Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the M&#252;ller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Neuronale Zellernte <ol><li> Bewertung durch Mikroskop: <ol><li> Vor Beginn eines Experiments, überprüfen Sie den Status der Kultur mit Hellfeld oder Phasenkontrastmikroskopie. HINWEIS: Während primäre von Dissektionen erhalten Nervengewebe ist prinzipiell gleichermaßen zugänglich zytometrische Analyse 14,28 fließen, beachten Sie bitte, dass der Fokus des Protokolls ist auf Zellen, die aus in vitro neuronale Zellsystemen erhalten. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen 7: <ol><li> Die Schale / Kolben von adhärenten Zellen mit Mg 2+ schonend waschen / Ca 2+ freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (beispielsweise 5 ml für T75-Kolben wurden 3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platte oder 10 ml für 10 cm Schale). HINWEIS: Der PBS im gesamten Protokoll ist Mg 2+ / Ca 2+ frei. <ol><li> Für das Video beispielsweise mit einem T75-Kolben von SH-SY5Y Neuroblastomzellen bei 80% Konfluenz. Übernehmen zusätzliche Waschschritte für den Fall,erhebliche Rückstände ist in der Schale vorhanden. </li><li> Betrachten Sie Waschungen mit Serumalbumin enthaltenden PBS 48, Percoll oder Ficoll 49 Zentrifugation Steigungen und / oder handelsübliche Perlen 50,51. Entfernen von Myelin und andere Lipid oder anderen Verunreinigungen kritisch ist, insbesondere, wenn erwachsene primären Gewebequellen verwendet werden. </li></ol></li><li> Hinzufügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin Austausch an einem geeigneten Volumen, der die gesamte Fläche der Gewebekulturbehälter umfasst. HINWEIS: Sie betrachten Accutase oder andere enzymatische Verdauung Optionen. Dieser entscheidende Schritt kann sich negativ auf Oberflächen Epitop Ausdruck (siehe 7). </li><li> Die Schale / Kolben bei 37 ° C für 2 inkubieren - 5 min (in Abhängigkeit vom Zelltyp), um Zellen zu trennen. Klopfen Sie leicht die Zellkulturgefäß oder bündig mit einer serologischen Pipette, um die Zellen zu entfernen. Vermeiden Sie zu der Verdauung (da dies zu Zellverlust und Gerinnung bei späteren Schritten verursachen). </li><li> Quench das Trypsin Ersatz durch Zugabe des doppelten Volumens von Strömungspuffer (2% FBS in PBS) und sammle die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Verreiben Sie vorsichtig die Zellsuspension mit Hilfe einer Mikroliterpipette (100 - 1000 ul) oder ein 5 ml serologische Pipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 220 g für 5 min bei 25 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren Verlassen des Pellet hinter. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Strömungspuffer in Abhängigkeit von der Größe des Pellets (beispielsweise für einen konfluenten T75-Flasche von SH-SY5Y-Zellen die typische Ausbeute von mindestens 10 x 10 6 Zellen, wobei die Zellen werden in 5 ml-Fluß-Puffer) resuspendiert. HINWEIS: Wenn größere Brocken oder Gerinnungseingehalten werden, durch ein 30-Filter - um Maschenweite 100. </li></ol></li><li> Zellzählung 52: <ol><li> Übertragen einer kleinen Aliquot der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnt in einem festen Verhältnis in einem Volumen von trypan blau oder eine Alternative Lebensfähigkeit Farbstoff vor der Übertragung auf einem Hämozytometer oder automatisierte Zellzählung System. </li><li> Verdünne die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml durch Zugabe des geeigneten Strömungsvolumen Puffer oder PBS mit 0,1% BSA (wenn mit CFSE Markierungsverfahrens). HINWEIS: Propidiumiodid, 7-Aminoactinomycin, Annexin V und im Handel erhältliche fixierbar Lebensfähigkeit Assay-Kits stellen alternative Möglichkeiten, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu beurteilen. Auch Apoptose-Assays unter Verwendung von