch erheblich teurer als die Einweggefäße in dieser Studie verwendet. Diese Studie zeigt die aktuellen Probleme mit der Aussaat Gerüste, die nicht die gesamte Basis von Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. Impfen eines bekannten Zellzahl ergab weniger als ein Drittel Befestigung an dem Gerüst, trotz der Gerüstoberfläche, die auf allen Zellen anhaften. Dies kann nachteilige Auswirkungen auf andere zellbasierten Assays, die die Biokompatibilität und Zellmaterial / Zell-Zell-Verhalten und Wechselwirkungen mit dem Gerüst als mögliche zukünftige medizinische Vorrichtung beurteilen kann. Weitere Einschränkungen der Studie kann die 4 Stunden Zeitpunkt sind - obwohl sie lange genug, um anfängliche Zellaussaat zu gewährleisten (Zellen wurde gezeigt, fest an Substraten anzubringen innerhalb 30 Minuten 13,14,15), kann es sinnvoll sein, investigate späteren Zeitpunkten Bereitstellung von Zellen nicht über einen längeren Zeitrahmen vermehren, da dies sonst neigen die Anfangszellzahl. Reduzieren des Volumens der Medien, in diesem Fall 10 ml, könnte auch der Kontakt zwischen den Zellen und Gerüst zu verbessern und letztlich zu erhöhen Zellanheftung. Zukünftige Studien sollten auch die Lebensfähigkeit der Zellen betrachten, da der Prozess der Zellaussaat können Zellschäden und / oder Zelltod 16 verursachen. Zell-DNA-Assays nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen zu differenzieren, die als solche eine lebend / tot-Assay, beispielsweise das Niveau der Lebensfähigkeit markieren würde. Diese Untersuchung schärft das Bewusstsein der tatsächlichen Anzahl von Zellen, die zum Schafott legen trotz der Aussaat eine bekannte Menge. Für Studien, die in der Start Anzahl der Zellen zu verlassen, ist es sehr wichtig, dass die Forscher genau, wie viele dieser Figur in der Tat auf dem Substrat haften von Interesse zu tun.

Gerüste werden regelmäßig weiterentwickelt und für Biomaterialien und Tissue-Engineering-Anwendungen untersucht. Als solche sind sie allgemein mit Zellen und ihre in vitro-Verhalten über Tests, die Zellproliferation und Zellzahl zu bestimmen, beispielsweise dadurch ausgesät. Für Experimente, wie diese, ist es zwingend erforderlich, dass die anfängliche Zellzahl bekannt ist und Forscher Staat häufig die Seeding-Konzentration in Bezug auf die Anzahl der Zellen pro ml oder cm 2. Dies ist zwar eine gute Praxis, insbesondere für Scale-up-Zwecke, ist es nicht für die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an die Gerüstoberfläche (die auch abhängig von den Klebeeigenschaften der Biomaterialoberfläche 1) haften ausmachen. Dies gilt insbesondere für Gerüste, die nicht die gesamte Basis der Zellkultur-Well-Platte abdecken als Zellen vom Konstrukt fallen könnten und aufgrund der oft statische Natur des Experiments kann nie in Kontakt mit dem Material der inte zurückkommenRuhe. Elektrofasergarne sind ein gutes Beispiel für ein Gerüst, das nicht den Boden der Vertiefung (1A) umfasst. In diesem Fall sollte eine niedrige Bindungs ​​Well-Platten, die nicht oberflächenbehandelt wurden verwendet, um Zellen von der Befestigung an der Plattenoberfläche und somit die Ergebnisse verzerrt jedes gut basierten Assay zu verhindern. Well-Platten sind leicht zur Zellbesiedelung verwendet, auf Gerüsten, aber sie sind nicht die einzige Methode zur Verfügung. Rotary Zellkultursysteme, eine Art Bioreaktor durch den Lebenswissenschaften bei der NASA in den späten 1980er Jahren entwickelt wurde, können auf ähnliche Weise verwendet werden, um Gerüste in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung mit simulierten Mikrogravitation zu impfen. Diese Art der Bioreaktor bleibt eine beliebte Wahl mit Forschern weltweit und wurde in Studien zur Zellsignal 2,3 aufgenommen, Stammzellen und Tissue Engineering 4,5 6,7. Was macht den Dreh Bioreaktor vorzuziehen, Well-Platten ist die Aufrechterhaltungeiner 3D-Umgebung, was dazu beiträgt, differenzierten Zellen Entdifferenzierung vermeiden, wie es oft der Fall, wenn in herkömmlichen 2D-Bedingungen 8 kultiviert. Dieser Aufsatz untersucht verschiedene Techniken zur Aussaat humanen mesenchymalen Stammzellen auf elektro Poly (ε-caprolacton) Fasergarne wie in Bosworth et al., 9, um die anfängliche Anzahl von Zellen Befestigung an dieser Gerüste innerhalb von 4 Stunden-Zeitraum zu maximieren hergestellt. Für 2D-Kultur wurden Fäden sicher in Well-Platten oder maßgeschneiderte Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Mulden gehalten und unter statischen Bedingungen gehalten, oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Für 3D-Kultur wurden Garne und Zellen im Bioreaktor Gefäße 9 UpM gehalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>in-house supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1117271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70013016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture media</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-28010B</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement mix</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-39810</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimyotic mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks (T75)</td>
			<td>Becton Dickinson Ltd</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding 6-well plates</td>
			<td>Costar Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well CellCrowns</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish 50 ml deep</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE troughs</td>
			<td>in-house production</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker plate</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SSM1</td>
			<td>Mini Orbital Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Digital Bio</td>
			<td>DHC-F01</td>
			<td>Disposable C-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>352096, 429901</td>
			<td>15 ml and 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotafix 32 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 ml</td>
			<td>Shield Medicare Ltd</td>
			<td>3039820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>40305, 47310, 40125</td>
			<td>5, 10 and 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td>
			<td>P2 - P1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SLS</td>
			<td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro test tube 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>Assay set-up in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate-reader</td>
			<td>BGM Labtech</td>
			<td>FLUOstar Optima</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %</td>
			<td>TAAB Laboratories</td>
			<td>G002</td>
			<td>Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>999-97-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium stubs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon tabs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold sputter coater</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>S150B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom World</td>
			<td>Phenom Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

