Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network &#8220;C7&#8221;, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology &#8220;ENLIGHTENMENT&#8221; project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Empfehlungen und Richtlinien der Ethikkommission der Abteilung Biomedizinische Wissenschaften der Universität Antwerpen. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung von nicht-fühlenden Materials aus dem explantierten Gehirn juveniler Wistar-Ratten, die von zugelassenen humane Sterbehilfe Techniken erhalten. 1. Ausrüstung Vorbereitung <ol><li> Installation und Konfiguration der Datenerfassung und Stimulationssystem. <ol><li> Verwenden Sie einen Personalcomputer (PC) mit einem Datenerfassung (DAQ) Karte von Comedi unterstützt ausgestattet, um Signale zu erfassen und senden analoge Steuerspannungen an den elektrophysiologischen Verstärker. HINWEIS: Comedi ist ein Linux-Modul und Bibliothek, die eine Vielzahl von Datenerfassungskarten aus den gängigsten Herstellern unterstützt: besuchen http://www.comedi.org für weitere Informationen. </li><li> Falls ein computergesteuertes Patch-Clamp-Verstärkers in Gebrauch ist, verwenden einen zweiten PC neben den ein an den Verstärker gewidmetKontrolle. Anmerkung: Während letztere kann ein herkömmliches Betriebssystem ausgeführt wird, wird die zusätzliche PC sein, die in Echtzeit mit Hilfe eines speziellen Betriebssystems. Unter diesen Bedingungen ist es zweckmäßig, einen einzigen Monitor, Maus und Tastatur an den zusätzlichen PC angeschlossen zu verwenden, während eine Verbindung von einem Remote-Desktop-Anwendung auf dem dedizierten PC. </li><li> Laden Sie das ISO-Image der Live-CD, die eine Echtzeit-Linux-Betriebssystem mit LCG vorinstalliert aus http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso und brennen Sie sie auf eine leere CD oder USB-Stick &quot; . </li><li> Legen Sie einfach die CD in das Laufwerk des PC mit dem DAQ-Karte und starten Sie es. Alternativ installieren LCG von seinem Online-Quell-Repository auf einem PC mit dem Betriebssystem Linux (zB Debian oder Ubuntu). Wenden Sie sich im Online-Handbuch für Details über den Einbauvorgang. Das Handbuch ist in http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf Internetseite. </li><li> Booten Sie von der Live-CD: this wird automatisch ein komplett konfiguriertes System zu laden. Um dies zu tun, legen Sie das LCG-Live-CD in das CD-ROM-Laufwerk und starten Sie den Computer von der CD; wählen Sie das Echtzeit-Kernel (Standardoption), sobald das Boot-Menü angezeigt wird, und warten Sie, bis das System initialisiert werden. </li><li> Kalibrieren Sie den DAQ-Karte, indem Sie an der Eingabeaufforderung: sudo comedi_calibrate oder sudo comedi_soft_calibrate je nachdem, ob die Datenerfassungsplatine unterstützt Hardware- oder Software-Kalibrierung, bzw. (verwenden Sie den Befehl sudo comedi_board_info um Informationen auf dem Brett zu erhalten). </li><li> Stellen Sie die entsprechende Analog-Digital- und Digital-Analog-Umwandlungsfaktoren: das erfordert, die Zugriff auf das Handbuch des Mobilelektrophysiologischen Verstärker und insbesondere auf seine Spezifikationen auf der Umrechnungsfaktoren. </li><li> Verwenden Sie einen Texteditor, um die entsprechenden Zahlenwerte in der Datei /home/user/.lcg-env für die Umgebungsvariablen angeben, AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. ANMERKUNG: Diese stellen den Eingang (AI) und Ausgang (AO) Verstärkungen für Stromklemme (CC) und die Spannungsklemme (VC) Modi und die Umrechnungsfaktoren zwischen den Spannungsbefehlen durch den Computer zur Verfügung gestellt und dem aktuellen bzw. Spannungen, die durch den Verstärker erzeugt wird verbunden. </li><li> Alternativ können Sie die LCG-Skript zur Verfügung gestellt (LCG-find-Umwandlung-Faktoren), um die Umrechnungsfaktoren in seinem System zu finden. HINWEIS: Die berechneten Werte von LCG-find-Umwandlung-Faktoren sind Vermutungen, die in einigen Fällen erforderlich, numerisch Stumpf zu sein oder abgerundet, um die genauen Werte der Umrechnungsfaktoren zu reflektieren. </li><li> Zur Nutzung LCG-find-Umwandlung-Faktoren, starten Sie, indem Sie den &quot;Modellzelle&quot;, die oft mit dem Verstärker zu dem entsprechenden heads gekauft. Dann öffnen Sie ein Terminal auf dem Linux-Rechner, auf dem Sie ausgeführt werden die Live-CD und geben Sie den folgenden Befehl an der Shell-Eingabeaufforderung: lcg-find-Umwandlung-Faktoren -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env HINWEIS: In beiden Fällen (dh manuelle Änderung /home/user/.lcg-env oder Verwendung LCG-find-Umwandlung-Faktoren), in der Nähe, und öffnen Sie das Terminal, damit die Änderungen wirksam werden. </li><li> Wenn mehrere headstages verwendet werden, legen Sie die Umrechnungsfaktoren auf die gleichen Werte in allen Kanälen; wenn dies nicht möglich ist, finden Sie in der LCG Online-Handbuch zu verstehen, wie man mehrere Umrechnungsfaktoren in LCG-Stimulus oder wie verwenden, um Konfigurationsdateien, die die Bedürfnisse des Benutzers besser entsprechen zu produzieren. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Akute Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex <ol><li> Herstellung von Lösungen für die Elektrophysiologie. <ol><li> Bereiten künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Mischen (in mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 Glucose, 2 CaCl 2, und 1 MgCl 2. Bereiten 10x Lager-Lösungen für die ReduzierungVorbereitungszeit am Tag des Experiments. Vorbereitung 2 L, von denen eine für die Herstellung der Scheiben und der andere für die Aufzeichnung verwendet werden. </li><li> Sättigen den ACSF mit 95% O 2 und 5% CO 2 für mindestens 30 min vor dem Beginn des Verfahrens. </li><li> Für aktuelle Clamp Messungen, verwenden Sie eine intrazelluläre Lösung (ICS) enthält (in mM) 115 K-Gluconat, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Bereiten Sie die Lösung in Eis und filtern sie vor dem Beginn der Aufnahmen um die Gefahr des Verstopfens der Pipetten eliminieren. </li></ol></li><li> Gehirn-Extraktion. <ol><li> Das Tier zu betäuben, indem das Tier in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran und schnell zu enthaupten sie mit einem Guillotine oder großen Schere. </li><li> Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie und schieben Sie sie in den Ohren. </li><li> Mit einer feinen Schere schneiden den Schädel entlang der Mittellinie. Halten Sie die Klinge so nah wie möglich zu the Oberfläche, um eine Beschädigung der darunter liegenden Gehirn zu minimieren. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, verwenden Sie einen Spachtel, um den Sehnerv und den Hirnstamm durchtrennen und sanft fallen das Gehirn in eiskaltem ACSF. </li><li> Trennen Sie das Kleinhirn und die beiden Halbkugeln mit einem Skalpell (Blatt 24). </li><li> Überschüssiges Wasser aus einer der beiden Hemisphären und kleben Sie es auf einer geneigten Plattform mit einem Tropfen Sekundenkleber. Schnelles Hinzufügen von ein paar Tropfen ACSF über das Gehirn und überträgt es auf der Vibratom Kammer. HINWEIS: Bei der Vorbereitung sagittal, ist der Winkel der Plattform wichtig, damit eine Beschädigung der Dendriten der Pyramidenzellen während des Trennverfahrens. </li></ol></li><li> Herstellung der Scheiben. <ol><li> Setzen Sie die Klinge über das Gehirn und entsorgen Sie die ersten 2,5 bis 3 mm. Regelung der Drehzahl und der Frequenz, um eine Beschädigung der Oberfläche der Scheibe, während gleichzeitig die Minimierung der Zeit für die Schneidverfahren erforderliche Maß zu beschränken. </li><li> Stellen Sie die Dicke bis 300 μm und beginnen Schneiden. Wenn das Messer an der Hirnrinde weg, verwenden eine Rasierklinge oder eine gebogene Nadel über dem Hippocampus und an den Rändern des kortikalen Bereich von Interesse zu schneiden. </li><li> Platzieren Sie die Scheiben in einer Multi-Well-Inkubationskammer bei 32 gehalten - 34 ° C. </li><li> Ziehen Sie die Klinge, und wiederholen Sie Punkte 2.3.2 und 2.3.3 bis 5-8 Scheiben geschnitten werden. Die besten Scheiben sind in der Regel diejenigen, bei denen die Blutgefäße parallel zu der Oberfläche sind. </li><li> Inkubiere die Scheiben für 30 min, nachdem die letzte Scheibe in der Kammer platziert. </li></ol></li></ol> 3. Patch-Clamp-Aufnahmen von Schicht 5 Pyramidenzellen <ol><li> Legen Sie eine Scheibe in der Aufnahme Kammer und die Suche nach gesunden Zellen. Diese Zellen haben in der Regel einen niedrigeren Kontrast, ein glattes Aussehen und sind nicht geschwollen. </li><li> Inspizieren die Scheibe unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung Linse und die Suche nach Zellen, in der Schicht 5, mit etwa 600 bis 1000 um von der Oberfläche des Gehirns befindet. </li&gt; <li> Sobald eine geeignete Zelle gefunden wird, Last ein Drittel der Mikropipette mit ICS und legen Sie sie in der heads. </li><li> Auf der persönlichen Computer mit dem Live-CD oder das vorkonfigurierte Linux-Betriebssystem, starten Sie eine Eingabeaufforderung (zB bash) und an seinem Eingabeaufforderung den Befehl lcg Null. Dies stellt sicher, dass die Messkarte wird nicht den Antrieb des Verstärkers. </li><li> Gelten 30-50 mbar Überdruck durch Drücken auf den Kolben der Spritze einen gemeinsamen, durch einen Schlauch mit der Pipettenhalter und, mit Hilfe des Mikroskops angeschlossen ist, den Pipetten etwa 100 um über der Scheibe. HINWEIS: Setzen Sie die Pipette in eine Position, die eine