The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Herstellung der Glasgeschirr und Kulturen <ol><li> Bevor Sie mit diesem Experiment fortfahren, bereiten Blut-Agar (SBA) 5% Schafsplatten für den Anbau von MRSA. SBA Inkubation erfolgt während 24 Stunden bei 37 ° C. Nach dieser Zeit sollte einzelne, gut isolierte Kolonien vorhanden, um die anschließende Impfungen in flüssigen Medien verwendet werden können. Speicher strichen SBA-Platten mit Einzelkolonien bei 4 ° C für 1 - 2 Monate. HINWEIS: Schaf Blutagarplatten in vorgefertigte Pakete, die zwischen 20 kommen - 25 Platten auf der Basis der Hersteller, und bestehen typischerweise aus einer tryptischen Soja-Agar Basis mit der Zugabe von 5% w / v Schafsblut. </li><li> Stellen Sie 500 ml tryptische Sojabrühe (TSB) mit 1% Glucose und 0,1% NaCl ergänzt. Danach sammeln und reinigen 2 Probiergläser. Wenn autoklavierbarem Deckel nicht verfügbar für Reagenzgläser sind, verwenden Sie Aluminiumfolie als Deckel. Autoklav TSB und Reagenzgläsern mit einem Feld von 1 ml Pipettenspitzen. </li><li> Unter einer Biosicherheitswerkbank oder in der Nähe eines Bunsen-Brenner, Pipette 5 ml zuvor autoklaviert TSB in autoklavierten Reagenzgläser. Achten Sie darauf, dass genügend Zeit sicherzustellen, gegeben worden ist, um die TSB lassen und Reagenzgläser auf Zimmertemperatur abkühlen. Aus einer zuvor durchzogen von 5% SBA Platte, impfen eine einzelne Kolonie in 6 ml TSB Brühe. Man wird MRSA enthalten, und das zweite Teströhrchen werden als Negativkontrolle verwendet werden, um Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Nehmen geimpften TSB Reagenzgläser und legen Sie sie in einer wechselseitigen Inkubator für 24 Stunden bei 37 ° C und bei 200 Umdrehungen pro Minute. Nach dieser Zeit sollte das mikrobielle Wachstum offensichtlich in der MRSA Reagenzglas, während kein Wachstum sollte sich im Kontroll Reagenzglas stattgefunden haben. </li><li> Nehmen Sie 1 ml von 24 Stunden Kultur und Pipette in 6 ml frischem TSB. Bei 37 ° C für 6 Stunden bei 200 rpm. </li><li> Je 1 ml einer 6 h Subkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 3 Minuten bei 850 x g. Überstand entfernen und resuspendiere das Pellet in 1 ml entionisiertem H 2 O. Zentrifuge, zu wiederholen und erneut zu suspendieren. </li></ol><ol><li> Nehmen rostfreiem Stahl und Gold AFM Probenscheiben (20 mm und 10 mm Durchmesser jeweils) und sauber auf jeder Seite mit 5 ml entionisiertem H 2 O. Halten Probenscheiben in der dominanten Hand mit einer Pinzette und verwenden Sie die Subdominante Hand, um 5 ml auf jeder Seite der Probenplatte pipettieren. Nach Waschen beider Seiten, statt Probenscheiben in ein Becherglas mit 20 ml entionisiertem H 2 O, gefolgt von Ultraschallbehandlung für 1 min. </li><li> Nach der Beschallung Verwendung Pinzette Probenscheiben aus dem Becher zu entfernen. Platzieren der Scheiben, so dass sie lehnen an einem Winkel von 60º gegen die Kante eines offenen Petri Platte auf einem Papiertuch. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale, um die Trockenplatten abdecken. Lassen Scheiben trocknen vollständig, bevor Sie fortfahren. 8 h - Die Trocknungszeit kann zwischen 4 variieren. </li><li> Nach dem Trocknen verwenden Pinzette Probenscheiben in eine Petri-Schale legen. <ol><li> Optional funktionalisieren die Oberflächen der Probenscheiben mit jedem Material (zB Collagen, Hyaluronsäure, Silber-Nanopartikeln, etc.). </li><li> Für dieses Experiment verwendet Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Substratoberfläche. Für poly-L-Lysin-Funktionalisierung Pipetten 200-400 ul 0,1% Poly-L-Lysin (in H 2 O) auf Probeplatten und ließ inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur in einer Petrischale. </li><li> Nach 1 Stunde verwenden Pinzette, um die Probenscheibe zu halten, und wäscht mit 1 ml entionisiertem H 2 O Trocknen lassen auf Küchenpapier, wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Nehmen Sie 2x gewaschen resuspendierten Zellen und Platte 200-400 ul auf Probenscheiben in einem biologischen Sicherheitsschrank. Wenn Probenplatten werden mit Poly-L-Lysin beschichtet sind, inkubiert 0,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Nach Inkubation der Zellen auf Probeplatten, Waschprobenscheiben vorsichtig mit 1 ml entionisiertem H 2 O. Lassen Platten über Nacht trocknen, bevor Bildgebung. </li></ol> 3. KPFM Imaging HINWEIS: Für dieses Experimentverwenden Sie ein Agilent 5500 Serie ILM-AFM. <ol><li> So starten AFM, schalten Sie Rechnereinheit zusammen mit der AFM HEB und MAC-III-Controller. Öffnen AFM-Imaging-Software (zB Agilent PicoView). Achten Sie darauf, wählen Sie zunächst ACAFM oder welcher Wert korrekte Bezeichnung ist auf der AFM für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus. </li><li> Mit AFM Pinzette in der dominanten Hand, halten Sie die gefederte Clip-Halter mit der Subdominante Hand öffnen, setzen Sie ein KPFM Freischwinger in den Kopfstück. Vorsicht beim Umgang mit und die