Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Stiftung unterstützt.

1. Basic Set Up Bevor mit Cell Culture <ol><li> NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Zuschläge sind in einem Verhältnis 9:1 gemischt, jeweils um komplette NSC Medium zu machen. </li><li> A 37 ° C warmes Wasserbad verwendet wird zum Aufwärmen des Mediums. </li><li> Geeignete Menge von Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) aufgetaut. </li><li> Geeignete Menge über diesen Wachstumsfaktor Lösungen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktor (EGF bei 10 ug / ml), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF bei 10 ug / ml) und 0,2% Heparin-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgetaut. </li><li> Zellkulturflaschen (T25, T75 oder T175 &amp;) werden für NSC Expansion und Differenzierung notwendig. </li><li> Gewebekultur behandelt 96 und 24 Well-Platten und Deckgläser werden für die Beschichtung von sortierten Zellen benötigt werden. </li></ol> 2. Isolation und Expansion (Die Passage) von NSCs <ol><li> Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen werden isoliert und von der Maus b erweitertRegen wie in separaten Protokollen Nr. 1, 2 3 beschrieben. </li><li> Wenn die Neurosphären (primär oder passagierten Neurosphären) bereit für Subkultur (150-200 &amp;mgr; m im Durchmesser) sind, ist das Medium, Sphären auf eine geeignete Größe sterile Gewebekultur-Röhrchen überführt und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand Medium wird entfernt und die Kugeln in 1 ml der vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert. </li><li> Nach der Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 2-3 min, wird ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu der Zellsuspension zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde vollständig inaktiviert wird die Zellsuspension auf und ab pipettiert 3-5 mal. </li><li> Nach Zentrifugation bei 800 Upm (110 g) für 5 min wird der Überstand entfernt und die Zellen werden in 1 ml vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> 10 &amp;mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul trypa gemischtn blue zur Durchführung einer Zellzahl. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Die Zellen werden dann für die Subkultur 1, 2 oder zur Differenzierung wie unten beschrieben verwendet. </li></ol> 3. Differenzierung neuraler Stamm-und Progenitorzellen, die Neuroblast Assay (NBA) <ol><li> Zellen, die aus dissoziierten Neurospheres werden in einer Konzentration von 2-3 × 10 5 Zellen / ml in der gesamten NSC-Medium mit 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 l / ml von 0,2% und 5% Heparin ausplattiert Hitze inaktiviertes FCS in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche. 5 ml Medium für T25, T75 für 20 ml und 40 ml für T175-Flaschen verwendet. Hinweis: FCS daß die Zellen fest mit dem Substrat zu befestigen und es gibt keine Notwendigkeit für die Beschichtung der Kolben für NBA Kultur. </li><li> KultAbbildung Kolben werden dann in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird als Proliferation Phase werden NSC Nachkommen an dem Substrat und proliferieren als eine Monoschicht von Zellen. </li><li> Wenn die Kultur Konfluenz 90-95%, die mittlere jeder Flasche wird auf der gesamten NSC-Medium mit 5% FCS ohne Wachstumsfaktoren ergänzt eingeschaltet. </li><li> Kulturflaschen werden erneut in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für weitere 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird der Grad der Differenzierung genannt, während der neuronalen Vorläuferzellen erscheinen oben auf einem astrozytären Monoschicht und sich vermehren, um Kolonien von unreifen Nervenzellen machen. Am Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, ist die Kultur bereit für die Isolierung der Neuroblast Zellen mittels Durchflusszytometrie-Technologie. </li></ol> 4. Zellpräparation für die Durchflusszytometrie Trypsinisierung <ol><li> Die Kultur der Differenzierung NSC Nachkommen am Tag 4-5 der Zelldifferenzierung wird einmal mit einer geeigneten Menge an PBS (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) mit FCS aus der