Wir danken Dr. Magdalena Götz für ihre Eingabe während der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken Dr. Marius Wernig (Stanford University) für die großzügige Bereitstellung von uns mit der Sox2 kodierenden Sequenz. Wir sind auch sehr dankbar, dass Dr. Alexandra Lepier für die Virusproduktion. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) und dem BMBF (01GN1009A) an BB, und dem Bayerischen Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst zu MK und BBCS erhielt Mittel aus dem binationalen SYSTHER unterstützten INREMOS Virtuelle Institute (Deutsch und Slowenisch Bundesministerien für Bildung und Forschung) und der DFG (SFB 824).

1. Isolierung und Kultivierung von adulten menschlichen Gehirn-Zellen Experimente mit menschlichem Gewebe sollte in Übereinstimmung mit allen relevanten staatlichen und institutionellen Regelungen bezüglich der Verwendung von Menschenmaterial zu Forschungszwecken durchgeführt werden. Die vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der LMU München und eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten entwickelt. Dieses Protokoll der Vorbereitung Kulturen der erwachsenen Menschen Hirnrinde wurde mit Proben von Patienten beider Geschlechter leidet Temporallappen-Epilepsie oder andere tiefsitzende nicht-traumatische, nicht-malignen Läsionen etabliert. Das aus dem Operationssaal ausschließlich der Zugangskanal zum Gehirn Läsion umfasste erhalten und damit Gewebe gilt als gesund. Die Altersspanne der Patienten betrug 19 bis 70 Jahren. <ol><li> Vorbereitung Wachstumsmedium durch Zugabe hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum(FCS) zu DMEM mit hohem Glucose Glutamax, um eine Endkonzentration von 20% FCS zu erhalten. 5 ml Penicillin / Streptomycin, auf insgesamt 500 ml Wachstumsmedium. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte erfordern sterile Kulturbedingungen in einem geeigneten Steril. </li><li> Halten erwachsenen menschlichen Gehirn-Biopsie aus dem Operationsraum in Hanks &#39;ausgeglichener Salzlösung mit CaCl 2 und MgCl 2 (HBSS) Medium mit HEPES (10 mM Endkonzentration) auf Eis bis zur Verarbeitung erhalten. Startet die Bearbeitung so schnell wie möglich. </li><li> Um die Dissoziation in Einzelzellen beginnen, das Gewebe übertragen in eine 65 mm Petrischale und Hackfleisch in kleine Stücke mit Hilfe von zwei sterilen Einweg-Skalpelle. Für die enzymatische Verdauung verwendet TrypLE 3-6 ml in einem 15 ml konischen Röhrchen und Inkubation für 15-30 Minuten bei 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> 1 Volumen der vorgewärmten Nährmedium, um die Dissoziation zu ermöglichen und sanft verreiben der Lösung, die Gewebestücke auf und ab, indem zuerst5 ml Einwegpipette, gefolgt durch die Verwendung einer Glaspasteurpipette bis zur Homogenisierung der Zellsuspension. Typischerweise einige restliche Gewebestücke, die meist aus der weißen Substanz, in Suspension bleiben. </li><li> Spin-down bei 157 × g für 5 min und das Pellet in der entsprechenden Menge an Wachstumsmedium (10 ml pro unbeschichtete T75-Kulturkolben). Verwenden Sie eine T75 Kulturflasche für eine Biopsie von 5-10 mm Durchmesser in Größe und extrapolieren diese bei größeren Proben. </li><li> Platzieren Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums alle 3-4 Tage, bis die Zellen Konfluenz erreicht haben. Dies dauert in der Regel bis zu zwei Wochen (als Durchgang 0 [P0] bezeichnet). </li></ol> 2. In-vitro-Expansion und Charakterisierung von Adult Human Brain Cells <ol><li> In-vitro-Expansion: <ol><li> Absaugen Kulturmedium und Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gehalten bei Raum temperatur, vor Zugabe von 3 ml TrypLE. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min, bis die meisten Zellen abgelöst. Klopfen Sie die Flaschen, um das Anheben der Zellen zu erleichtern; nach Zugabe von 3 Volumen Wachstumsmedium, übertragen Sie die Zellen in eine 15 ml konischen Röhrchen und Spin bei 157 xg für 5 min nach unten und die Zellen resuspendieren in der entsprechenden Menge des Wachstumsmediums. </li><li> Passage der Zellen in einem Verhältnis von 1:3 für optimale Ausbeute zu neuen T75-Zellkulturflaschen. Hinweis: Wir haben diese Zellen bis P5 agiert, ohne irgendwelche Anzeichen von reduzierten Umprogrammierung Effizienz. Während an P0 die Kultur enthält einen erheblichen Anteil der Endothelzellen (wie von CD34-Expression zu beurteilen), in den nachfolgenden Passagen ihre Zahl vernachlässigbar. </li></ol></li><li> Charakterisierung von adulten menschlichen Gehirn Kulturen: <ol><li> Immunocytochemistry: <ol><li> Zur Charakterisierung der Zellen, Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frisches Wachstums