Caspase-3-Fluoreszenz wie zuvor beschrieben 53 verwendet werden. Fluorescent Kanäle durch diese Reagenzien, die die Optionen für den nachfolgenden Schritten begrenzen können, wenn in allen Proben enthalten &quot;besetzt&quot; werden. </li></ol></li></ol> 2. Intrazelluläre Farbstoffmarkierung Verwendung CFSE (Figur 3) <ol><li> Verdünne die CFSE zu einer gewünschten Ausgangskonzentration, die leicht verwendet werden kann. HINWEIS: Für diese Experimente eine Stammkonzentration von0,01 mm verwendet. Bestimmen Sie die optimale Arbeitskonzentration von CFSE empirisch. </li><li> Zugabe von 10 ul 0,01 mM CFSE-Lösung pro ml Zellen (Abschnitt 1.3.2, der Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in PBS + 0,1% BSA) für eine Endkonzentration von 0,1 uM. Vortexen gut mischen. HINWEIS: hier verwendeten CFSE Konzentrationen etwa zehnfach geringer als die, die üblicherweise in Proliferationstests angewendet, damit Zelltoxizität des Farbstoffs ist minimal. Wir haben nicht zu beobachten negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Inkubation für 5 min bei RT unter konstantem Schütteln (200 rpm). Vor Licht schützen. </li><li> Quenche die Farbstoff durch Zugabe von 5 Volumina Flusspuffer zu den Rohren. Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter. Resuspendieren der Zellen mit 5 Volumina Flusspuffer. </li><li> Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen /<html> ml. </li><li> Fügen Sie die gleiche Anzahl von ungefärbten Zellen von Interesse für die Zellsuspension gefärbt. Fahren Sie mit der Oberfläche Antigen-Färbung Protokoll (Abschnitt 3). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. Nachweis der Differenz CD-Oberflächen-Antigen-Expression zwischen zwei Zelllinien mittels CFSE Farbstoffmarkierung. SH-SY5Y Neuroblastomzellen sind bereits beschriftet mit CFSE zur späteren Identifizierung im Vergleich zum unmarkierten BJ Fibroblasten. Co-Färbung der Mischprobe (rechte Felder) mit Oberflächenmarker CD24 oder CD54 (beide konjugiert an APC) zeigt, dass Zelllinien sind leicht zu unterscheiden durch den CFSE-Färbung (Pfeile = SH-SY5Y, Pfeilspitzen = BJ Fibroblasten). Die Mehrheit der SH-SY5Y-Zellen exprimieren CD24 nicht aber CD54 (ICAM-1). Im Gegensatz dazu BJ Fibroblasten (CFSE-negativ) sind positiv für CD54, aber weitgehend negativ für CD24.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 3. Zelloberflächenfärbung <ol><li> Beschriften Sie die Röhrchen mit Proben und kritische Kontrollgruppe (siehe Tabelle 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rohr-Nr. </td><td> Beispielnamen </td><td> Antigen-Fluorophor </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ungefärbte Zellen </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Einzelbunt </td><td> CD24-APC </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Einzelbunt </td><td> TuJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Doppelbunt </td><td> CD24-APC </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TuJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Einzelbunt</td><td> Sekundäre nur: Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 L ist von Rohren in einer typischen Durchflusszytometrie Experiment einbezogen werden. Die Tabelle zeigt nur eine minimale Anzahl von Probenröhrchen für eine in diesem Video-Artikel beschriebenen Co-Färbung Experiment erforderlich. Ein ideales Experiment muss alle erforderlichen Kontrollen (negativ, positiv sowie eine Entschädigung Kontrollen) für eine genaue Interpretation der erzielten Ergebnisse umfassen. <ol start="2"><li> 100 l Zellsuspension (von Abschnitt 2.7 oder 1.3.2) zu jeder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Achten Sie darauf, ein Minimum von 0,1 x 10 6 Zellen pro 100 ul der Zellsuspension vorhanden sind. </li><li> Hinzufügen Fluorophor konjugiert Antikörper an die Probe bei einer geeigneten Verdünnung. HINWEIS: Bestimmen Sie die Arbeitslösung für jeden Antikörper vor dem Experiment. Siehe Tabelle 2 für eine Liste of neuronalen Oberflächenantigene. