Diese Arbeit wurde von einem American Heart Association Promotionsstipendium an JLI und National Institutes of Heath gewähren R01AR056624 unterstützt.

A. einzelnes Polymer Elektrospinnen <ol><li> Vor Erstellung des Elektrospinnen Lösung, um eine 0,5% ige Lösung des Photoinitiators, Irgacure 2959 (I2959), in deionisiertem Wasser durch Lösen bei 37 ° C für mehrere Tage. Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn eine photoreaktive Polymer nicht verwendet wird. </li><li> Kombinieren Sie methacrylierte Hyaluronsäure (Meha, siehe Burdick et al. Zur Synthese), Poly (Ethylenoxid) (PEO, 900 kDa) und I2959 in deionisiertem Wasser, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 2 Gew.% Meha, 3 Gew.% herzustellen PEO und 0,05 wt% I2959. Verwenden Sie einen Wirbel um die Lösung zu mischen, bis es klar ist. Das Polymer Art und Konzentration, sowie das verwendete Lösungsmittel kann bei diesem Schritt je nach gewünschter Gerüst Eigenschaften verändert werden. </li><li> Übertragen Sie die Lösung in eine Spritze und fügen Sie eine 18-Gauge-, 6 Zoll lang, stumpfe Ende needle bis zum Ende. </li><li> Programm eine Spritzenpumpe mit einer Rate von 1,2 ml / h auszuwerfen. Legen Sie die Spritze und Nadel in das Gerät. </li><li> Bringen Sie die geerdete Leitung eines Hochspannungsquelle die Auffangvorrichtung. Zu sammeln zufällig verteilten Fasern eine flache Metallplatte, oder verwenden Sie einen Dorn drehenden bei ~ 10 m / s bis ausgerichteten Fasern zu sammeln. Bringen Sie die positiv geladenen führen, um die Nadel. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des Elektrospinnen Apparat. </li><li> Stellen Sie die Nadel oder Auffangvorrichtung, so dass es eine 15 cm Abstand zwischen den beiden. </li><li> Starten Sie den Fluss auf die Spritzenpumpe. Wenn Flüssigkeit sichtbar an der Spitze der Nadel, an der Stromquelle einschalten und die Spannung bis 22 kV. </li><li> Nach der Sammlung vollständig ist (von einigen Minuten für dünne Folien, um bis zu 24 Stunden für eine dickere Matte), entfernen Sie das Gerüst aus der Sammlung Gerät und speichern Sie es unter Vakuum über Nacht um die vollständige Entfernung des Lösungsmittels zu gewährleisten. </li><li> Visualisieren Sie die Fasermorphologie mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wird eine repräsentative Gerüst in Abbildung 1 für beide ausgerichtet und blockfreien Strukturen dargestellt. </li></ol> Hinweis: Der Probendurchsatz, Entfernung zum Auffangvorrichtung und Spannung sind abhängig von der Polymer-und Lösungsmittel-Kombination und muss für jedes System optimiert werden, in der Regel durch die Beobachtung des Gerüstes Morphologie mit SEM. B. Photovernetzung und Photostrukturierungsverfahren <ol><li> Schneiden Sie 5mm x 5mm Proben aus dem Gerüst Matte. </li><li> Bereiten Sie für die Vernetzung, indem jedes Gerüst auf einer Folie abgedeckt Glasträger, indem die Photomaske direkt auf dem Schafott, Abdecken mit einem sauberen Objektträger aus Glas und Clipping an beiden Enden mit Bindemittel Clips. Hinweis: vier Proben können auf einmal gemacht werden und eine Transparenz ohne ein Muster für die Vernetzung verwendet werden, wenn ein Muster nicht erwünscht ist. </li><li> Purge Gerüst eingerichtet in einer Stickstoff-Kammer. Es ist wichtig, dass das Konstrukt frei von Sauerstoff, die eine Vernetzung hemmen können. </li><li> Legen Gerüst Setup in Stickstoff Kammer unter ~ 10 mW / cm 2 365 nm Licht mit einer Kollimation Adapter für 5 Minuten. Siehe Schema in Abb. 2. </li><li> Nehmen Sie jedes Gerüst und in einem 12-Well-Platte. </li><li> Add 2 mL entionisiertes Wasser in jedes Well, Parafilm die Platte, um die Verdampfung des Wassers und bei 37 ° C für 24 Stunden zu verhindern. Wechseln Sie das Wasser dreimal. </li><li> Visualisieren Sie Porenbildung unter dem Lichtmikroskop (siehe Beispiel in Abbildung 2). Die Gerüste sind jetzt einsatzbereit. </li></ol> Hinweis: Photovernetzung ist nicht notwendig, für viele Arten von Polymeren, aber Photostrukturierungsverfahren nur mit photoreaktiven Polymeren eingesetzt werden. C. Dual-Polymer Elektrospinnen mit Fluorescent Fiber Visualisierung <ol><li> Bereiten Sie eine 5% ige Lösung von PEO (200 kDa) in 90% Ethanol. Es wird bei 700 rpm bei 50 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Elektrospinnen. </li><li> Übertragen Sie die PEO-Lösung mit einer Spritze und fügen DAPI für eine endgültige Konzentration von 10 mg / mL Konzentration in der Elektrospinnen Lösung. Wickeln Sie die Spritze in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. </li><li> Bereiten Sie die gleiche Lösung in Schritt A2 beschrieben, mit Ausnahme auch hinzufügen methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamin B (MeRho, 683,24 g / mol) für eine Endkonzentration von 25 uM in der Elektrospinnen Lösung. Wickeln Sie die Spritze in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. </li><li> Vorsichtig verwenden Tesafilm zu methacrylierte Deckgläser (siehe Khademhosseini et al.) Auf die Oberfläche des Dorns zu sichern. Hinweis: Fasern wird angebunden an methacrylierte Deckgläschen. </li><li> Befestigen Sie das eine Ende eines 5 mm langes Stück Silikonschlauch mit Luer-Lock-Anhänge zu einer der Spritzen und befestigen Sie das andere Ende an eine Nadel. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und setzte die Nadel durch das Loch in der Bauer. Wiederholen Sie mit den anderen Spritze und Bauer auf der gegenüberliegenden Seite des Dorns. Die Bauern übersetzen länge des Dorns und werden verwendet, um eine gleichmäßige Verteilung der beiden Polymeren in der resultierenden Gerüst zu gewährleisten. Siehe Schema in Abbildung 3. </li><li> Passen Sie die Parameter in Abschnitt A entsprechend nach Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitzen auf dem Dorn zentriert sind. Tabelle 1. Dual-Polymer Elektrospinnen Parameter <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Spritze </td><td> Fanner zu Nadelspitze (cm) </td><td> Nadelspitze Dorn (cm) </td><td> Fließrate (ml / hr) </td><td> Angelegten Spannung (kV) </td></tr><tr><td> Meha </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1,2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li> Wenn alles richtig ausgerichtet ist, schalten Sie das Licht an und schalten Sie den Dorn und die Spritzenpumpen. Entfernen Sie die Alufolie aus dem Spritzen. Wenn Flüssigkeit sichtbar an den Spitzen der beiden Nadeln ist, gleichzeitig auf die Netzteile und Stecker wieder in die Farmer. </li><li> Als Sammlung abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung und Dorn und ziehen Sie den Farmer. Entfernen Sie vorsichtig das Deckgläschen und Band mit einer Rasierklinge. </li><li> Visualisieren Sie die Fasern mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für Rhodamin und DAPI ausgestattet. Siehe Beispiel in Abbildung 3. Hinweis: fluoreszierende Fasern sind die meisten klar sehen, wenn elektrogesponnenen für kurze Zeit (&lt;3 Minuten), aber dieser Prozess für einen unbegrenzten Zeitraum verlängert werden kann, um dickere Konstrukte zu schaffen, vor allem ohne den Einsatz der Deckgläser . </li></ol> D. Seeding Cells auf Gerüsten <ol><li> Platzieren Sie jede Deckglas mit elektrogesponnenen Polymer in einer individuellen und einer entsprechend dimensionierten Well-Platte befestigt. Hinweis: zellulären Interaktionen mit den Fasern sind gut sichtbar durch Elektrospinnen auf methacrylierte Deckgläschen. Außerdem können MeRho wieder für Faser-Visualisierung verwendet werden. </li><li> Inkubieren Sie die Gerüste in PBS über Nacht um die vollständige Entfernung des Lösungsmittels und etwaige auslaugbaren Nebenprodukte sicherzustellen. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen. </li><li> Zu sterilisieren die Gerüste, legen Sie sie unter einem Entkeimungslampe in einer Sterilbank für 30 Minuten. Wenn eine vollständige Gerüst wird ausgesät wird, Flip das Gerüst um und legen Sie unter einem Entkeimungslampe für weitere 30 Minuten. </li><li> Führen Sie Standard-Zellkultur und bereiten eine konzentrierte Zellsuspension auf die gewünschte Zelldichte (zB, 6.000 Zellen cm -2). Verwenden Sie beispielsweise eine 100 ml Zellsuspension für eine 22 mm X 22 mm Deckglas. Legen Sie in den Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden Betrag von Zellkulturmedien in jede Vertiefung. Legen Sie die Gerüste wieder in den Inkubator. </li><li> Stain die Zellen mit einem kommerziell erhältlichen Live / Dead-Kit. Hinweis: andere Zelltypen Färbung, wie DAPI (Zellkerne) und fluoreszenzmarkierte Phalloidin (Aktin-Stress-Fasern) angewendet, um die Zellen zu visualisieren. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen und Fasern mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für TRITC und FITC ausgestattet. Siehe Beispiel in Abbildung 4. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Geräte-Setup für blockfreien Gerüst Bildung (oben) und ausgerichtet Gerüst Bildung (unten). Beispiel Rasterelektronenmikroskopie Bilder jeder Art von Gerüst dargestellt. Balken = 5 um. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Strukturierung Methode. Patterns sind, indem eine Fotomaske zwischen der Lichtquelle und Gerüst während Photovernetzung und dann abgewaschen umgesetzte Polymer gebildet. Fotomasken-und SEM-Bild von Gerüsten nach Porenbildung und Gefriertrocknung. Maßstab = 100 um. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /> Abbildung 3 Schematische Darstellung des Multi-Polymer Elektrospinnen Setup und notwendige Prozessparameter sowie eine repräsentative Fluoreszenzbild einer Mischung von zwei Glasfaser Populationen (zB: rot und blau Meha PEO). Die gleichzeitig elektrogesponnenen wurden zu einem Multi-Polymer-Gerüst bilden . Maßstab = 100 um. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">klicken Sie hier</a> , um eine größere versio sehenn der Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein Beispiel Live / Dead Färbung Bild von humanen mesenchymalen Stammzellen und ihre Wechselwirkungen mit der elektrogesponnenen Fasern. Maßstab = 100 um. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