Kultur entfernt gewaschen. Hinweis: FCS Blöcke Trypsin-EDTA-Aktivität. </li><li> Dann wird eine ausreichende Menge an vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) in jeden Kolben zugegeben, um die Zellmonoschicht bedecken und inkubiert für 1-2 min in 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Der Kolben wird unter dem Mikroskop, um die Wirkung von Trypsin-EDTA auf die Kultur zu bewerten überprüft. Der Kolben wird dann mit einer Hand gehalten und schlug fest mit der anderen Hand, um die Zellen vom Boden der Flasche zu entfernen. </li><li> Gleiche Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird in den Kolben zu Trypsin-Aktivität zu löschen zugegeben. Die Zellsuspension wird sanft nach oben und nach unten zu Trypsin pipettiert Inaktivierung zu gewährleisten und um eine homogene einzelne Zelle erreichenSuspension. Hinweis: Alternativ-Medium mit 5% FCS verwendet werden, um Trypsinaktivität stillen werden. </li><li> Um nicht getrennten Klumpen zu entfernen, wird die Zellsuspension durch ein 40-Mesh-Größe um-Filter geleitet. </li><li> Die Zellsuspension wird dann bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden in einem geeigneten Volumen an vollständigem NSC resuspendiert. </li><li> Das Endvolumen der Zellsuspension wird so eingestellt, dass die Zelldichte nicht mehr als 2-3x10 6 -cells/ml. Hoher Zelldichte könnte Strom Blockade in der Durchflusszytometrie Maschine verursachen. </li><li> Wenn Sie möchten, neuronalen Zellen nur auf ihre physikalischen Eigenschaften zu isolieren, jetzt können Sie auf FACS-Sortierung wie in Teil 4 beschrieben fortfahren. </li><li> Vor dem Sortieren wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen aufgenommen. </li></ol> Live-cell Immunomarkierung Um eine höhere Reinheit des neuronalen Zellen, geerntet einzelnen Zelle aus der NBA Kultur kann für PSA-NCAM (ein Marker der frühen unreifen neuronalen Vorläuferzellen) und dann die positiven Zellen aus der neuronalen Population angefärbt werden erreichen können isoliert mit der FACS-Maschine werden. <ol><li> Nach Durchführung einer Zellzählung, wird die einzige Zellsuspension aus der NBA-Kultur in vier Gruppen unterteilt: <ul><li> Zellen allein Gruppe dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 1 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Zellen plus PI, dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 10 x 10 6 Zellen) einzustellen. PI-negativen Zellen aus dieser Gruppe können auch bezogen auf die Zellen physikalischen Eigenschaften sortiert werden. </li><li> Sekundäre allein (Isotyp-Kontrolle), die Gruppe dient auch als Kontrolle, um Parameter und Tore (1-2 x 10 6 Zellen) einzustellen. </li><li> Immunmarkierung Gruppe (8-10 x 10 6 Zellen), die für PSA-NCAM gefärbt ist, um zu erreichenweitere Reinigung der unreifen neuronalen Zellen. Um tote Zellen auf Sortierung auszuschließen, wird PI zu dieser Gruppe hinzugefügt als auch. </li></ul></li><li> Um Immunmarkierung zu starten, werden die Zellen bei 800 Upm (110 g) für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden in 100 ul vollständige NSC resuspendiert. </li><li> Phycoerythrin (PE) konjugiertem Anti-PSA-NCAM Antikörper in einem Verhältnis von 10 ul / 5-10 × 10 6 Zellen der Zellsuspension für PSA-NCAM gefärbt werden zugegeben. In gleicher Weise wird eine PE-konjugiertem Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper der Isotyp-Kontrolle Zellsuspension zugegeben. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Antikörper Datenblatt über die Konzentration der Antikörper verwendet werden. Die Zellsuspension wird dann vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert für 10-15 min im Dunkeln. </li><li> Die Zellsuspensionen (PSA-NCAM und Isotyp Kontrollröhrchen) werden dann bei 800 Upm (110 g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden wieder &amp; Fahrwerknded in 1 ml vollständigem Medium NSC. </li><li> Um überschüssige un-beschränkt Antikörper, die aus den Proben zu entfernen, wird der Schritt April 2-3 mal wiederholt. </li><li> Nach der erneuten Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen an Medium, Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) bei einer Konzentration von 1 l / ml der Zellsuspension (Zellen plus PI, Isotyp-Kontrolle und das hinzugefügt PSA- NCAM-gefärbten Proben), um auszuschließen, wenn tote Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li><li> 15 ml-Falcon-Röhrchen sterilen mit 1 ml vollständigem Medium bereit sind, sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu sammeln. </li></ol> 5. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) von unreifen Neuronen <ol><li> Die FACS-Maschine wird auf der Grundlage seiner Anleitung Handbuch über die Durchflusszytometrie Anlage-Experte Techniker eingestellt. </li><li> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder andere geeignete Lösungen depending auf die Anweisungen des Herstellers, könnte als Hüllfluid bei 28 PSI durch eine 90 um Düse verwendet werden. </li><li> Differenzdruck auf dem System ist so eingestellt, dass die Art Trigger nicht übersteigt 2500 Ereignisse / Sekunde. </li><li> Die Zellsuspension aus den Zellen allein Gruppe wird durch die FACS-Maschine laufen. </li><li> Zunächst werden die Zellen (Ereignisse) auf der Basis ihrer Größe (Forward Scatter (FSC) Licht) versus interne Komplexität (Side Scatter (SSC)-Licht) zu unterschiedlichen Zellpopulationen unterscheiden aufgetragen. Um dies zu tun, sollte die Spannung Parameter für FSC und SSC so eingestellt, dass die Zellen in der Durchflusszytometrie Diagramm kann gesehen werden. </li><li> Um Zellklumpen und Dubletten auszuschließen, werden die Zellen zunächst aufgetragen basierend auf Vorwärtsstreuung Bereich (FSC-A) gegenüber Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und die Single-Zell-Population ist als gated Bevölkerung 1 (P1). Dann werden die P1-Zellen basieren auf Seite Streubereich (SSC-A) versus Seitwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und dieser Zeit werden die einzelnen Zellen sind gat aufgetragened Bevölkerung als 2 (P2). Nachdem festgestellt wurde, diese zwei aufeinanderfolgenden Toren, Klumpen oder Dubletts (FSC hohe Pulsbreite und hohe SSC Impulsbreite) werden ausgeschlossen. </li><li> Um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, werden die einzelnen Zellen (P2), basierend auf PI Reaktivität gegenüber FSC-A und dem einzigen Live-Zell-Population ist gated aufgetragen. </li><li> Einzel lebenden Zellen basieren auf FSC gegen SSC aufgetragen zu unterschiedlichen Zellpopulationen auf Zellgröße und Granularität der Basis interner unterscheiden. In diesem Stadium zwei Zellpopulationen torgesteuert FSC niedrigen SSC niedrig (P3) und FSC hohen SSC hoch (P4) Zellpopulationen. </li><li> So sortieren PSA-NCAM immunreaktiven unreifer neuronaler Zellen aus dem FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte, die erste FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte von Kontrolle (Zellen plus PI und Isotyp-Kontroll-) Gruppen wird auf Basis PE-Immunreaktivität gegen FSC-A aufgetragen und die negative Zellen sind gated (P5), und dann positiven Zellen von PSA-NCAMgebeizt Gruppe sind als gated Bevölkerung 6 (P6). </li><li> Nach der Einstellung alle benötigten Tore, werden die Zellen von Interessen in 15 ml sterile Zellkultur-Röhrchen mit 1 ml Medium NSC sortiert. </li><li> Die sortierten Zellen werden dann bei 1200 rpm (240 g) für 5 Minuten zentrifugiert. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in einem geeigneten Volumen des Mediums (in Abhängigkeit von der Pelletgröße) und einer Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird. </li><li> Die Zellen werden dann in Poly-L-Ornithin beschichteten 96-Well-Platten bei einer Dichte von 20-30 x 10 3 Zellen / Vertiefung in 200-250 ul vollständige NSC-Medium ausplattiert mit 5% FCS und 20 ng / ml menschlichen rekombinanten BMP4 5 . </li></ol> Hinweis: die Beschichtung 96 Vertiefungen, 100 ul von Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung (1,5 ml Poly-O und 8,5 ml steriler PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird bei 37 ° C-Inkubator für mindestens eine inkubiert Stunde. Dann wird das Poly-O entfernt und jede Vertiefung dreimal mit sterilem PBS gewaschen(Lassen Sie die PBS in der gut bleiben für jeweils 10 Minuten Zeit). Verwenden