medium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> Für immunzytochemische Analyse der kultivierten menschlichen Gehirnzellen entfernen Sie das Medium und waschen 3x mit 1 ml PBS. </li><li> Fix Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen der Glasdeckgläschen in eine geeignete Färbung befeuchteten Kammer und der Block mit 80 ul PBS, enthaltend 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen Primärantikörper in derselben Lösung verdünnt (Verdünnungsfaktoren siehe Tabelle spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Ein wesentlicher aber unterschiedlichem Anteil der Zellen in diesem Stadium der Kultivierung sind immunreaktiv für Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) cluster of differentiation 146 (CD146), NG2 Chondroitinsulfat Proteoglycan und Glattmuskelaktin (SMA), dh charakteristische Marker der Mikrogefäß-assoziierten Perizyten. Nur eine Minderheit (&lt;1%) drücken die Astroglia-Marker saure Gliafaserprotein (GFAP) und S100β. Außerdem in dieser Phase die Kultur sollte frei von jeglichen Zellen, die den neuronalen Marker βIII-Tubulin exprimieren. Verwenden Sie mehrere primäre Antikörper-Kombinationen für die Co-Kennzeichnung von verschiedenen Markern. Eine weitere Bestätigung der Expression von Gliazellen, neuronale, Endothelzellen und Perizyten Marker können durch reverse Transkription und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (in diesem Protokoll beschrieben) erhalten werden. </li><li> Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche dreimal mit 1 ml PBS hinzugefügt und die entsprechenden Sekundärantikörper (in den geeigneten Verdünnungen) in die Farblösung und Inkubation 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Falls erforderlich, vor der Montage umfassen Färbung mit DAPI für 5 min bei RaumTemperatur. </li><li> Verwenden Antifading Montagemedium und analysieren die Deckgläser mit einem Epifluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop. </li></ol></li><li> Durchflusszytometrie: <ol><li> Für die Analyse der Oberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie, wachsen Zellen bis zur Konfluenz in T25-oder T75 unbeschichteten Zellkulturflaschen. </li><li> Trennen von Zellen mithilfe TrypLE wie vorher und resuspendieren in Farblösung, bestehend aus PBS + 0,5% BSA beschrieben. Per Farbreaktion, resuspendieren 100.000-200.000 Zellen in 100 ul Farblösung. Bereiten Einzel Färbereaktionen pro Antikörper verwendet (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, Isotypenkontrolle jeweiligen Antikörper). </li><li> Hinzufügen Fluorochrom-konjugierten Antikörper zu jeder Färbelösung (siehe Tabelle für Verdünnungen spezifischer Reagenzien und Ausrüstung) direkt in der Zellsuspension und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln. </li><li> Mit 500 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal und Spin-down zwischen den einzelnenWaschschritt bei 157 × g für 5 min. </li><li> Zellpellet in 0,5-1 ml Färbelösung und Übertragungszellen über einen Zellenfilter (70 um) FACS-Röhrchen. Schützen Sie die Probe vor Lichteinwirkung. </li><li> Vortex Proben vor, indem sie in der FACS-Gerät. </li><li> Um die lebenden Zellen zu analysieren und verstehen Schutt und Zellaggregate, Tor für FSC und SSC-A-A. Handy Duolen sind speziell von FSC-A-und FSC-W verknüpft. Um die richtigen Gating-Bedingungen für die Zelloberflächenmarker setzen Sie die Tore mit Isotyp-Antikörper-Kontrolle an die jeweilige Fluorochrom konjugiert zu bestimmen. Dann bestimmen den Anteil der Antikörper-gebundenen Zellen. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Bereicherung Perizyten abgeleiteten Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung <ol><li> Reinige den pericyte Zellpopulation (in Wachstumsmedium resuspendiert) vor Übertragung durch FACS-Sortierung mit einer 70 um Düse. Verwenden CD34-APC in Kombination mit CD140b-PE und CD146-FITC für Perizyten auswählen. Sortieren für CD34-negative, CD140b-und CD146-positiven Zellen. </li><li> Sammeln der sortierten Zellen in Wachstumsmedium und der Platte auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glasdeckgläschen in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2. </li><li> 48 h nach der Sortierung ersetzen das Medium mit frischem Wachstumsmedium und führen Übertragung in Protokoll 4 beschrieben. </li></ol> 4. Retrovirale Transduktion von Perizyten-abgeleiteten Zellen und Reprogrammierung in induzierte Neurone Hinweis: Lesen Sie lokale Richtlinien der biologischen Sicherheit beim Umgang mit retroviralen Partikeln. In Deutschland ist die Verwendung der hier verwendeten Retroviren benötigen Biosicherheitsstufe 2. Für die Produktion von