direkte Verbindung erlaubt es, die Zielzelle, vorzugsweise unter Verwendung des Ansatzes Modus des Mikromanipulator. </li><li> Acting auf die Kontrollen der Elektrophysiologie-Verstärker, stellen Sie die Pipette Offset und geben ein Testimpuls (10 mV) in voltage clamp Modus. </li><li> Reduzieren Sie den Druck um 10 bis 30 mbar (je nach Pipettengröße) durch Abziehen derKolben der Spritze; vorsichtig nähern die Zelle und prüfen, ob die Bildung eines Grübchens durch Beobachtung des Bildes auf der Videokamera-Monitor. Überwachen Sie den Testimpuls für eine Erhöhung der Widerstandsfähigkeit zu jeder Zeit, durch die Beobachtung der Stromwellenform auf dem Oszilloskop auf die Elektrophysiologie Verstärker angeschlossen angezeigt (alternativ können Sie den Befehl LCG-Siegel-Test verwenden, um die Pipette Widerstand zu überwachen). </li><li> Den Druck und gegebenenfalls schonend negativen Druck auf das Pipette Dichtungsbildung zu helfen, wenn man eine Erhöhung der Pipettenwiderstand und die Bildung eines &quot;Grübchen&quot; auf der Zell bemerken. </li><li> Während die Dichtung bildet, nach und nach die Haltepotential auf -70 mV zu verringern. </li><li> Einmal Gigaohm Dichtung erhalten wurde, sicherzustellen, dass der Haltestrom ist von 0 - 30 Pa. Gelten kurze Impulse von Unterdruck (Sog), um die Membran zu brechen und die Gesamtzellkonfiguration. Alternativ können Sie auch starke und kurze Impulse der Spannung zu injizieren ( <em&gt; dh mit dem Befehl &quot;ZAP&quot; am Verstärker oder Halten der Zelle bei sehr negativ), die Membran reißen, abhängig von der Vorbereitung und Glaspipette verwendet. </li><li> Wechseln Sie in den Stromzange Modus und überprüfen, ob das Ruhemembranpotential ist typisch für eine gesunde Zelle. Zum Rindenpyramidenneuronen eines Kalium-Gluconat-basierte Lösung, ist dieser Wert in der Regel zwischen -65 und -75 mV. </li></ol> 4. halbautomatische Charakterisierung der elektrischen Antworteigenschaften eines Neuron- <ol><li> Erstellen Sie ein Verzeichnis, um Benutzerdaten zu speichern. Um diese beschäftigen die ein Skript in der LCG-Live-CD, die Ordner basierend auf dem Datum erstellt inbegriffen tun. Um es an der Eingabeaufforderung zu verwenden, geben Sie cd ~ / Experimente LCG-create-Experiment-Ordner -s psp, in_vivo_like Dies wird ein Ordner, in dem die Daten für diese Zelle gespeichert wird (und einen &quot;psp&quot; und &quot;in_vivo_like&quot; Unterordner) zu erstellen, und es wird sein Name mit dem Anschluss zu druckenFenster; es ist auch möglich, zusätzliche Informationen, wie beispielsweise Pipettenwiderstand und Zelltyp mit diesem Skript speichern. </li><li> Wechseln Sie in den neu erstellten Ordner mit dem Befehl cd ~ / &lt;Ordnername&gt; Der Ordnername ist die von der Kommando LCG-create-Experiment-Ordner und den Zeitstempel des aktuellen Tages haben (dh Jahr-Monat-Tag) angezeigt, wie in 20140331A01. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Verstärker wird sich in Stromzange Modus zu betreiben, dass die Kabel angeschlossen und die externe Spannungsbefehl des Verstärkers, falls vorhanden, ist aktiviert. </li><li> Geben Sie den Befehl LCG-ecodeat die Eingabeaufforderung. Dies erfordert eine Reihe von Befehlen (nämlich LCG-AP, LCG-VI, LCG-Rampe, die LCG-tau und LCG-Stufen) verwendet werden, um grundlegende Reaktionseigenschaften der Zelle zu charakterisieren. LCG-ecode erfordert, dass der Benutzer festlegen, zwei Parameter: die Amplitude des 1 ms langen Stromimpuls verwendet, um eine einzelne Spitze in der Zelle hervorzurufen, und die maximale Amplitude des Strom ramp injiziert in die Zelle in ihren Rheobase finden. Verwenden Sie die folgende Befehlssyntax: LCG-ecode --pulse Amplitude X --ramp Amplitude Y mit einer Auswahl von den Werten X und Y (in pA), die ausreicht, um die Zelle zu Feuer in Reaktion auf ein 1 ms langen Puls und einer anhaltenden Injektion von Strom bzw. machen. Hinweis: Diese Protokolle erfordern die Durchführung der numerischen Schätzung der &#39;Elektrode Kernel&#39;, um die aktive Elektrode Kompensation (AEC) 15 zu verwenden. Eine lärmStromInjektion verwendet werden, um den Kernel zu schätzen, und der Benutzer wird aufgefordert, die Anzahl der Proben, die das Kernel vornehmen zu bestätigen. Siehe 15 für detaillierte Informationen über die Bedeutung der Elektrode Kernel und wie man die Anzahl der Kernel-Proben zu wählen. </li></ol> 5. Die Injektion von Leitfähigkeit durch Simulated Synapsen und Simulation von In-vivo-ähnliche Hintergrundaktivität <ol><li> Die Injektion von simulierten erregende postsynaptische Potentiale <ol><li>Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie den nächsten Versuch zu retten, indem Sie den folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale: cd psp / 01 </li><li> Kopieren Sie ein LCG-Konfigurationsdatei in das aktuelle Verzeichnis und öffnen Sie sie mit einem Texteditor (Nano in diesem Beispiel), indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale (dieses Beispiel Konfigurationsdatei wird in den Quellcode und die Live-CD enthalten) : cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / epsp.xml nano epsp.xml Hinweis: Dies ist einfach eine Textdatei mit unterschiedlichen Einheiten miteinander verbunden sind. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. </li><li> Bei Bedarf bearbeiten die inputChannel, Output die inputConversionFactor und die outputConversionFactor in dieser Datei die Umgebung des Benutzers zu entsprechen. </li><li> Berechnen Sie die Elektrode Kernel benötigt, um die aktive Elektrode Kompensation durchzuführen &#39;, die von LCG verwendete Methode, um einzelne Elektrode dynamische Klemmführen &quot;, indem Sie den command LCG-Kernel Dies wird für die Anzahl von Punkten in der Kernel-Prompt. Auch hier wählen Sie eine Nummer, so dass die Elektrode Kernel deckt das Ende der exponentiellen Abfall Schwanz. </li><li> Führen Sie die dynamische Clamp-Experiment mit dem Befehl LCG-experimentieren -c epsp.xml </li><li> Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse mit dem Befehl ls -l LCG-Plot-Datei -f letzten </li></ol></li><li> Die Injektion von simulierten hemmenden postsynaptischen Potentiale <ol><li> Erstellen Sie einen Ordner und kopieren Sie die Datei, um sie epsp.xml indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Bearbeiten Sie die Konfigurationsdatei mit einem Texteditor: Zum Ändern der synaptischen Umkehrpotential und Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des Modells Synapse Exp2Synapse auf die folgenden: Parameter&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0,8 E-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;Parameter&gt; Beenden Sie den Texteditor. </li><li> Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale: LCG-Kernel LCG-experimentieren -c ipsp.xml </li><li> Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale: ls -l LCG-Plot-Datei -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulation von in vivo-ähnliche Hintergrundaktivität: <ol><li> Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie die folgenden Versuch zu retten, wie zuvor gezeigt, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Shell wollen: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Kopieren Sie die Konfigurationsdatei von LCG Quellverzeichnis, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale: cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; Hinweis: Diese Datei ist einfach die Verkettung der früheren; zwei Poisson-Punkt-Prozesse, die Pulszüge, die wiederum ernähren hemmenden und erregenden Synapsen Modell, erzeugen die Hintergrundaktivität zu erzeugen. </li><li> Passen Sie die DAQ-Konfigurationsparameter für das Setup des Benutzers, wie in 5.1.3 beschrieben, und beenden Sie den Editor. </li><li> Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale: LCG-Kernel LCG-experimentieren -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3 Die &#39;-n 10 &quot;und&quot; i 3&#39; Schalter zeigen an, dass die Stimulation sollte 10 mal im Abstand von drei Sekunden wiederholt werden. </li><li> Visualisieren Sie die rohen Spuren, die mit dem folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale: LCG-Plot-Datei -f alle </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons.">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li><li>Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity.">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li><li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).</li><li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells.">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network.">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li><li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+networks+with+dynamic+synapses.">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li><li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex.">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Text eine vollständige Protokoll für die Durchführung von Echtzeit wurde mit geschlossener Schleife einzelne Zelle elektrophysiologischen Experimenten beschrieben, mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik und eine kürzlich entwickelte Softwaretools genannt LCG. Um die Qualität der Aufnahmen zu optimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Aufnahme-Setup ordnungsgemäß geerdete, geschirmte und vibrationsfrei sein: Damit wird sichergestellt, stabilen und dauerhaften Ganzzell-Zugriff auf die Zelle, die...