Sie 500 ul von Poly-L-Ornithin Arbeitslösung / gut, wenn 24-Well-Platten verwendet werden. <ol start="14"><li> Die Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Art mit kaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und immungefärbt geeignete neuronale und gliale Zellmarker, um den Phänotyp der sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu bewerten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Im Neuroblast Assay (NBA) Differenzierung Kultur, plattierten Zellen der Gewebekultur Substrat zu befestigen und zu wachsen als einer Monoschicht. Je nach anfänglichen Zelle Beschichtungs-Dichte, wird die Kultur in eine 90-95% konfluenten Kultur nach 3-4 Tagen zu machen. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Monoschicht von hauptsächlich Astrozyten visualisiert unten mit kleinen runden neuronalen Vorläuferzellen auf 4,5 (Abbildung 1). Nach dem Einschalten des Mediums an einen Wachstumsfaktor Medium, startet neuronalen VorläuferzellenTeilung rasch und erzeugen Cluster von unreifen Zellen Neuroblast auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht in 4-5 Tagen (Abbildung 2). Durchflusszytometrie dissoziierter NBA Kultur an Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, zeigt im Wesentlichen zwei Zellpopulationen; FSC niedrigen SSC niedrigen und hohen FSC-SSC hoch auf Zellgröße (FSC) und interne Granularität (SSC) (Abbildung 3). Immuno-Fluoreszenz-Analyse der sortierten Zellen zeigt, dass die neuronalen Zellen vor allem in der FSC-SSC niedrigen niedrigen Populationen (mit mehr als 75% von ihnen zum Ausdruck β-Tubulin-III) befindet, während sortierten Zellen aus dem FSC-SSC hoch hoch Bevölkerung sind meist GFAP immunreaktiv Astrozyten (Abbildung 4). Die weitere Reinigung von unreifen neuronalen Zellen bis zur Homogenität (97%) könnte eine positive Selektion von PSA-NCAM IR-Zellen aus dem FSC niedrigen SSC dünn besiedelte (Abbildung erreicht werden3, 4). Angereichert neuronalen Zellen aus den NSCs von E14 Maus ganglionären Eminenzen isoliert generiert erwerben einen GABAergen Phänotyp und Express DARPP-32, einem Marker der mittleren stachelige Neuronen, auf Differenzierung (Abbildung 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Proliferation der Bühne. Diese Monoschichtkultur besteht aus flachen Zellen Astrozyten (Pfeilspitzen) und darunter rund neuronalen Vorläuferzellen (Pfeile) an der Spitze. Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="2"/> . Abbildung 2 Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Differenzierung der Bühne: A) Phasenkontrast, B) Immunfluoreszenzfärbung. Beachten Sie die Ansammlung von unreifen neuronalen Zellen (Pfeile in A </strong&gt; und β Tubulin-III-Färbung in B) auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht (Pfeilspitzen in A-, GFAP-Färbung in B). Original-Vergrößerung; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> . Abbildung 3 Vertreter Sortieren Plots: A). FSC vs SSC Art Plot vor Ausschluss von Dubletten und tote Zellen. B, C). Sortieren Grundstücke für den Ausschluss von Dubletten auf FSC-und SSC-Pulsbreite. D basiert). Ausschluss von toten und geschädigten Zellen auf Propidiumiodid Immunreaktivität basiert. E). FSC vs SSC Plot nach Ausschluss von Dubletten und tote Zellen, welche die beiden wichtigsten Bevölkerungsgruppen wie dem FSC-SSC niedrigen niedrigen und den hohen SSC FSC hohe Populationen bezeichnet. F, G). Sortieren Plots zu PSA-NCAM IR unreife Zellen aus dem FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung zu isolieren. Abbildung 4. Vertreter Aufnahmen von Zellen aus verschiedenen Populationen einen Tag nach Plattieren sortiert. A) FSC-SSC niedrige niedrige Bevölkerung (mehr als 75% dieser Zellen sind Neuronen). B) FSC hohe SSC hohen Bevölkerung (die meisten dieser Zellen sind Astrozyten ). C) PSA-NCAM + sortierten Zellen aus FSC niedrigen SSC geringe Bevölkerungsdichte (fast alle der sortierten Zellen sind Neuronen). Ursprüngliche Vergrößerung, 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Sortiert unreifen Neuronen differenzieren zu GABAergen Neuronen (A) und Express DARPP-32 (B), einem Marker für mittlere stachelige Neuronen.

