Name: surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy
Uploaded: 2014-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
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The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

ガラス製品と文化の作製<ol><li>この実験を進める前に、5％の羊の血液寒天（SBA）MRSAを成長させるためのプレートを準備します。 37℃で24時間、SBAプレートをインキュベートする。この時間の後、単一の、十分に単離したコロニーを液体培地中に後続の接種のために使用されるために存在すべきである。 2ヶ月 - ストア1、4℃で、単一のコロニーを有するSBAプレートにストリーク。 注：羊の血液寒天プレートは20の間を含む既製のパックで来る - メーカーに基づいて25のプレート、そして一般的にVの羊の血液/ wの5％を加えたトリプシン大豆寒天ベースで構成されています。 </li><li>確認トリプシン大豆ブロス（TSB）500mlを、1％グルコースおよび0.1％のNaClを補った。この後、2ガラス試験管に収集し、クリーン。オートクレーブ可能蓋が試験管用できない場合、キャップとしてアルミ箔を使用しています。 1ミリリットルピペットチップの箱と一緒にオートクレーブTSBおよび試験管。 </li><li>安全キャビネットの下やバンズ近くバーナーEN、ピペット以前の5ミリリットルをオートクレーブ処理試験管にTSBオートクレーブ。十分な時間がTSBと試験管を室温まで冷却させるために与えられていることを確実にするように注意してください。以前にストリークし、5％のSBAプレートから、6ミリリットルTSBブロス中に単一コロニーを接種する。一つは、MRSAが含まれ、第二の試験管に無菌性を保証するために、陰性対照として使用される。 </li><li>接種されたTSB試験管に取り、37℃、200rpmで24時間の逆数インキュベーターに置き。は増殖を制御試験管に発生していないはずながら、この時間の後、微生物の増殖は、MRSAの試験管には明らかなはずである。 </li><li>新鮮なTSBの6ミリリットルに24時間の文化やピペットから1ミリリットルを取る。 200rpmで6時間、37℃でインキュベートする。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブにピペットで6時間、サブカルチャーの1ミリリットル。 850×gで3分間遠心。上清を除去し、脱イオンH 2 Oの1ミリリットル中にペレットを再懸濁遠心機は、繰り返し、再懸濁。 </li></ol><ol><li>ステンレス鋼、金AFMサンプルディスク（20 mmで、それぞれ10 mmの直径）を取り、脱イオンH 2 O 5mlで各側を清掃鉗子で利き手でサンプルディスクを保持し、サンプルディスクのそれぞれの側に5ミリリットルをピペットサブドミナント手を使用しています。 1分間の超音波処理によって脱イオンH 2 Oを20mlの入ったビーカーに両側場所サンプルディスクを洗浄した後。 </li><li>超音波処理の後ビーカーからサンプルディスクを削除する鉗子を使用しています。彼らはペーパータオルの上に開いたペトリ皿の端に60°の角度で傾くようにディスクを置きます。乾燥ディスクをカバーするためにペトリ皿の蓋を使用してください。ディスクが先に進む前に、完全に乾燥させます。 8時間 - 乾燥時間は4との間を変化させることができる。 </li><li>乾燥したら、ペトリプレートにサンプルディスクを配置するために鉗子を使用しています。 <ol><li>必要に応じて、どのような材料でサンプルディスクの表面を機能化（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、銀ナノ粒子など ）。 </li><li>この実験では、被覆するために基板表面をポリ-L-リジンを使用する。サンプルディスク上に（H 2 O中）、0.1％ポリ-L-リジンを400μl、およびペトリ皿中で室温で1時間インキュベートさせ-ポリ-L-リジン機能化、ピペット200のために。 </li><li> 1時間後、サンプルディスクを保持し、脱イオンH 2 O 1mlで洗浄するために鉗子を使用してステップ2.2で説明したように紙タオル上で乾燥させます。 </li></ol></li><li> 2X洗浄し、再懸濁した細胞を取り、200プレート - 安全キャビネット内部のサンプルディスク上に400μlのを。サンプルディスクを、ポリ-L-リジンで被覆されている場合は、室温で0.5時間インキュベートする。 </li><li>サンプルディスク上の細胞のインキュベーション後に、脱イオンH 2 O 1mlで穏やかにサンプルディスクを洗うディスクがイメージングの前に一晩乾燥させます。 </li></ol> 3. KPFMイメージング注：この実験では、アジレント5500シリーズILM-AFMを使用しています。 <ol><li> AFMを開始するには、AFMのHEBとMAC IIIコントローラと一緒にコンピュータ·ユニットの電源をオンにします。オープンAFMイメージングソフトウェア（ 例えば、AgilentのPicoView）。