<html> In den letzten Jahren wurde die Elektro zellulären vom traditionellen offenen Schleife Paradigma in Spannungs- und Stromklemme-Experimente zu modernen Closed-Loop-Protokolle verwendet entwickelt. Die bekannteste Technik mit geschlossener Schleife ist vielleicht das dynamische Klemm 6,7, die die synthetische Injektion von künstlichen spannungsgesteuerten Ionenkanälen ermöglicht, die neuronalen Membran Spannung 8 zu bestimmen, die eingehende Untersuchung der Wirkungen von nicht-deter Flimmern auf Ionenkanäle auf neuronale Antwort Dynamik 9 sowie die Erholung in vitro realistischer in vivo- wie synaptische Hintergrundaktivität 10. Andere Closed-Loop-Paradigmen, die vorgeschlagen wurden, umfassen die Blindklemme 11, um in vitro zu studieren die Erzeugung von selbsterhaltende Dauertätigkeit, und die Antwort zu klemmen 4,12, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen zu untersuchen neuronale Erregbarkeit. NHALT &quot;&gt; Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges Framework, das die Anwendung ermöglicht eine Vielzahl von Closed-Loop elektro Protokolle im Rahmen der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten Hirnschnitten durchgeführt. Wir zeigen, wie man somatische Membranspannung mit Hilfe von Patch-Clamp-Aufnahmen aufzeichnen in Pyramidenzellen aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten und gelten drei Closed-Loop-Protokolle mit LCG, ein Kommandozeilen-basierte Software-Toolbox im Labor für Theoretische Neurobiologie und Neuroengineering entwickelt. Kurz gesagt, die beschriebenen Protokolle, sind erstens die automatische Injektion einer Reihe von Stromklemme Reizwellenformen, für die Charakterisierung einer großen Anzahl von aktiven und passiven Membraneigenschaften relevant. Diese wurden vorgeschlagen, um die elektrophysiologische Phänotyp einer Zelle in Bezug auf seine Ansprecheigenschaften zu einer stereotypen Reihe von Reizwellenformen zu erfassen. Bekannt als der E-Code einer Zelle (siehe zB &amp; #160; 13,14) wird eine solche Sammlung von elektrischen Antworten von verschiedenen Laboratorien verwendet, um objektiv zu klassifizieren Neuronen auf der Grundlage ihrer elektrischen Eigenschaften. Dies beinhaltet die Analyse der stationären Eingangs-Ausgangs-Übertragungsverhältnis (fI Kurve) durch eine innovative Technik, die den geschlossenen Regelkreis, Echtzeit-Steuerung der Rate der Brenn mittels eines Proportional-Integral-Differential (PID) -Controller beinhaltet zweitens die Erholung von realistisch in vivo -ähnlichen Hintergrund synaptische Aktivität in in vitro Präparate 10 und drittens dem künstlichen Verbindung in Echtzeit von zwei gleichzeitig aufgenommenen Pyramidenzellen mittels einer virtuellen GABAergen Intern, die durch den Computer simuliert wird. Zusätzlich implementiert LCG die Technik als aktive Elektrode Kompensation (AEC) 15, die die Umsetzung dynamische Klemm Protokolle mit einer einzigen Elektrode ermöglicht bekannt. Dies ermöglicht Ausgleichs unerwünschten Wirkungen (artifacts) der Aufzeichnungselektrode, die, wenn sie für die Bereitstellung von intrazellulärer Stimuli verwendet wird, auftreten. Das Verfahren basiert auf einem nicht-parametrischen Schätzung der äquivalenten elektrischen Eigenschaften des Aufzeichnungskreis. Die in diesem Dokument beschriebenen Techniken und experimentelle Protokolle können ohne weiteres in üblichen Open-Loop-Spannungs- und Stromklemme-Experimente angewendet werden und kann auf andere Präparate, wie extrazelluläre oder intrazelluläre 4,16 Aufnahmen in vivo 17,18 verlängert werden. Die sorgfältige Montage der Einrichtung für ganze Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist ein sehr wichtiger Schritt für stabile, qualitativ hochwertige Aufzeichnungen. Im Folgenden gehen wir davon aus, dass eine solche Versuchsanordnung ist es, den Experimentator bereits verfügbar, und unsere Aufmerksamkeit auf die Verwendung von LCG beschreiben. Der Leser wird auf 19 bis 22 für weitere Tipps rund um die Optimierung und Fehlersuche hingewiesen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>1.5/0.84 mm OD/ID, with filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>20 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMLFS</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6229</td>
			<td>Supported by Comedi Linux Drivers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010 Tower</td>
			<td>OS: real-time Linux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Pump</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>MINIPULS3</td>
			<td>Used with R4 Pump head (F117606)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>TC02</td>
			<td>PH01 Perfusion Cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Testo</td>
			<td>510</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>ACSF, ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51120</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time electrophysiology: using closed-loop protocols to probe neuronal dynamics and beyond