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antigen </td><td> Zelltyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Gliazellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Neurale Stammzellen und Gliazellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Neuralleiste Stammzellen </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Gliazellen </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Dopaminergen Vorläufer </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Neurale Stammzellen (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Gliazellen </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Gliazellen </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Auswahl der neuronalen Oberflächenantigene. Diese Tabelle enthält eine Liste von Oberflächenepitopen gefunden, die von verschiedenen neuronalen Zelltypen exprimiert wird, um die wachsende Gruppe von Oberflächenantigenen verwendet werden, um die neuronale Linie kenn exemplifizieren werden. Man beachte, dass diese Auswahl ist bei weitem nicht vollständig ist und die meisten von diesen Markierungen werden auch durch eine Reihe von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen exprimiert wird. Folglich werden Kombinationen mehrerer Marker erforderlich, um besser zu definieren und zu isolieren, die die angegebenen neuronalen Subsets werden. <ol start = &quot;4&quot;&gt; <li> Inkubieren für 30 min auf einem Horizontalschüttler (200 rpm) in der Dunkelheit. </li><li> Flusspuffer Wasch <ol><li> 1 ml der Pufferströmung an den Rohren. Zentrifuge bei 380 × g für 4 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer auf ein Endvolumen von 100 ul. </li><li> Verwenden Probe für die Durchflusszytometrie. Alternativ fahren Sie mit Abschnitt 4 und 5. HINWEIS: Wenn Zellen sortiert werden und wieder in Kultur nach der FACS sind (dh lebensfähige Zellsuspension ohne Fixierung oder Permeabilisierung) gelten aseptische Technik bei der Ernte, Färbung und Analyseschritte. </li></ol> 4. Fixierung und Permeabilisierung 38 <ol><li> Fixierung mit Paraformaldehyd (PFA): <ol><li> Bereiten Fixierungspuffer, der 2% PFA in PBS. <br/&gt; Anmerkung: PFA ist schädlich für Mensch und Umwelt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und entsorgen Abfälle in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften. </li><li> Gib 500 ul Fixierungspuffer auf 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln. </li></ol></li><li> PBS-Wasch: <ol><li> 1 ml PBS, um das Rohr. Zentrifuge bei 380 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen / Dekantieren des Überstandes verlassen etwa 100 ul in die Röhre. </li></ol></li><li> Permeabilisierung mit Tween-20: <ol><li> Bereiten Permeabilisierung Puffer mit 0,7% Tween-20 in PBS. </li><li> Gib 500 ul Permeabilisierung Puffer auf 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln. </li></ol></li><li> Mit PBS (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben) Waschen Sie die Zellen einmal und Überstand aus dem Röhrchen Completely, so dass nur das Pellet hinter. </li></ol> 5. Intrazelluläre Antigen Staining 38 (Figur 4) <ol><li> Herstellung von primären Antikörperlösungen: <ol><li> Verdünne die primären Antikörper in Verdünnungspuffer, der 1% Rinderserumalbumin, 10% Serum (zB normale Esel oder Ziegenserum) und 0,5% Tween-20 in PBS. HINWEIS: Wählen Sie das Serum je nach Art der Sekundärantikörper wurden angehoben, um verwendet werden. </li><li> Alternativ verwenden Zenon Fluorescein Markierung des primären Antikörpers nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Herstellung von 1 &amp; mgr; g des primären Antikörpers in PBS bei einer geeigneten Verdünnung (Gesamtvolumen ≤ 20 ul). </li><li> Mit 5 ul Zenon Fluorescein IgG Markierungsreagenz (Komponente A) zu der Antikörperlösung. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT. </li><li> Mit 5 ul Zenon Blockierungsreagenz (Komponente B) zu dem Reaktionsgemisch. </li><li> Bebrütendie Mischung für 5 min bei RT. Anwenden des Antikörpers an die Probe innerhalb von 30 min. </li></ol></li></ol></li><li> Primäre Antikörper-Färbung: <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l des primären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen. </li><li> Alternativ hinzuzufügen Zenon Fluorescein markierten Antikörper zu der Zellsuspension bei der geeigneten Verdünnung. </li><li> Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min Inkubieren auf einem Schüttler (200 rpm), vor Licht geschützt. Mit PBS Waschen Sie die Zellen einmal (wie beschrieben in Abschnitt 4.2) und Überstand aus den Röhrchen vollständig, so dass nur das Pellet hinter. </li></ol></li><li> Sekundäre Antikörper-Färbung (nicht für den Zenon Fluorescein markierten Antikörpern erforderlich): <ol><li> Verdünne die sekundären Antikörper in PBS in einer geeigneten Konzentration. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l des sekundären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen. Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min auf einem Schüttler (200 rpm) im Dunkeln inkubiert. </li></ol></li><li> Zweimal mit PBS waschen Sie die Proben (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben). </li><li> Einmal mit Fließpuffer waschen (siehe Abschnitt 3.5). </li><li> Wieder die Zellen in ungefähr 150 &amp; mgr; l Fließpuffer und von der Strömungs analysieren Cytometer. </li></ol><img alt="4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4. Co-Färbung der Oberfläche und intrazellulären Proteinen. Durchflusszytometrie Daten veranschaulicht einen Vergleich zwischen primären + Sekundärantikörperbasis gegen Zenon Fluorescein basierende intrazelluläre Färbung in Kombination mit Oberflächenfärbung. Exclusive Positivität auf der y-Achse (obere linke Quadrant) und der x-Achse (untere rechte Quadrant) zeigt Zellen, die für MAP2 und CD24, angefärbt. Nach Co-Färbung kann geteilt MAP2 und CD24 Expression in der oberen rechten Quadranten (rechte Bilder) zu sehen. Vergleich mitAlexa Fluor 488. (Oben; AF488) gegenüber Zenon Fluorescein (unten) für MAP2-Markierungsausbeuten ähnliche Ergebnisse <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 6. Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Zuführen durchflusszytometrische Analyse unmittelbar nach der Beendigung des Färbeprotokoll mit einem Durchflusszytometer mit entsprechenden Filtern zur Signalerkennung. Verwenden 488 nm blau und rot 640 nm Laser mit FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) und FL-4 (675/25) Bandpassfiltern. </li><li> Up Haupttore auf der Grundlage der nach vorn und Seitenstreuung ohne Schmutz und abgestorbene Zellen ein. </li><li> Stellen Fluoreszenz Tore für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen ≤0.5% bezogen auf den nicht markierten Proben und die Entschädigung für spektrale Überlappung mit einzelnen Bunt Kontrollen. </li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest.

Die hier vorgestellte Protokoll ist für neuronale Zellkulturen aus menschlichen Stammzellen gegründet, kann aber auch für andere neurale Zellquellen angewendet werden, einschließlich primärer Gewebe oder neuronalen Zelllinien. Neben embryonalen Quellen kann neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen aus den neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns 27 extrahiert werden. Außerdem Durchflusszytometrie und FACS kann genutzt werden, um zu quantifizieren, zu analysieren und zu isolieren verschiedenen Zellpopula...