Erforschung von Biomaterialien und Tissue Engineering umfasst oft zellbasierten In-vitro-Untersuchungen, die ersten Kenntnisse der Ausgangszellzahl erfordern. Während die Forscher üblicherweise Referenz ihrer Einsaatdichte dies nicht notwendigerweise die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an das betreffende Material anhaften. Dies ist insbesondere für Materialien oder Gerüste, die nicht die Basis des Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. In dieser Studie wird die anfängliche Befestigung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einer bekannten Anzahl an elektrogesponnen Poly (ε-caprolacton) Garn nach 4 h in Kultur angeimpft. Elektrogesponnene Garne wurden in verschiedenen Aufbauten gehalten, einschließlich Bioreaktor Gefäße auf 9 Upm Zellkultureinsätze in geringen Bindungs ​​Well-Platten und Polytetrafluorethylen (PTFE) Gräben von Petrischalen platziert positioniert dreht. Die beiden letzteren wurden entweder statischen Bedingungen auf einer Rüttelplatte ausgesetzt oder aufgestellt (30 bei 37 ° C, 5% CO 2 wurde die Position der ausgesäten Zellen durch Zell-DNA-Assay bestimmt. Gerüste wurden aus ihren Behältern entfernt und in Lysepuffer gelegt. Die Medien-Fraktion wurde entfernt und in ähnlicher Weise zentrifugiert - der Überstand verworfen und Pellet mit Lysispuffer gebrochen. Lyse-Puffer wurden zu jedem Gefäß oder hinzugefügt, so, und abgeschabt, um alle Zellen, die vorhanden sein können, zu befreien. Das Zell-DNA-Test bestimmt den Prozentsatz an Zellen innerhalb des Stützgerüsts vorliegen, Medien und auch Fraktionen. Zellhaftung gering war für alle Versuchsanordnungen, mit größter Anlage (30%) für Garne in Zellkultur-Einsätzen gehalten und Schüttelbewegung unterzogen. Diese Studie sensibilisiert auf die tatsächliche Anzahl von Zellen verbundenen, unabhängig von der genannten Zellansiedlungsdichte Warten.