Experimentelle Untersuchung erlebt ein verstärktes Interesse an der Entwicklung und Anwendung von neuen und oftmals komplex, Closed-Loop-Protokolle, wobei der Reiz aufgebracht hängt in Echtzeit auf die Reaktion des Systems. Neueste Anwendungen reichen von der Umsetzung der Virtual-Reality-Systeme zur Untersuchung von motorischen Reaktionen sowohl in Mäusen 1 und 2 in Zebrafisch, zu kontrollieren, von Anfällen folgenden kortikalen Hub mit 3 Optogenetik. Ein wesentlicher Vorteil der Closed-Loop-Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Sondierung höherdimensionalen Eigenschaften, die nicht direkt zugänglich sind oder die auf mehreren Variablen, wie zum Beispiel neuronale Erregbarkeit 4 und Zuverlässigkeit ab, während gleichzeitig die Maximierung des experimentellen Durchsatzes. In diesem Beitrag wird und im Kontext von zellularen Elektrophysiologie, wie man eine Vielzahl von geschlossenen Kreisprotokolle zum Studium der Antworteigenschaften pyramidalen Neurone, rec Anwendung beschreiben wirintrazellulär mit der Patch-Clamp-Technik in akuten Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten orded. Da kein im Handel erhältlich oder Open-Source-Software bietet alle Funktionen, die für die effiziente Durchführung der hier beschriebenen Experimente erforderlich, wurde eine neue Software-Toolbox namens LCG 5 entwickelt, dessen modularer Aufbau maximiert die Wiederverwendung von Computer-Code und erleichtert die Umsetzung der neuen experimentellen Paradigmen. Stimulationswellenformen werden mit einem kompakten Meta-Beschreibung angegeben und vollständige experimentelle Protokolle sind in textbasierten Konfigurationsdateien beschrieben. Zusätzlich hat LCG eine Befehlszeilenschnittstelle, die für die Wiederholung von Studien und Automatisierung der Versuchsprotokolle geeignet ist.