retroviralen Partikeln siehe Protokoll 6. Für retroviralen Konstrukte zur Umprogrammierung benutzt, um Karow et al verweisen. (2012). Retroviren waren pseudotypisierte mit VSV-G (VSV-GlycoProtein) 5. Für die Produktion entnehmen Sie bitte Gavrilescu et al 6 verweisen. <ol><li> 24 Stunden vor der retroviralen Transduktion Samen ~ 60.000 Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasdeckgläschen in 500 ul frischem Wachstumsmedium in 24-Well-Gewebekulturplatten, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 5% O 2 . </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 500 ul frisch, vorgewärmten Wachstumsmedium und fügen 1 ul der jeweiligen Überstände konzentriert retrovirale Partikel (für Steuer pCAG-IRES-DsRed, besonders während der Erstellung des Protokolls im Labor), pCAG-ASCL1 enthalten -IRES-DsRed pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li> Einen Tag später, entfernen Sie das Medium mit der Viruspartikel aus den Zellen und 1 ml frisches, vorgewärmtes B27-Differenzierungsmedium, von 49 ml DMEM mit hohem Glucose Glutamax und 1 ml Serum-B27 kostenlose Beilage zusammen. Aufrechterhaltung der Zellen in der Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 und 5% O 2 für 4-8 Wochen, ohne dass das Medium als Medium ändert sich wiederholende schädlich wie iNs reifen. </li></ol> 5. Charakterisierung der induzierten Neuronen durch Immunzytochemie <ol><li> Um die zelluläre Identität der transduzierten Zellen zu bestimmen, insbesondere um den Erwerb eines neuronalen Phänotyp zeigen, führen Immunzytochemie gegen neuronale Antigene wie bIII-Tubulin, MAP2 und NeuN (für Antikörper und deren Verdünnungen, siehe Tabelle von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung, folgen dem gleichen Verfahren wie in 2.2.1 angegeben). </li><li> Zur Verbesserung der Reifung von PdiNs, Co-Kultur dieser Zellen mit Nervenzellen aus der Maus E14 Hirnrinden abgeleitet. Zu diesem Zweck sezieren die Großhirnrinde und distanzieren sich ausdrücklich das Gewebe mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteur-Glaspipette. In 10.000-50.000 murinen Neuronen zu Kulturen von pericyte-abgeleiteten Zellen 2-3 Wochen nach Transduktion mit Sox2-und ASCL1 re-encodingtroviruses und weiter Kultivierung. Transduzierte Zellen aus Maus-Neuronen durch ihre Reporter (GFP und dsRed) Ausdruck entweder durch Live-Epi-Fluoreszenz oder nach Immunzytochemie für GFP und dsRed unterschieden werden. </li><li> Um die Bildung von Synapsen auf PdiNs von murinen Neuronen zu beurteilen, führen Immunzytochemie gegen vesikulären Neurotransmitter-Rezeptoren, wie vesikulären Glutamattransporter 1 (VGLUT1). </li><li> Sonde transduzierten Zellen auf ihre elektrischen Eigenschaften (dh die Fähigkeit zur Erzeugung von Aktionspotentialen) und die Einrichtung von funktionellen Synapsen durch Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Einzelheiten des Verfahrens siehe Heinrich et al. (2011). </li></ol>

<ol>
	<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts.">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+water+deficit,+ABA,+and+provenances+in+Picea+asperata.">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li><li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts.">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li><li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts.">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts.">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li><li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+cells:+how+to+make+and+define+a+neuron.">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li><li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors.">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li><li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons.">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li><li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons.">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li><li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion.">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li><li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable,+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die in-vitro-Erweiterung und Bereicherung des pericyte-abgeleiteten Zellen nach der Isolierung von adulten menschlichen Großhirnrinde und die anschließende Umwandlung in Ins, die von Retrovirus-vermittelte Expression von Transkriptionsfaktoren der neurogenen Sox2 und ASCL1. Solche Protokoll bietet eine experimentelle in vitro-System, die Linie-Umwandlung von Gehirn-residente Zellen in Neuronen und Glia potenziell auch zu untersuchen, mit dem Ziel vor Augen, um sch...