最初はACAFMまたはいずれかの正しい指定が断続的接触モードでのイメージングのためのAFMにあるを選択してください。 </li><li>利き手でのAFMピンセットを使用して、サブドミナントの手で開いているばね式クリップホルダーを保持し、ヘッドピースににKPFMカンチレバーを配置。取扱い及び（少なくとも5500 ILM-AFMで）このユニットとしてAFMにAFMヘッドピースを転送するX、Y、Zのスキャン方向性を制御して脆弱なピエゾ水晶ユニットが含まれている場合は注意してください。 注：この場合に使用KPFMのカンチレバーは2.7 N / Mの80 kHzと、スプリング定数の平均共振周波数を持つMikromasch導電DPE（低ノイズ）カンチレバーた。これらの共振周波数とばね定数のカンチレバーによる使用の容易さのために選択した。より大きなバネ定数と高い共振周波数を有するカンチレバーは、イメージングのために使用することができる。 </li><li>慎重にAFMに頭ピースをロードし、（この場合は2本のワイヤで接続される必要がある：レーザー光とステージリフトモータ）適切な配線を接続。 </li><li>カンチレバーの先端にレーザーの位置を合わせます。一部のユニットは簡単に位置合わせが可能になり、カメラの機能が含まれています。カメラ機能は、AFMに存在しない場合、次に説明するように、カンチレバーの先端に位置合わせする。 <ol><li>カンチレバーチップ頭上レーザーを移動するために、前面から背面へのノブを時計回りに回転させます。レーザーは、チップに到達するとそれがブロックされ、表示されなくなります。唯一のノブを数回回す。 </li><li>レーザスポットが再表示されるまで、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。レーザーは、チップの端になりました。 </li><li>カンチレバー上にレーザを配置する左から右へのノブを回します。レーザーはカンチレバー上を通過するとして、それは私が消え、再び表示されますnは矢継ぎ早。レーザスポットは、フォトダイオード部は、後で座って曇りガラスカバーの中に表示されるはずです。 </li><li>曇りガラス上のスポットが消えるまで、先端に向かってカンチレバーをスポットを下に移動し、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。 </li><li>それだけでカンチレバー先端に座るように、レーザを位置決めするために、わずかに前面から背面へのノブを時計回りに回します。レーザスポットは、すりガラスに再表示されます。 注：これは、ダイビングボードカンチレバー用レーザ測位方法である。三角形のカンチレバーの場合は、配向処理がわずかに異なります。 </li></ol></li><li>レーザーが整列されると、AFMにサンプルを装着する際に、カンチレバーと試料との間の十分なスペースを確保するために、10秒間「開」位置でのステージリフトモータを保持する。 </li><li> KPFMの試料ステージ上の試料を置きます。銅線を使用してサンプルを接地してください。試料ステージにAFMから適切な配線を接続します。 Sを接続しますAFMに田下。ほとんどの場合、ステージは、磁石を用いて所定位置に保持される。 </li><li> AFMソフトウェアでは、曲がカンチレバーと、試料にカンチレバー先端のアプローチを開始。セトリング時間は10ミリ秒以下に設定され、そのアプローチ速度がチップの損傷を回避するために、2.0ミクロン/秒を超えないことを保証する。 </li><li>カンチレバーの先端が試料表面上にあると、撮像窓のサイズと理想的な画像領域を選択。地形画像化が最適化されるようカンチレバー設定点と共にI及びPゲインを最適化する。 <ol><li>地形イメージングが最適化されると、（;ここでは、FMモードを使用したFMまたはAMモードのいずれか）KPFMモジュールをオンにします。それはKPFMイメージングが5μm×5μmの撮像窓の外側に非常に困難であることに留意すべきである。 （ - 0.05ライン/秒0.02）。また、最適KPFMイメージングのために、低速走査速度の512×512の解像度を使用します。 </li></ol></li><li> 10％ - FM-KPFM設定（しないACAFM設定）の場合は、5間の駆動パーセントを設定します。カンチレバーfrとを設定する2 kHzの帯域幅5 kHzの - 1の間のequency。 0.3％IとFM-KPFM設定のPゲインを設定します。 <ol><li>信号帯域幅を変化させ、Iと試料表面との間のPゲイン。 SP画像化を最適化するために、さらに最適な画像を得るために信号帯域幅とIとPゲインを調整する。 0.35％ - 私とPゲインの推奨範囲は0.22からです。 </li></ol></li><li>プロセス及びSPデータを収集する後の画像処理ソフトウェアを使用して収集されたKPFM画像を分析する。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM表面電気的データを得るための新規な技術を用いた。これは、一般化学における電荷分布を調べるための方法として使用されており、ごく最近、マイクロおよびナノスケールでの生物学的システムの研究に適用され始めている。収集したデータから、我々は微生物が容易にさえ静的インキュベーションの3時間後に、ステンレス鋼、金表面を洗浄するために添付するようには見えなかった?...