In den vorangegangenen Abschnitten haben wir beschrieben, wie die Software-Toolbox LCG verwenden, um die elektrophysiologischen Eigenschaften L5 Pyramidenzellen zu charakterisieren und in vivo-ähnliche synaptische Aktivität in einer Scheibe Vorbereitung neu zu erstellen. Die Verwendung einer Befehlszeilenschnittstelle und halbautomatische Protokoll begünstigen die Reproduzierbarkeit und Effizienz des Experiments, die einen großen Einfluss auf die Leistung und Qualität der produzierten Daten sammeln können...

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Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K Aufrufe.  University of Antwerp. Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board. 

Serie: Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Eine experimentelle Plattform für die Closed-Loop-Performance von Brain-Machine Interfaces Study

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic effects of drugs and downstream pathways involved would help gain insight into the molecular mechanisms of neuroprotection/neurotoxicity and could potentially facilitate drug development. However, many existing in vitro toxicity assays have major limitations &#8211; most assess neurotoxicity and neuroprotection at a single time point, not allowing to observe the time-course and kinetics of the effect. Furthermore, the opportunity to collect information about downstream signaling pathways involved in neuroprotection in real-time would be of great importance. In the current protocol we describe the use of a real-time impedance-based cell analyzer to determine neuroprotective effects of serotonin 2A (5-HT2A) receptor agonists in a neuronal cell line under label-free and real-time conditions using impedance measurements. Furthermore, we demonstrate that inhibitors of second messenger pathways can be used to delineate downstream molecules involved in the neuroprotective effect. We also describe the utility of this technique to determine whether an effect on cell proliferation contributes to an observed neuroprotective effect. The system utilizes special microelectronic plates referred to as E-Plates which contain alternating gold microelectrode arrays on the bottom surface of the wells, serving as cell sensors. The impedance readout is modified by the number of adherent cells, cell viability, morphology, and adhesion. A dimensionless parameter called Cell Index is derived from the electrical impedance measurements and is used to represent the cell status. Overall, the real-time impedance-based cell analyzer allows for real-time, label-free assessment of neuroprotection and neurotoxicity, and the evaluation of second messenger pathways involvement, contributing to more detailed and high-throughput assessment of potential neuroprotective compounds in vitro, for selecting therapeutic candidates.

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems are already found in clinical applications, and are important tools for basic brain research. A particularly interesting recent development is the integration of closed-loop approaches with optogenetics, such that specific patterns of neuronal activity can trigger optical stimulation of selected neuronal groups. However, setting up an electrophysiological system for closed-loop experiments can be difficult. Here, a ready-to-apply Matlab code is provided for triggering stimuli based on the activity of single or multiple neurons. This sample code can be easily modified based on individual needs. For instance, it shows how to trigger sound stimuli and how to change it to trigger an external device connected to a PC serial port. The presented protocol is designed to work with a popular neuronal recording system for animal studies (Neuralynx). The implementation of closed-loop stimulation is demonstrated in an awake rat.

This protocol demonstrates how to use an electrophysiological system for closed-loop stimulation triggered by neuronal activity patterns. Sample Matlab code that can be easily modified for different stimulation devices is also provided.