Durchflusszytometrie wurde ausgiebig in der Immunologie, Hämatologie und Onkologie ausgenutzt, um Zellpopulationen über Eigenstreueigenschaften, Zelloberflächen-Antigen-Expression und andere Fluoreszenzparameter 1-3 definieren. Unsere Erkenntnisse über Blutslinie Entwicklung und Krankheit sind das Ergebnis in erheblichem Maße von der kontinuierlichen Verfeinerung dieser Methode nach ihrer erstmaligen Anwendung 4,5. Bewusstsein für die quantitative und die allgemeine analytische Potenzial der Durchflusszytometrie wurde vor kurzem aufgefordert seine weitere Verbreitung in der Stammzellforschung und können ähnlich tiefgreifende Fortschritte in einem kürzeren Zeitrahmen 6 zu ermöglichen. Allerdings ist die Anwendung der Durchflusszytometrie gezielt zu analysieren und zu isolieren, neuronale Populationen solange anspruchs wahrgenommen. Im Gegensatz zu den blutbildenden Zellen, die natürlicherweise in Suspension vorhanden sind, werden neuronalen Zelltypen in der Regel durch zu komplexe Quellen, die Glia und verschiedene o umfassen können geerntetther umgebenden Zellen sowie ein dichtes Netz von Prozesstragenden Neuronen. Folglich hat noch Neurobiologie, um die Vielseitigkeit der Durchflusszytometrie auf seine vollständige Potential im täglichen Forschungsroutinen implementieren. Jedoch solange eine tragfähige Einzelzellsuspension erzeugt werden können (und Protokollen entwickelt worden und zu diesem Zweck optimiert 7), Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann als wertvoller Bestandteil des analytischen Repertoire der Neurobiologie werden 8-11. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Abbildung 1. Prinzip der Durchflusszytometrie und Komponenten von einem Durchflusszytometer Durchflusszytometer umfassen drei Hauptsysteme: Fluidtechnik, Optik und Elektronik. Eine stromlinienförmige Strömung der Zellen in Suspension wird durch die Hülle flui erreicht (von primärem Gewebe oder in vitro-Kultur hergestellt)d mittels hydrodynamischer Fokussierung, die Einschränkung der Probe zu seiner Mittelkern. Die optischen Teile sind von Lasern, die den Strom von Zellen und optische Filter, die das Signal an den entsprechenden Detektoren lenken beleuchten zusammensetzt. Die festgestellt werden, um elektronische Signale, anschließend von einem Computer verarbeitet und auf einem Monitor für die Datenanalyse und Gating visualisiert Lichtsignale umgewandelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Benutzer von durchflusszytometrischen Methoden profitieren von mindestens einem grundlegenden Verständnis der zugrunde liegenden Fundamentaldaten einschließlich Bausteine ​​eines Zytometer (für einen Überblick siehe 12,13; siehe auch Abbildung 1). Ein Laserstrahl schneidet mit einem hydrodynamisch fokussiert fluidischen Strom, der die Zellen in Suspension, die wiederum durch den Laserstrahl in &#39;Datei&#39; eine nach der anderen vorbei enthält. Die interceptiauf einer Zelle (oder einer anderen Partikel, in diesem Fall) mit den Laser-Ergebnisse bei der Streuung von Licht, das von diesem Abfragepunkt. Streulicht kann in Weiterführung der Laserrichtung (Vorwärtsstreuung, wobei die Größe der Teilchen verbunden ist), als auch senkrecht zu seiner Verschieberichtung detektiert werden (side scatter; Reflektieren des granulosity der Partikel / Zelle). Diese zuvor genannten Streueigenschaften erfordern keine spezielle Kennzeichnung, weshalb ein unmarkierter Probe (oder auch Zelltrümmer, Luftblasen, etc.) ein Signal (event) auf der bivariate Vorwärtsstreuung im Vergleich zu Seitenstreudiagramm üblicherweise zur ersten Gating verwendet zu generieren. Unter Verwendung der entsprechenden Laser und die spezifisch für die entsprechende Anregungs- und Emissionsspektren Filter kann eine Zelle für seine Positivität, Intensität oder Abwesenheit von Fluoreszenzmarkern analysiert werden. Die Mehrheit der Durchflusszytometrie-Anwendungen haben sich auf die Charakterisierung über Zelloberflächenantigene gerichtet. Im Gegensatz zu den hämatopoetischen LineagE hat die neuronalen Linie nach Oberflächen Epitop Expressionsmuster 5 blieb weniger ausführlich definiert. Ein Vorteil der Nutzung von Oberflächenantigenen ist, dass lebende Zellen unterzogen, um das Sortieren Paradigmen, wie FACS-Zelle sein. Im Gegensatz dazu intrazelluläres Antigen-Färbung erfordert Fixierung und Permeabilisierung Schritte, um die Epitop-Antikörper-Wechselwirkung vermitteln, ausschließt nachgelagerten Anwendungen, die lebensfähige Zellen erfordern. Der Hinweis, derartige Ansätze noch für zahlreiche quantitative Assays 14 sowie Downstream-Analysen von RNA und Protein-Expression 15 ermöglichen. Hämatologie, Immunologie und Onkologie haben oft zusammen verwendet mehr als ein Dutzend Marker für bestimmte Subpopulationen 16 zu definieren. Darüber hinaus können Massen Zytometrie oder CyTOF jetzt zur Analyse von bis zu 30 Parameter gleichzeitig 17,18 werden. Für neurale Stammzellen Anwendungen sowie Primärkulturen 14,19,20 die Heterogenität von Zellenvitro ist ein häufiges Phänomen 21-23. Die Zellen, die nicht die Zielgruppe von Interesse