バイオフィルム除去に反抗的であり、疾病伝播および抗菌剤耐性の増加率につながる可能性として機器の表面や皮膚創傷で生産バイオフィルムは、医療業界のための問題を提起する。添付ファイルは、バイオフィルム形成の最初のステップであり、その可逆1-3による最も重要なステップです。基板表面特性は微生物付着上で重要な役割を果たしている。このような表面硬度、気孔率、粗さ、および疎水性のような要因には、微生物付着をもたらすことが示されている。しかしながら、微生物付着の基板表面電位（SP）の役割を調べる研究はほとんど4,5行われている。負に帯電した表面は、雲母、シリコン、金6のバチルス·チューリンゲンシスの胞子の付着を防止する。細胞膜電位の変化は、細胞接着および運動性の5,7の変化を示すものである。これは、電気的にホーンが観察されているogeneous表面がより容易に微生物の付着5を促進する。ナノスケールでの細菌の表面電位を特徴付けることは、様々な表面への細菌の付着の動態を理解するための新規な方法を提供することができ、それにより抗生物付着戦略の開発を助けることができる。そのような電気泳動光散乱、ゼータ電位、及び等電点の決定のような細菌の電気動力学を特徴付けるために使用される他の方法とは異なり、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は全体ではなく培養物8-11の個々の細胞の検査を可能にする。高精度かつ高精度に、細胞 - 細胞または生物膜の電気的特性を比較したい場合に有益である。 KPFMは、原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMは、走査トンネル顕微鏡（STM）12の直接の結果として開発された。 STMを使用した最初の公表の画像は1982年12ゲルト·ビーニッヒとハインリッヒRorhrerにより行った</suP&gt;。彼らの発明は、空気中の導電性表面上に鋭い導電性チップをスキャンするラスターによって原子構造を解決することができました。すぐに乾燥した画像DNA、タンパク質のサンプル、ウイルス12にSTMを使用しようと生物を励起高解像度の画像を達成することの意味。 STMはまた、特殊なプローブチップ13を用いて、液体中で行うことができる。これは、リンジーら 、金電極13上に、10ミリモルのHClO 4中で水に画像DNA分子にSTMおよびAFMを使用することにより示された。 KPFMリガンド26とのDNAおよびタンパク質分析25および生体分子相互作用の表面電位を決定する際に実証されている。 KPFMは、導電性AFMカンチレバーチップと、理想的に導電性のサンプル（ 図1、i）を 14,15との間の接触電位差（CPD）を測定することによって動作する。サンプルは、必ずしも導電性（ すなわち、生物学的なSAMPLである必要はありませんES）。イメージングは、長い非導電性表面が薄いと下地の導電性材料6,7があるのでマイカ、ガラス、シリコン表面（非導通）に行うことができる。 CPDは、表面電位の電圧に相当し、負の電子電荷で割ったチップ（φ 先端 ）と試料（φ サンプル ）の間の仕事関数の差は、として記述することができる（ - E）。導電性AFMチップが試料表面に近づけるとフェルミエネルギーの差（ 図1、二、a）の 15に静電気力（F es を ） が生成され、（距離dだけ分離される）。この時点で、チップと試料の真空エネルギー（E vは ）平衡および整列している。近いサンプル表面に先端をもたらす際に、チップと試料表面が平行平板コンデンサ（ 図1、二、bと電気的に接触し、行為に入る</stronG&gt;）14,15。時点で、チップと試料表面のフェルミエネルギーは、定常状態平衡に達し、整列ようになる（ 図1、二、b）を先端と試料表面が課金されますと、V CPDが原因E V &#39;sとの仕事関数の差に形成することになる。原因形成されたVのCPDへの電気的接触面積上のF ESが機能します。この力は、その後に形成されるV CPD（ 図1、二、c）は同じ大きさを有するチップの外部V DCを印加して無効化する。これは、DC電圧を電気接点の領域に表面電荷がなくなり、V CPDのF エスを排除するために必要なV DCの量は、saの間の仕事関数の差に等しく適用mple表面と先端15。これは、チップの仕事関数が既知であり、それは製造業者によって提供されることに留意すべきである。すべてKPFM方法において、AC電圧（V AC、約100から500 mV）はまた、チップと試料14との間の振動電気力を生成するために、先端に印加される。 VのCPDおよび/ ​​またはF ESの変化を測定する際に良好な分解能を提供する。この点において、電気振動の周波数または振幅の変化は、V DCによって補正することができ、表面電位マップを生成することができる。これらのマップの特定の領域からのデータは、特定の地形的特徴についての電気的情報を提供するために分析することができる。 （1）リフトモード、（2）振幅変調（AM）モード、及び（3）周波数変調（FM）モード14,16：KPFMの3つのモードで動作させることができる。リフトモードは初期INCたKPFMのarnation。リフトモードでは、発振チップが地形画像を得るために、表面上でドラッグした二パス方式に依存している。第二のパスのために先端がサンプル上記所定の距離上げて​​（10から100 nm）をし、同じ領域にわたってスキャンした。