Verwenden von Neuron Spiking Activity zum Auslösen von Closed-Loop Stimuli in neurophysiologischen Experimenten

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in acute and chronic pain conditions. This produces abnormal ongoing activity or reduced activation thresholds to noxious stimuli. Identifying the cause of this increased excitability is required for the development and validation of mechanism-based treatments. Single-neuron electrical threshold tracking can quantify nociceptor excitability. Therefore, we have developed an application to allow such measurements and demonstrate its use in humans and rodents. APTrack provides real-time data visualization and action potential identification using a temporal raster plot. Algorithms detect action potentials by threshold crossing and monitor their latency after electrical stimulation. The plugin then modulates the electrical stimulation amplitude using an up-down method to estimate the electrical threshold of the nociceptors. The software was built upon the Open Ephys system (V0.54) and coded in C++ using the JUCE framework. It runs on Windows, Linux, and Mac operating systems. The open-source code is available (<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/Microneurography/APTrack&amp;source=gmail&amp;ust=1680789829274000&amp;usg=AOvVaw0nMk9J_EI2jUn8SlmC5JJm" href="https://github.com/Microneurography/APTrack" target="_blank">https://github.com/Microneurography/APTrack</a>). The electrophysiological recordings were taken from nociceptors in both a mouse skin-nerve preparation using the teased fiber method in the saphenous nerve and in healthy human volunteers using microneurography in the superficial peroneal nerve. Nociceptors were classified by their response to thermal and mechanical stimuli, as well as by monitoring the activity-dependent slowing of the conduction velocity. The software facilitated the experiment by simplifying the action potential identification through the temporal raster plot. We demonstrate real-time closed-loop electrical threshold tracking of single-neuron action potentials during&#160;in vivo&#160;human microneurography, for the first time, and during&#160;ex vivo&#160;mouse electrophysiological recordings of C-fibers and A&#948;-fibers. We establish proof of principle by showing that the electrical threshold of a human heat-sensitive C-fiber nociceptor is reduced by heating the receptive field. This plugin enables the electrical threshold tracking of single-neuron action potentials and allows the quantification of changes in nociceptor excitability.

APTrack is a software plugin developed for the Open Ephys platform that enables real-time data visualization and the closed-loop electrical threshold tracking of neuronal action potentials. We have successfully used this in microneurography for human C-fiber nociceptors and mouse C-fiber and A&#948;-fiber nociceptors.

Open-Source-Echtzeit-Closed-Loop-Tracking des elektrischen Schwellenwerts für die translationale Schmerzforschung

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in ...

Tiefe Hirnstimulation zur Behandlung von Major Depression

Closed-Loop Neurostimulation for Biomarker-Driven, Personalized Treatment of Major Depressive Disorder

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major depressive disorder (MDD), most studies to date have administered continuous or open-loop stimulation with promising but mixed results. One factor contributing to these mixed results may stem from when the stimulation is applied. Stimulation administration specific to high-symptom states in a personalized and responsive manner may be more effective at reducing symptoms compared to continuous stimulation and may avoid diminished therapeutic effects related to habituation. Additionally, a lower total duration of stimulation per day is advantageous for reducing device energy consumption. This protocol describes an experimental workflow using a chronically implanted neurostimulation device to achieve closed-loop stimulation for individuals with treatment-refractory MDD. This paradigm hinges on determining a patient-specific neural biomarker that is related to states of high symptoms and programming the device detectors, such that stimulation is triggered by this read-out of symptom state. The described procedures include how to obtain neural recordings concurrent with patient symptom reports, how to use these data in a state-space model approach to differentiate low- and high-symptom states and corresponding neural features, and how to subsequently program and tune the device to deliver closed-loop stimulation therapy.

Autor im Rampenlicht: Therapeutischer Nutzen der tiefen Hirnstimulation mit geschlossenem Regelkreis bei der Behandlung von Depressionen 

Deep brain stimulation triggered by a patient-specific neural biomarker of a high-symptom state may better control symptoms of major depressive disorder compared to continuous, open-loop stimulation. This protocol provides a workflow for identifying a patient-specific neural biomarker and controlling the delivery of therapeutic stimulation based on the identified biomarker.

Closed-Loop-Neurostimulation zur Biomarker-gesteuerten, personalisierten Behandlung schwerer depressiver Störungen

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major ...