verkörpern eine potentiell verwirrenden Faktor für experimentelle Auslesen 24,25. Günstig sind die verschiedenen zellulären innerhalb einer heterogenen Zellsuspension vorliegenden Teilmengen tragen distinct (bekannt oder noch zu entschlüsseln) Antigen-Expressionsprofile, die verwendet werden können, um diese verschiedenen Populationen zu definieren. Durchflusszytometrie kann daher eine entscheidende Rolle bei der Lösung von zellulärer Heterogenität und damit zu erleichtern biomedizinische Anwendungen (in vitro-Assays, Zelltherapie) und optimieren quantitative Auslesen durch die Konzentration auf die wichtigsten Teilmenge 24,26. Verschiedene Oberflächenantigenkombinationen wurden in den letzten Jahren erkannt worden, die Quantifizierung und Isolierung von bestimmten neuronalen Zelltypen ermöglichen. Dies beinhaltet CD133 zur Anreicherung von neuralen Stammzellen 27, eine Kombination aus den CD15 / CD24 / CD29-Oberflächenantigene für die Isolierung von NSC, Differenzierungten Neurons und Neuralleistenzellen 28 oder CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 auf neuronale und gliale Teilmengen 25, unter anderen Signaturen 29,30 isolieren. Jenseits Neuronen, Glia Marker umfassen A2B5 31, CD44 25, NG2 32 und GLAST 33. Eine aktuelle Publikation hat die Mittelhirn Bodenplatte Vorläufer Marker CORIN 34,35 für dopaminerge Vorstufen in Parkinson Zelltransplantation bereichern genutzt Paradigmen 36. CD-Moleküle sind nicht nur Marker, sondern funktionell relevante Mediatoren von Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Fähigkeit einer Zelle, auf Hinweise von extrazellulären Matrixmolekülen reagieren und Wachstumsfaktoren 37. Eine Strategie, die weitere Verbesserung der Arsenal von kombinatorischen CD-Antigene zu charakterisieren neuronalen Linie Entwicklung ist es, bekannte intrazelluläre Marker verwenden, um für einen bestimmten Zelltyp von Interesse zu screenen und zu definieren CD Antigenkombinationen. Vor kurzem haben wir ausgenutzt solchen Ansatz und identifiziert CD49f - / CD200 hochkombiExpressionsMuster als neuer Ansatz zur Anreicherung von neuronalen Teilmengen von neural differenzierten induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkultursystemen 38. Hier sind und die letztere Protokoll (und optionalen Varianten davon), in der Oberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung gleichzeitig zur Definition neuronaler Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden diskutieren wir. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Abbildung 2: Flussdiagramm des Versuchsprotokoll-Optionen. Die Figur zeigt eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte im Protokoll beteiligt. Optionale Schritte (CFSE Farbstoff oder intrazelluläres Antigen Kennzeichnung) sind je nach hellgrau-Boxen angezeigt. Nach der Ernte wird es notwendig, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl von neuronalen Zellsuspensionen vor der Zelloberflächenfärbung beurteilt. Positive wiesowie negative Kontrollen müssen zusätzlich zu den Proben von Interesse sein sollte. Die Proben können durch Durchflusszytometrie analysiert und / oder in Zellsortierung Paradigmen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Während wir zuvor verwendeten primären Antikörper in Kombination mit sekundären Antikörper für die intrazelluläre Färbung 38 führen wir nun nicht kovalente Markierung des primären Antikörpers durch Fluoreszenz-Fab-Fragmente (Zenon Kennzeichnung) als geringfügige Veränderung, wodurch die Schritte der Bearbeitung der Zellen 39 verringert wird. Außerdem ist als weiteres Beispiel für das Protokoll der Vielseitigkeit, nutzen wir ein optional Kennzeichnung einer Versuchsmenge von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) vor der Oberflächenantigen-Färbung. Solche CFSE vorge Kennzeichnung ermöglicht die sofortige direkten Vergleich zweier Zelllinien oder experimentellen Bedingungen (Vs CFSE-markierten. unmarkiert) innerhalb eines einzelnen Probenröhrchen, die Verringerung Varianz oder feine Unterschiede in der Inkubationszeit und Speichern Antikörper. CFSE ist ein etablierter Fluoreszenz-Farbstoff, der üblicherweise für Zellverfolgung 40 verwendet wird, bei der Proliferation 41,42 und Strichcodes Experimenten 43,44. Schließlich, während eigentliche Sortierschritte (FACS, immunomagnetischen Zelltrennung oder Immunopanning) sind nicht Teil des Protokolls im Prinzip die hier beschriebenen Ernte und Kennzeichnungsverfahren liefern zwar Proben, ausgesetzt sind, können an die Oberfläche Antigen oder die intrazelluläre Markierung basierte Sortieranwendungen werden 15 25,28. Mit diesem Artikel wollen wir: Zusammenfassend eine tragfähige Oberflächenantigen Färbeprotokoll 25,28 fassen ein Protokoll zum Nachweis von intrazellulären Ziele sowie kombinierte Oberflächen- und intrazelluläres Antigen Analyse 38, präsentieren eine intrazelluläre Farbstoff CFSE Markierungsschritt 41,45 als experimentelle Option für comvergleichende Analysen von neuronalen Zellpopulationen, und fassen Ansätze zur zytometrische Analyse (geeignete Kontrollen 13,46, Gating-Strategie und Datendarstellung 47) fließen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">11330057</td>