Übertragung der AFM Kopfstück an die AFM, wie dieses Gerät (zumindest auf der ILM 5500-AFM) enthält die fragile Piezokristall Einheit, X, Y, und Z-Scanning Ausrichtungen steuert. HINWEIS: Die KPFM Auslegern in diesem Fall verwendet wurden, waren Mikromasch leitfähigen DPE (geräuscharm) Auskragungen mit durchschnittlichen Resonanzfrequenzen von 80 kHz und die Federkonstanten von 2,7 N / m. Ausleger mit diesen Resonanzfrequenzen und Federkonstanten wurden aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit ausgewählt.Ausleger mit größeren Federkonstanten und höhere Resonanzfrequenzen können auch für die Bildgebung verwendet werden. </li><li> Kopfstück vorsichtig laden in die AFM und schließen Sie die entsprechenden Leitungen (in diesem Fall zwei Leitungen müssen angeschlossen werden: Laserlicht und Bühnenliftmotor). </li><li> Richten Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers. Einige Geräte enthalten eine Kamera-Funktionalität, die für eine einfachere Ausrichtung ermöglicht. Wenn Kamera-Funktionalität ist nicht auf AFM Derzeit richten auf die Cantileverspitze wie beschrieben weiter: <ol><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn, um den Laser überragen Cantilever-Chip zu bewegen. Wenn der Laser den Chip erreicht sie blockiert und nicht mehr sichtbar sein. Nur Drehe ihn ein paar mal. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt erscheint wieder. Der Laser ist jetzt auf die Chiprand. </li><li> Drehen Sie den links-nach-rechts-Knopf, um den Laser auf den Ausleger zu positionieren. Da der Laser über den Ausleger gibt sie wird verschwinden und wieder erscheinen in schneller Folge. Der Laserpunkt sollte in der Milchglasabdeckung, wo der Photodiode Einheit wird später sitzen sichtbar sein. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, um den Ort auf der Cantilever zur Spitze hin bewegen, bis der Punkt auf dem Milchglas verschwindet. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn nur leicht, um den Laser so zu positionieren, dass es sitzt nur auf der Cantilever-Spitze. Der Laserpunkt wird auf dem Milchglas wieder. HINWEIS: Dies ist die Laser-Positionierung Methode zur Sprungbrett Ausleger. Für Dreiecksauslegern unterscheidet sich der Angleichungsprozess leicht. </li></ol></li><li> Nachdem der Laser ausgerichtet ist, halten Sie die Bühne Hubmotor in der Position &quot;offen&quot; für 10 Sekunden, um ausreichend Platz zwischen dem Cantilever und Probe zu gewährleisten, wenn die Befestigung der Probe auf die AFM. </li><li> Zeigen Probe auf dem Probentisch KPFM. Erden Sie die Probe mit einem Kupferdraht. Schließen Sie die entsprechenden Kabel von der AFM auf dem Probentisch. Schließen Sie die sTage an die AFM. In den meisten Fällen ist die Bühne mit Hilfe von Magneten an Ort und Stelle gehalten. </li><li> In der AFM-Software, Melodie beginnt der Ausleger und Ansatz des Auslegerspitze auf die Probe. Stellen Sie sicher, dass die Einschwingzeit bei nicht mehr als 10 ms eingestellt, und dass die Annäherungsgeschwindigkeit nicht 2,0 um / s, um Schäden zu vermeiden Spitze überschreiten. </li><li> Sobald die Cantileverspitze ist auf der Probenoberfläche, wählen Sie eine Bildfenstergröße und ideal Imaging-Bereich. Optimieren I und P Gewinnen zusammen mit dem Ausleger-Sollwert, so dass topographische Abbildung wird optimiert. <ol><li> Sobald topographischen Bild optimiert ist, schalten Sie KPFM Modul (UKW- oder AM-Modus, hier verwenden UKW-Modus). Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung ist sehr anspruchs außerhalb von 5 &amp; mgr; m × 5 &amp; mgr; m-Abbildungsfenster werden. Auch für eine optimale KPFM Imaging, verwenden Sie eine Auflösung von 512 x 512 mit langsamen Scan-Geschwindigkeiten (0,02-0,05 Zeilen / sec). </li></ol></li><li> Für FM-KPFM Einstellungen (nicht ACAFM Einstellungen) Legen Sie das Laufwerk Prozent zwischen 5-10%. Stellen Sie den Ausleger frequency zwischen 1-5 kHz mit einer Bandbreite von 2 kHz. I und P Gewinne für die FM-KPFM Einstellungen auf 0,3%. <ol><li> Vary Signalbandbreite und I- und P-Gewinne zwischen Probenoberflächen. SP-Bildgebung zu optimieren, weiter anpassen Signalbandbreite und I- und P-Gewinne um optimale Bilder zu erhalten. Der empfohlene Bereich von I und P Gewinne von 0,22 bis 0,35%. </li></ol></li><li> Verarbeiten und zu analysieren mit post-Bildverarbeitungs-Software, um Daten zu sammeln SP gesammelt KPFM Bilder. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM wurde als ein neues Verfahren zur Gewinnung von elektrischer Oberflächendaten verwendet. Es wurde allgemein als ein Verfahren zur Untersuchung von Ladungsverteilung in der Chemie verwendet worden und hat erst seit kurzem für die Untersuchung von biologischen Systemen im Mikro- und Nano-Skalen angewendet werden. Aus den gesammelten Daten haben wir festgestellt, dass Mikroben schien nicht leicht befestigen zu reinigen Edelstahl und Gold-Oberflächen, auch nach 3 Stunden der statischen Inkubation. Poly-L-Lysin-funkt...