<ol>
	<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications.">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li><li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment.">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li><li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+on+the+Straight+and+Narrow:+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration.">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li><li>Sill, T. J., Von Recum, H. a. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , (2009).</li></ol>

Elektrospinnen wurde verwendet, um faserige Gerüst aus Polymeren herzustellen. Photovernetzbaren Gerüste basieren auf Hyaluronsäure wurden als ein anschauliches Beispiel, wo Belichtung zur Vernetzung benötigt wird. Mit dem Einsatz von reaktiven Makromeren, wie Meha, wurden Kanäle, die zuvor verbesserte zelluläre Verteilung haben gezeigt, in die Gerüste mit der Verwendung einer Maske während Photovernetzung zu Makro-und Mikro-poröse Gerüste Form eingearbeitet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Polymere g...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DAPI</td>
<td> Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 200 kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>17503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 900 kDa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>189456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591-100</td>
<td>Prepare stock solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead Stain Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>Equipment</td>
<td>KD Scientific</td>
<td>KDS100</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Power Source</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gamma High Voltage</td>
<td>ES30P-5W</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Motor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triem Electric Motors, Inc</td>
<td>0132022-15</td>
<td>Must attach to a custom built mandrel</td>
</tr>
<tr>
<td>Tachometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Network Tool Warehouse</td>
<td>ESI-330</td>
<td>Use to monitor mandrel speed</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51135K151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Female Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K293</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Male Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-825-16H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Corning</td>
<td>2875-22</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture

Da der Bereich des Tissue Engineering entwickelt, gibt es eine enorme Nachfrage nach mehr geeigneten Materialien und Verarbeitungstechniken zu produzieren, um die Anforderungen (zB Mechanik und Vaskularität) von mehr komplizierte Organe und Gewebe-Adresse. Elektrospinnen ist eine populäre Technik, um faserige Gerüst, dass die Architektur und die Größe zu skalieren der einheimischen extrazellulären Matrix imitieren zu schaffen. Diese faserigen Gerüste sind auch geeignet als Zellkultursubstraten da die Fasern können verwendet werden, um zelluläre Verhalten direkte, einschließlich Stammzell-Differenzierung (siehe ausführliche Bewertungen von Mauck werden<em&gt; Et al.</em&gt; Und Sill<em&gt; Et al.</em&gt; Für weitere Informationen). In diesem Artikel beschreiben wir die allgemeinen Prozess der Elektrospinnen Polymere und als ein Beispiel, electrospin eine reaktive Hyaluronsäure in der Lage Vernetzung mit Belichtung (siehe Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; Für eine Überprüfung auf photovernetzbaren Materialien). Außerdem stellen wir weitere Verarbeitungsmöglichkeiten wie Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Gerüst Bildung. Photostrukturierungsverfahren kann verwendet werden, um Gerüste mit Kanälen und Multi-Skalen Porosität zu schaffen, um zelluläre Infiltration und Verteilung im Gewebe zu erhöhen. Multi-Polymer-Gerüste sind nützlich, um eine bessere Melodie die Eigenschaften (Mechanik und Abbau) von einem Gerüst, einschließlich maßgeschneiderter Porosität für zelluläre Infiltration. Darüber hinaus können diese Techniken erweitert, um eine breite Palette von Polymeren und reaktiven Makromeren, um komplexe Gerüste, dass die Signale, die für die Entwicklung erfolgreicher Gewebezüchtung Konstrukte bieten schaffen erweitert werden.

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Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.

Serie: Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Forschung

Biologie

Micro-scale Engineering for Cell Biology

Micro-Maßstab Engineering for Cell Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

Interview: Bioreaktoren und Aufgetaucht-Modified 3D-Gerüste für Stammzellforschung

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Engineering zellpermeablen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...