Um eine Anpassung an somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), die wiederum mit einer Vielzahl von Differenzierungspotentiale gegen ausgestattet zielt direkte Anpassung für gerade Umwandlung eines spezifischen Zelltyp in einen anderen. Mit Bezug auf ihre Anwendung im Rahmen der Seuchenmodellierung und potenzielle zellbasierte Therapien, haben beide Ansätze Umprogrammierung spezifischen Vor-und Nachteile. Umprogrammieren in iPS-Zellen (i) bietet eine nahezu unendliche Quelle von Zellen; (Ii) können für die Gentechnik; (Iii) verleiht mit einer nahezu unbegrenzten Differenzierungspotenzial. , Hauptnachteile iPSCs bringen jedoch die Gefahr der Tumorigenität von undifferenzierten Zellen (Teratombildung in vivo) und die Notwendigkeit für die ex vivo Kultivierung und nachfolgende Transplantation, wenn diese Zellen bei Zelltherapien verwendet werden. Umgekehrt wird eine direkte Abstammungslinie Umprogrammierung durch die geringere Ausbeute an den gewünschten Zellen beschränktdie direkt korreliert mit der Anzahl der Zielzellen von der Ausgangspopulation, besitzt den Vorteil, dass linien umgewandelten Zellen scheinen keine tumorerzeugende Risiko bei Transplantation 1,2 aufweisen, aber; Weiterhin direkte Anpassung kann auch in situ, dh innerhalb des Organs, wo würden diese Zellen benötigt werden, wodurch die Notwendigkeit der Transplantation erreicht werden. In diesem Sinne, unser Labor hat die Möglichkeit der Umprogrammierung-Linie Gehirn-residente Zellen in iNs als neuartiges Konzept für zellbasierte Therapien von neurodegenerativen Erkrankungen verfolgt. Brain-residenten Zellen, die potenziell als zelluläre Ziele für linien Umprogrammierung angesehen werden können, umfassen verschiedene Arten von Makroglia (Astrozyten, Oligodendrozyten und NG2 Zellen), Mikroglia und Mikrogefäß-assoziierten Zellen (Endothelzellen und Perizyten). Wir haben ausführlich die in vitro-Umprogrammierung Potenzial der Astroglia der Hirnrinde untersuchttex der frühen postnatalen Mäusen 3-5. Auf der Suche nach ähnlich geeigneten Zellquellen für die direkte Abstammungslinie Umprogrammierung im erwachsenen menschlichen Gehirn, stießen wir auf eine Zellpopulation, die erfolgreich in Ins und Ausstellungs Markenzeichen der Perizyten neu programmiert werden kann. Hier wir ein Protokoll, wie diese Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien geerntet, zu erweitern und zu bereichern, diese Zellen in vitro und schließlich erfolgreich einen wesentlichen Anteil dieser in vitro expandierten Zellen (im Bereich von 25-30%) in umprogrammieren beschreiben Ins. Umprogrammierung durch gleichzeitige Retrovirus-vermittelte Co-Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Sox2 und ASCL1 erreicht werden. Diese PdiNs wurden gefunden, um die Fähigkeit von sich wiederholenden Aktionspotential Brand zu erwerben und als Ziele für die synaptische anderen Neuronen Angabe ihrer Fähigkeit, die Integration in neuronalen Netzwerken dienen. Unser Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und Abstammung Umwandlung von erwachsenen menschlichen Gehirn Perizyten in Ins. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD140b-PE</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">558821</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD146-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MCA2141FT</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD13-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MVA1270A488T</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD34-APC</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">560940</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:80px;">3169S</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-CD146</td>
			<td style="width:80px;">Abcam</td>
			<td style="width:80px;">Ab75769</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NG2</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5320</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-SMA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2547</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T8660</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">M4403</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GFAP</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">G3893</td>
			<td style="width:80px;">use 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-GFP</td>
			<td style="width:80px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:80px;">GFP 10-20</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-RFP</td>
			<td style="width:80px;">Chromotek</td>
			<td style="width:80px;">5F8</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-S100&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">S2532</td>
			<td style="width:80px;">use 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NeuN</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">MAB377</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2052</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-Calretinin</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5054</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-vGluT1</td>
			<td style="width:80px;">SYnaptic SYstems</td>
			<td style="width:80px;">135511</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">11-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control PE</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">12-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control APC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">17-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">12605-010</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61965</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">17504044</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">10106-169</td>