Biofilme auf Geräteoberflächen und in Hautwunden erzeugt ein Problem darstellen für die medizinische Industrie als Biofilme sind widerspenstig, um die Entfernung und kann zu einer erhöhten Rate der Übertragung von Krankheiten und die Antibiotikaresistenz führen. Befestigung ist der erste Schritt in der Biofilmbildung und ist der wichtigste Schritt aufgrund ihrer Reversibilität 1-3. Substratoberflächeneigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei mikrobiellen Anhaftung. Faktoren, wie Oberflächenhärte, Porosität, Rauhigkeit und Hydrophobie wurde gezeigt, dass die mikrobielle Anbringung zu bewirken; aber wenig Forschung Überprüfung der Rolle der Substratoberfläche Potential (SP) auf die mikrobielle Adhäsion getan wurde 4,5. Negativ geladenen Oberflächen verhindern die Anlagerung von Bacillus thuringiensis Sporen Glimmer, Silicium und Gold-6. Veränderungen der zellulären Membranpotential anzeigt, Veränderungen der zellulären Anhaftung und Motilität 5,7. Es ist, dass elektrisch hom beobachtetogeneous Oberflächen leichter zu fördern mikrobielle Adhäsion 5. Charakterisierung des Oberflächenpotentials von Bakterien im Nano einen neuen Weg, um die Haft Kinetik der Bakterien auf verschiedenen Oberflächen zu verstehen, bereitzustellen, und dadurch kann bei der Entwicklung von Anti-Biobewuchs-Strategien helfen. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Charakterisierung der elektro Kinetik der Bakterien, wie elektrophoretischen Lichtstreuung, Zeta-Potential und isoelektrischen Punktbestimmung verwendet wird, ermöglicht die Prüfung der Einzelzellen anstelle von ganzen Kulturen 8-11 Kelvin-Mikroskop (KPFM). Dies ist von Vorteil, wenn zu wollen Zell-Zell vergleichen oder Biofilm elektrischen Eigenschaften mit hoher Genauigkeit und Präzision. KPFM ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM wurde als eine direkte Folge des Rastertunnelmikroskops (STM) 12 entwickelt. Die ersten veröffentlichten Bilder mit STM wurden von Gerd Binnig und Heinrich Rorhrer 1982 12 gemacht </sup&gt;. Ihre Erfindung konnte atomaren Strukturen von Raster lösen Scannen eines scharfen leitfähigen Spitze über eine leitende Oberfläche in der Luft. Die Auswirkungen der Verwirklichung hochauflösenden Bildern erregt Biologen, die schnell versucht, STM für Bild in getrockneten Proben von DNA, Proteinen und Viren 12 zu verwenden. STM kann auch in Flüssigkeiten mit speziellen Sondenspitzen 13 durchgeführt werden. Dies wurde von Lindsay et al., Die STM und AFM Bild DNA-Moleküle in 10 mM HClO 4 in Wasser, auf Goldelektroden 13 verwendet, gezeigt. KPFM hat bei der Bestimmung der Oberflächenpotentiale von DNA- und Protein-Analyse 25 und Biomolekülen Interaktion mit Liganden 26 gezeigt. KPFM arbeitet durch Messung des Kontaktpotentialdifferenz (CPD) zwischen einem leitenden AFM Cantilever-Spitze und einer ideal leitenden Probe (Abbildung 1, i) 14,15. Proben nicht notwendigerweise leitend (dh biologischen sampl seinn). Imaging kann auf Glimmer, Glas und Siliziumoberflächen (nicht leitend), solange der nicht-leitenden Oberfläche ist dünn, und es ist eine darunterliegende leitende Material 6,7 durchgeführt werden. Die CPD ist äquivalent zu der Oberflächenpotential-Spannung und kann als die Differenz der Austrittsarbeiten zwischen der Spitze (φ Spitze) und der Probe (φ Probe), dividiert durch die negativen Elektronenladung beschrieben (- e). Wenn ein AFM-Spitze in der Nähe einer Probenoberfläche gebracht (getrennt durch Entfernung d) eine elektrostatische Kraft (F s) erzeugt wird infolge des Unterschieds