			<td style="width:149px;">www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS without Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MEM Non-essential amino acids (100 x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335.3</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>PAA Laboratories, Coelbe</td>
			<td>K41-001</td>
			<td>www.gelifesciences.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tween-20 Detergent</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>655205</td>
			<td>www.merckmillipore.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-84</td>
			<td>www.ebioscience.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMSO</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1584</td>
			<td>www.applichem.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bottle top filters express plus 0.22 &#181;m, 250 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>www.millipore.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 25)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156367</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 75)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156499</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipet, glass (150 mm)</td>
			<td>STEIN Labortechnik, Remchingen</td>
			<td>S03710150</td>
			<td>www.stein-labortechnik.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (0.1-10 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4125</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4126</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4129</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 5 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4051</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 10 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4101</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 25 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (0.5 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,699</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (2.0 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,500</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0247-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0549-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">Neuronal Class III &#946;-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-435P</td>
			<td>www.covance.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>www.lifetechnologies.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Zenon&#174; Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z-25342</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neubauer-Improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0640010</td>
			<td>www.marienfeld-superior.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td>www.scientificindustries.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.001</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td align="right">653118</td>
			<td>www.bdbiosciences.com/instruments/accuri</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PSPIN-24R</td>
			<td>www.peqlab.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Orbital shaker, Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td>www.heidolph-instruments.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>4480-50</td>
			<td>www.hettichlab.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class II Biological safety cabinet Safe 2020</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026640</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 Incubator, Heracell 240i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">51026331</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vacuum system, Vacusafe comfort</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td align="right">158320</td>
			<td>www.integra-biosciences.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microscope, Axiovert 40 CFL</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td align="right">451212</td>
			<td>www.zeiss.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet controller, accu-jet pro</td>
			<td>Brand</td>
			<td align="right">26303</td>
			<td>www.brand.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144563</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt vielseitige experimentelle Ansätze (Abbildung 2). In seiner kürzesten Ausführung (Schritte 1, 3 und 6), kann es als eine Führung für einfache Färbung von Oberflächenantigenen ist. In seiner komplexeren Form kann eine Reihe von Co-Kennzeichnung Paradigmen mit einer Reihe von intrazellulären Antigenen (optional Schritte 2 und / oder 4 bis 5) fortgesetzt. Darüber hinaus ist ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types at JoVE.com

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

51.8K Aufrufe.  University of Freiburg. We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Serie: Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...