<ol>
	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Möglichkeit, definierte neuronale Zellpopulationen zu isolieren (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) lösen könnten einige der Hindernisse bei der klinischen Anwendung der neuralen Stammzellen (NSCs) verbunden sind. Erstens ermöglicht es uns für die vollständige Charakterisierung der Ausgangspopulation von Spenderzellen. Zweitens erlaubt es uns, einen bestimmten Zelltyp oder eine Kombination von verschiedenen Zelltypen mit einem bestimmten Verhältnis zu verwenden, je nach Art oder das Stadium der Erk...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements </td><td> Medium Ergänzung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM Komponente </td></tr><tr><td> * Destilliertes Wasser </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Flasche </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80-Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Antikörper </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-konjugierten Maus-IgG1 </td><td> Isotypkontrollantikörper </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituiert in PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> F &amp; E </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-OrnitHine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> Medium Supplement </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Antikörper </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III-Tubulin </td><td> Antikörper </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Um sicherzustellen, HEM, Mix 1 x 10 L-Paket von MEM und 160 ml 1 M HEPES und bringe das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Stellen Sie den End-pH auf 7,4 und bewahren Sie ihn bei 4 ° C

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

Neurale Stammzellen (NSC) isoliert und in erweitert werden große, mit der Neurosphere Assay und differenzierten zu den drei Zelltypen des zentralen Nervensystems (CNS), nämlich, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen. Diese Eigenschaften machen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von Zellen für in vitro-Studien wie Wirkstoff-Screening, Neurotoxikologie und Elektrophysiologie und auch für die Zell-Ersatz-Therapie bei vielen neurologischen Erkrankungen. In der Praxis jedoch, die Heterogenität der NSC Nachkommen, geringe Produktion von Neuronen und Oligodendrozyten und Astrozyten Vorherrschen nach der Differenzierung beschränken ihre klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode für die Erzeugung und anschließende Reinigung der unreifen Neuronen aus murinen NSC Nachkommen mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS)-Technologie. Mit dieser Methode kann ein hoch angereichertes neuronalen Vorläuferzellen Zellpopulation Witz erreicht werdenHout keine spürbaren Astrozyten und bona fide NSC Kontamination. Das Verfahren umfasst Differenzierung von NSC Nachkommenschaft isoliert und expandiert von E14 Maus ganglionären Eminenzen mit dem Neurosphäre Assay, durch Isolierung und Anreicherung von unreifen neuronalen Zellen auf der Basis ihrer physikalischen (Größe und interne Komplexität) und fluoreszierenden Eigenschaften mittels Durchflusszytometrie Technologie gefolgt. Insgesamt dauert es 5-7 Tage, um Neurosphären und 6-8 Tage zu erzeugen, um NSC Nachkommen zu unterscheiden und zu isolieren hochgereinigten unreifen neuronalen Zellen.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Aufrufe.  The University of Florida. Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Serie: The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...