in Fermi Energien (1, II, a) 15. An diesem Punkt sind die Vakuum Energien der Spitze und der Probe (E v) im Gleichgewicht sind und ausgerichtet. Auf die Spitze nach näher an der Probenoberfläche, wobei die Spitze und der Probenoberfläche in elektrischen Kontakt und als Parallelplattenkondensatoren (1, II, b kommen </strong&gt;) 14,15. An der Stelle, die Fermi Energie der Spitze und der Probenoberfläche ausgerichtet werden und erreichte ein stationäres Gleichgewicht (1, II, b). Die Spitze und Probenoberfläche berechnet und eine V CPD bilden sich aufgrund einer Differenz in E v &#39;s und Arbeitsfunktionen. A F es wirkt auf die elektrische Kontaktfläche auf Grund der gebildeten V CPD. Diese Kraft wird nachfolgend durch die Anwendung eines externen V DC bis zur Spitze, die die gleiche Größenordnung wie der gebildete V CPD hat aufgehoben (Abbildung 1, ii, c). Das angelegte Gleichspannung eliminiert Oberflächenladung im Bereich der elektrischen Kontaktierung und der Betrag V DC erforderlich, die F n der V CPD beseitigen gleich der Differenz in den Arbeitsfunktionen zwischen sample Oberfläche und Spitze 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Arbeitsfunktion der Spitze bekannt ist und es wird von den Herstellern zur Verfügung gestellt werden. In allen KPFM Verfahren wird eine Wechselspannung (V AC, etwa 100 - 500 mV) ist auch an der Spitze, um die oszillierenden elektrischen Kräfte zwischen der Spitze und der Probe 14 zu erzeugen. Dies ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Messung von Veränderungen der V CPD und / oder F n. In dieser Hinsicht können Änderungen in der Frequenz oder Amplitude der elektrischen Schwingung von V DC korrigiert werden und das Oberflächenpotential Karten erzeugt werden. Daten aus bestimmten Bereichen dieser Karten können weiter analysiert werden, um elektrische Informationen über bestimmte topographische Merkmale bieten. (1) Hub-Modus, (2) eine Amplitudenmodulation (AM) Modus, und (3) die Frequenzmodulation (FM) Modus 14,16: KPFM kann in drei Betriebsarten betrieben werden. Lift-Modus war der ursprüngliche incarnation von KPFM. Hub-Modus beruht auf einem Zwei-Durchgangs-Verfahren, in dem eine in Schwingungen versetzte Spitze wird über die Oberfläche gezogen, um ein topographisches Bild zu erhalten. Für den zweiten Durchlauf die Spitze einen vorgegebenen Abstand über der Probe erhöht (von 10 bis 100 nm) und zurück über die gleiche Fläche gescannt. Durch diese beiden Pass Verfahren, Lift-Modus, im Vergleich zu AM- und FM-KPFM dauert die längste Zeit für die Bildaufnahme. Die Anhebung der Spitze von der Oberfläche sorgt dafür, dass nur langfristige F es gemessen wird. Auch wird das Übersprechen zwischen Topographie und Oberflächenpotentialmessungen auf Kosten der erhöhten lateralen Auflösung und Empfindlichkeit entkoppelt. AM-KPFM verbessert laterale Auflösung und Empfindlichkeit durch Verwendung von Dual-Frequenzen, um gleichzeitig die Probentopographie und Oberflächenpotential (One-Pass-Scan) 14. Im AM-Modus wird der Ausleger mechanisch oszilliert, in der Regel 5% unter dem ersten Resonanzfrequenz (f 0), und elektrisch oszilliert (turch einen V AC) an seinem zweiten Resonanzfrequenz (f 1). Änderungen in der Amplitude von f 0 führen zur Erzeugung von topographischen Daten, während die Änderungen in der Amplitude der f 1, aufgrund von Änderungen in F n und V CPD geben Oberflächenpotentialmessdaten. f 0 und f 1 des Auslegers sind durch erhebliche Frequenzen und Energien, die Übersprechen minimiert 14 Signal getrennt. Der Kopf der