			<td style="width:80px;">perform heat inactivation by incubation at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">15140122</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">24020-091</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="198">
			<td height="198" style="height:198px;width:80px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1&#215;; Invitrogen, cat. no. 14190)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">14190</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">H3375</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P0899</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P1648</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A9418</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T9284</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">042M4005</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Aqua-Poly/Mount</td>
			<td style="width:80px;">Polysciences</td>
			<td style="width:80px;">18606-20</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Polypropylene round-bottom tubes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352063</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352235</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">24-well plates</td>
			<td style="width:80px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:80px;">5530305</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">658175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">25 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">690175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Disposable pipettes 10 ml</td>
			<td style="width:80px;">Sarstedt</td>
			<td align="center" style="width:80px;">#########</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass Pasteur pipettes (150 mm)</td>
			<td style="width:80px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:80px;">FB50251</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass coverslips 12 mm diameter</td>
			<td style="width:80px;">Menzel</td>
			<td style="width:80px;">CB00120RA1</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Surgical disposable scalpels&#160;</td>
			<td style="width:80px;">B. Braun</td>
			<td style="width:80px;">5518083</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">633180</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Conical tubes 15ml</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352095</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:80px;">Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes</td>
			<td style="width:80px;">Hettich Lab Technology</td>
			<td style="width:80px;">1406</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Humified cell culture incubator</td>
			<td style="width:80px;">Eppendorf Galaxy 170R</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Wather bath at 37 &#176;C</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">FACSFlow sheath fluid&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">342003</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Epifluorescence microscope BX61</td>
			<td style="width:80px;">Olympus</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Confocal microscope LSM710</td>
			<td style="width:80px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons

Direkte Linie-Reprogrammierung von nicht-neuronalen Zellen in Neuronen induziert (INS) kann Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Neurogenese bieten und ermöglichen neue Strategien für In-vitro-Modellierung oder die Reparatur des kranken Gehirns. Identifizieren Gehirn-Resident nicht-neuronalen Zelltypen zugänglich direkte Umwandlung in iNs könnte für die Einführung eines solchen Ansatzes in situ, dh innerhalb des geschädigten Hirngewebe zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine in dem Versuch der Identifikation von Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn, die diese Prämisse zu erfüllen abgeleitet entwickeltes Protokoll. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Kultivierung von menschlichen Zellen aus der Hirnrinde von erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien erhalten; (2) die in vitro-Vermehrung (etwa 2-4 Wochen erforderlich) und die Charakterisierung der Kultur durch Immunzytochemie und Durchflusszytometrie; (3) die Anreicherung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von Anti-PDGF-β-Rezeptor-und Anti-CD146-Antikörper;(4) die Retrovirus-vermittelte Transduktion mit dem neurogene Transkriptionsfaktoren Sox2 und ASCL1; (5) und schließlich die Charakterisierung der resultierenden pericyte abgeleiteten induzierten Neuronen (PdiNs) durch Immunzytochemie (14 Tage bis 8 Wochen nach retroviraler Transduktion). In diesem Stadium kann ins für ihre elektrischen Eigenschaften von Patch-Clamp-Aufnahme untersucht werden. Dieses Protokoll stellt eine hoch reproduzierbares Verfahren für die in vitro-Umwandlung der Linie Gehirnfremden Perizyten in funktionelle menschliche INS.

Das erste Ergebnis dieses Protokoll nach dem erfolgreichen Aufbau einer Kultur aus einer Probe des erwachsenen Menschen Hirnrinde besteht in der Identifizierung der zellulären Zusammensetzung des Kultur. Immunzytochemie für die Zelltyp-spezifische Proteine ​​offenbart eine beträchtliche Heterogenität zwischen den Kulturen Probe verschiedener Patienten (1A) abgeleitet ist. Wie durch die Strömungs Durchflusszytometrie quantifiziert gibt es immer eine wesentliche Fraktion von Zellen, PDGFRβ expri...

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Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Aufrufe.  Ludwig Maximilians University Munich.  Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1. 

Serie: Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...