Die Ergebnisse unterstreichen die Position der Zellen nach 4 Stunden nach der Aussaat für die einzelnen Versuchsaufbau untersucht. 2A zeigt den Prozentsatz an Zellen, die in dieser Zeit zum Schafott Oberfläche angebracht haben. Ein Umwandlungsfaktor von 8,5 pg / Zelle wurde verwendet, um die gemessene DNA-Gehalt in der Zellzahl umzuwandeln und somit den Prozentsatz der Zellen 10. Für alle Aussaat Aufbauten untersucht, ist der Prozentsatz der Zellhaftung relativ gering, mit größten Zellhaftung (30%) für Gerüste in Zellkultur-Einsätzen gehalten und bei 30 Umdrehungen pro Minute (Insert Shaker) erschüttert. Niedrigster Halten (15%) war für Gerüste in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und unter statischen Bedingungen (Statischer Insert) gehalten. Eine große Anzahl von Zellen innerhalb des Medienfraktion (2B) vorhanden waren, vor allem für die Zellkultur-Einsätzen innerhalb niedrige Bindungsplatten (Static Insert) und rotierenden Gefäßen gehalten wobei 50% bis 51%jeweils. Gerüste innerhalb der Rinnen gehalten zeigten eine erhöhte Anzahl von Zellen in dem Halter selbst vorhanden - 48% der Zellen, die für Trough Shaker und 50% für Trough Static. Rasterelektronenmikroskopie erlaubt eine visuelle Beurteilung der Zellaussaat Gerüste (Abbildung 3). Repräsentative Bilder markiert eine begrenzte Anwesenheit von Zellen auf der Faseroberfläche, unabhängig von der Aussaat Set-up. Jedoch eine größere Anzahl von Zellen und Zell Agglomerate auf den Gerüsten in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und mit 30 UpM (Shaker Insert) geschüttelt vorhanden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsanordnungen, in denen Elektrogesponnene Garne innerhalb Besitz; (A) Zellkultur-Einsätze und niedrige Bindungs ​​Well-Platte, (B) Poly (tetrafluorethylen) (PTFE) Trog und Petrischale; und (C) Bioreaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Abbildung 2. Position der Zellen 4 Stunden nach der Aussaat auf PCL Elektrogesponnene Garne mit verschiedenen Seeding Set-ups. (A) Zeigt den Prozentsatz an Zellen, die mit dem PCL-Gerüst angebracht haben (Mittelwert ± Standardabweichung), (B) verdeutlicht die prozentuale Verbreitung des Zellenposition innerhalb der drei Fraktionen - Medien, gut und Gerüst (n = 4, Daten vorgestellt Mittelwerte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Repräsentative Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen für PCL Elektrogesponnene Garne mit humanen mesenchymalen Stammzellen, 4 Stunden nach der Initial Seeding mit unterschiedlichen Versuchsanordnungen. (Alle Bilder auf 1,000x Vergrößerung, Balken = 130 &amp; mgr; m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÎµ-caprolactone Electrospun Yarns at JoVE.com

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

9.6K Aufrufe.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Serie: Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used techniques for the development of in vivo cancer models have considerable limitations. Therefore, in this study, we aim to implement cell sheet technology to develop an in vivo cancer model. Hepatocellular carcinoma (HCC) is successfully developed in nude rats using cell sheets created from HCC cell line cells. The cancer cell sheets are generated through intracellular adhesion and the formation of a stratified structure, controlled by the extracellular matrix. This allows for the HCC sheet transplantation into the liver and the creation of a tumor-bearing animal model within a month. In addition, the role of mesenchymal stem cells (MSC) in the development of this cancer model is investigated. In addition to the HCC cell line sheet, another two cell sheets are created: a sheet of HCC cells and bone marrow MSCs (BMMSCs) and a sheet of HCC cells and umbilical cord MSCs (UCMSCs). Sheets that have a combination of both HCC cells and MSCs are also capable of producing a tumor-bearing animal. However, the addition of MSCs reduces the size of the formed tumor, and this adverse effect on tumor development varies depending on the used MSCs' source. This indicates that a cell sheet made of certain MSC subtypes could be utilized in tumor management and control.

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Here, we present a protocol to develop an in vivo cancer model using cell sheet technology. Such a model could be very useful for the evaluation of anticancer therapeutics.

Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...