E-Box (HEB) der AFM trennt die zwei Signale sowohl topographische zu geben und Oberflächenpotential Daten gleichzeitig in einem Scan. FM-KPFM verbessert die Auflösung noch weiter als AM-KPFM auf biologischen Oberflächen 14. FM-KPFM funktioniert anders als AM-KPFM, dass es Veränderungen in der elektrostatischen Kraft Gradienten anstatt elektrostatische Kraft (F n) 15 misst. Wie AM-Modus nutzt UKW-Modus Dual-Frequenzen und eine singlE-Pass Scan-Mechanismus topographischen zu erhalten und das Oberflächenpotential Daten gleichzeitig 14. Im UKW-Modus, wird der Ausleger mechanisch f 0 in Schwingung versetzt und bei einer niedrigen Frequenz geändert elektrisch in Schwingung versetzt (f mod, in der Regel 1-5 kHz). Bei der elektrostatischen Wechselwirkungen, f 0 und f MOD MIX zu Seitenbändern f 0 ± f mod zu erzeugen. Diese Seitenbänder sind sehr empfindlich auf Veränderungen der elektrostatischen Kraft und kann von f 0 durch die AFM HEB getrennt werden. Da FM-KPFM misst die Entwicklung elektrostatische Kraft Abstufungen, die Spitzen Spitze Form und seine Wartung / Integrität spielen eine entscheidende Rolle in der Gesamtoberflächenpotential Auflösung 14, 15. Oberflächenpotential Auflösung mit AM- und FM-Modi sind im Bereich von 1 nm seitlich 14 -16. Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung kann in unpolaren Flüssigkeiten durchgeführt werden, und in jüngerer Zeit hat sich gezeigt, in niedriger Ionen (&lt;10 mM) polare Flüssigkeiten durchgeführt werden (in seinOpen-Loop KPFM Modi, die keine ein Vorspannungs-Rückkoppelungs, erübrigt die Anwendung einer DC-Vorspannung) wie MilliQ Wasser; jedoch KPFM Bildgebung noch auf lebende Zellen in polaren Lösungen 17-20 durchgeführt werden. Zusätzliche Herausforderungen SP Abbildungs ​​flüssig verbunden ist, ist, dass die Lösungen üblicherweise zur Aufrechterhaltung Zellen verwendet (dh, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) haben hohe Konzentrationen an beweglichen Ionen, die Faraday-Reaktionen, Bias induzierten Ladungsdynamik und Ionendiffusion / Umverteilungs 20 führen würde. So kann dieses Experiment Messungen wurden von getrockneten und toten MRSA Zellen auf Poly-L-lysin funktionalisiertes Stahl und Gold-Oberflächen aus rostfreiem unter Umgebungsbedingungen gemacht. Imaging kann in Luft oder Vakuum an biologischen Proben, die zuvor getrocknet worden sind, oder auf Oberflächen immobilisiert 20 durchgeführt werden. Feuchten Bedingungen haben auch gezeigt, dass KPFM Bildgebung Flächen 6 beeinflussen. In dieser Studie verwendeten wir FM-KPFMund AFM, die Rolle von SP über das Anbringen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 (MRSA), um Poly-L-lysin funktionalisiertes rostfreiem Stahl und Gold-Oberflächen zu untersuchen. MRSA kurzem erhielt Status als multiresistente (MDR) &quot;Superbazillus&quot; aufgrund ihrer natürlich ausgewählt Beständigkeit gegen viele β-Lactam-Antibiotika und Cephalosporine 21. MRSA-Infektionen sind heute anspruchsvoller, schwer und gewaltig zu behandeln, was zur Verwendung von härteren antimikrobielle Mittel, wie Vancomycin oder Oxazolidinone, die höhere Toxizität beim Menschen, und kann daher nicht als langfristige Behandlungen 22 verwendet werden. Edelstahl wurde wegen ihrer medizinischen Bedeutung und allgemeinem Verwendung als Material in Injektionsnadeln, Bettpfannen, Türgriffe, Waschbecken etc. Gold wurde als Vergleichs verwendete Metall gewählt. FM-KPFM wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob mikrobielle Membran SP ändert sich beim Anbringen an den Substraten.

<table><tbody><tr><td>5500ILM Atomic Force Microscope</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Stainless steel sample discs</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.</td></tr><tr><td>PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Gold sample discs</td></tr><tr><td>PicoView Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td></tr><tr><td>Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Pre-made plates</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.</td></tr></tbody></table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

Oberflächenpotential ist ein häufig übersehen physikalische Eigenschaft, die eine dominante Rolle bei der Adhäsion von Mikroorganismen an Substratoberflächen spielt. Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie (KPFM) ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM), die die Kontaktpotentialdifferenz zwischen Oberflächen im Nanoskala misst. Die Kombination KPFM mit AFM ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung von Oberflächenpotential und topographische Karten von biologischen Proben, wie Bakterienzellen. Hier beschäftigen wir KPFM um die Auswirkungen des Oberflächenpotentials auf die mikrobielle Anhaftung an medizinisch relevanten Oberflächen wie rostfreiem Stahl und Gold zu untersuchen. Oberflächenpotential Karten zeigte Unterschiede in der Oberflächenpotential für mikrobielle Membranen auf unterschiedliche Materialuntergründen. Ein Stufenhöhen Graph wurde erzeugt, um die Differenz des Oberflächenpotentials an einer Grenzfläche zwischen der Substratoberfläche und Mikroorganismen zeigen. Änderungen der zellulären Membranoberflächenpotential haben mit Veränderungen in Verbindung gebracht wordens in den Zellstoffwechsel und Beweglichkeit. Daher stellt KPFM ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Änderungen der mikrobiellen Zelloberflächenpotential auf Haftung auf verschiedenen Substratoberflächen zu untersuchen. In dieser Studie zeigen wir, das Verfahren um das Oberflächenpotential der einzelnen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 Zellen auf rostfreiem Stahl und Gold mit KPFM charakterisieren.

Die Fähigkeit, SP zu messen mit KPFM beruht auf dem Prinzip, dass sowohl die Probenoberfläche und Cantileverspitze leitend zu einem gewissen Grad. Edelstahl und Gold diente als leitende Oberflächen, auf die MRSA wurden angebracht. KPFM Bilder wurden von 15 MRSA-Zellen auf beiden Oberflächen mit 512 x 512 Auflösungen mit Scanbereiche im Bereich von 5 x 5 &amp; mgr; m bis 10 x 10 &amp; mgr; m genommen, und. Abtasten erfolgte mit Liniengeschwindigkeiten im Bereich von 0,02 Zeilen / Sekunde auf 0,05 Zeilen / Sekunde du...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K Aufrufe.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

Serie: Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Umwelt

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für<em&gt; In situ</em&gt; 3D-Mapping der bakteriellen Biofilm Physikalische Eigenschaften

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and chemical composition of sample with nanoscale resolution. By combining AFM with IR, the spatial resolution limitation of conventional IR is overcome, enabling a resolution of 20&#8211;100 nm to be achieved. This opens the door for a broad array of new applications of IR toward probing samples smaller than several micrometers, previously unachievable by means of conventional IR microscopy. AFM-IR is eminently suited for bacterial research, providing both spectral and spatial information at the single cell and intracellular level. The increasing global health concerns and unfavorable future prediction regarding bacterial infections, and especially, rapid development of antimicrobial resistance, has created an urgent need for a research tool capable of phenotypic probing at the single cell and subcellular level. AFM-IR offers the potential to address this need, by enabling detail characterization of chemical composition of a single bacterium. Here, we provide a complete protocol for sample preparation and data acquisition of single spectra and mapping modality, for the application of AFM-IR toward bacterial studies.

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) provides a powerful platform for bacterial studies, enabling to achieve nanoscale resolution. Both, mapping of subcellular changes (e.g., upon cell division) as well as comparative studies of chemical composition (e.g., arising from drug resistance) can be conducted at a single cell level in bacteria.

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Chemie

Co-localizing Kelvin Probe Force Microscopy with Other Microscopies and Spectroscopies: Selected Applications in Corrosion Characterization of Alloys

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin probe, both of which measure the Volta potential difference (VPD) between an oscillating probe tip and a sample surface by applying a nulling voltage equal in magnitude but opposite in sign to the tip-sample potential difference. By scanning a conductive KPFM probe over a sample surface, nanoscale variations in surface topography and potential can be mapped, identifying likely anodic and cathodic regions, as well as quantifying the inherent material driving force for galvanic corrosion.
Subsequent co-localization of KPFM Volta potential maps with advanced scanning electron microscopy (SEM) techniques, including back scattered electron (BSE) images, energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental composition maps, and electron backscattered diffraction (EBSD) inverse pole figures can provide further insight into structure-property-performance relationships. Here, the results of several studies co-localizing KPFM with SEM on a wide variety of alloys of technological interest are presented, demonstrating the utility of combining these techniques at the nanoscale to elucidate corrosion initiation and propagation.
Important points to consider and potential pitfalls to avoid in such investigations are also highlighted: in particular, probe calibration and the potential confounding effects on the measured VPDs of the testing environment and sample surface, including ambient humidity (i.e., adsorbed water), surface reactions/oxidation, and polishing debris or other contaminants. Additionally, an example is provided of co-localizing a third technique, scanning confocal Raman microscopy, to demonstrate the general applicability and utility of the co-localization method to provide further structural insight beyond that afforded by electron microscopy-based techniques.

Kelvin probe force microscopy (KPFM) measures surface topography and differences in surface potential, while scanning electron microscopy (SEM) and associated spectroscopies can elucidate surface morphology, composition, crystallinity, and crystallographic orientation. Accordingly, the co-localization of SEM with KPFM can provide insight into the effects of nanoscale composition and surface structure on corrosion.

Kolokalisierung der Kelvin-Sondenkraftmikroskopie mit anderen Mikroskopien und Spektroskopien: Ausgewählte Anwendungen in der Korrosionscharakterisierung von Legierungen

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin ...

Ingenieurwesen

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Biologie

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Kontaktmodus Rasterkraftmikroskopie als schnelle Technik zur morphologischen Beobachtung und bakteriellen Zellschadensanalyse

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...