これツーパス方法、AM-及びFM-KPFMに比べリフトモードでは、画像取得のために最も長い時間がかかる。表面から離れた先端を上げると、唯一の長距離のF ESが測定されることを保証する。また、地形や表面電位測定間のクロストークが増加し、横方向分解能と感度を犠牲にして分断される。 AM-KPFM同時にサンプル形状と表面電位（ワンパススキャン）14を測定するためのデュアル周波数を使用して、横方向の解像度と感度を改善する。 AMモードでは、カンチレバーが機械的に、一般的に5％（0 f）は、その第1の共振周波数より、発振し、電気的（トン発振するV AC hrough）、その第2の共振周波数（f 1）における。によるFのエス及びVのCPDの変化に対するfの1の大きさの変化は、表面電位測定データを提供しながら、地形データの生成fは0リードの振幅の変化。 f 0はカンチレバーのF 1は、クロストークが14を最小化する重要な信号の周波数およびエネルギーによって分離されている。 AFMの頭部エレクトロニクスボックス（HEB）は、両方の地形を与え、1回のスキャンで同時に潜在的なデータを表面2つの信号を分離する。 FM-KPFMは生体表面14の上にさらにAM-KPFMより解像度が向上します。 FM-KPFMは、静電気力勾配のではなく、静電気力（FのES）15の変化を測定することでAM-KPFMよりも動作が異なります。 AMモードと同様に、FMモードは、デュアル周波数とSINGLを利用地形得ると同時に14を潜在的なデータを表面化電子パス走査機構。 FMモードでは、カンチレバーが機械的にfは0で発振され、電気的に低改変周波数で発振（ モジュレーション fは、典型的には1 - 5 kHzの）。静電相互作用すると、0とf MODミックスF 0±fのmodの F側のバンドを生成する。これらの側波帯は静電気力の変化に非常に敏感であり、AFMのHEBを通じてfは0から分離することができる。 FM-KPFM静電気力勾配の変化を測定するので、先端頂部形状とその保守/完全性は、全体的な表面電位分解能14,15において重要な役割を果たしているAMを使用して潜在的な解像度表面およびFMモードは、横方向に1nmの範囲で14である-16。それはKPFM撮影を中（非極性液体中で行うことができ、そしてより最近では、低イオン性（&lt;10mM）を極性液体で行われることが示されていることに留意すべきであるそのようなMilliQ水としてDCバイアスの印加を不要にバイアスフィードバックを必要としないオープンループKPFMモード）しかしながら、KPFMイメージングは極性溶液17-20の生細胞で行われていない。液体中のSP画像に関 ​​連付けられた追加の課題は、一般的に維持する細胞（ すなわち、リン酸緩衝生理食塩水）のために使用する溶液は、ファラデー反応、バイアス誘起電荷ダイナミクス、イオン拡散/再分配20につながる移動イオンの高濃度を有することである。したがって、この実験のために、測定は、周囲条件下で、ポリ-L-リジン官能化されたステンレス鋼、金表面上で乾燥させ、デッドMRSA細胞から採取した。イメージングは、予め乾燥または表面20上に固定された生物学的サンプルに空気または真空条件下で行うことができる。湿った条件はまた、表面6のKPFMイメージングに影響を及ぼすことが示されている。 本研究では、FM-KPFMを採用そしてAFMは、ポリ-L-リジン官能化ステンレス鋼、金表面へのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100（MRSA）の取り付けにSPの役割を調べた。 MRSAは、最近、多くのβラクタム系抗生物質及びセファロスポリン21にその天然選択された抵抗に多剤耐性（MDR）「スーパーバグ」としての地位を獲得している。 MRSA感染症は、ヒトにおけるより高い毒性レベルを有するバンコマイシンまたはオキサゾリジノンなどの過酷な抗菌剤の使用につながる、今より、厳しい困難、および治療 ​​するのに手強いであるため、長期治療22として使用することができない。ステンレス鋼は、その医療関連性とゴールドは、比較金属として使用されたなどの皮下注射針、便器、ドアハンドル、シンク、材料として一般的な使用のために選ばれました。 FM-KPFMは、微生物膜SPが基板に付着すると変化するかどうかを調べるために利用された。

<table><tbody><tr><td>5500ILM Atomic Force Microscope</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Stainless steel sample discs</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.</td></tr><tr><td>PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Gold sample discs</td></tr><tr><td>PicoView Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td></tr><tr><td>Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Pre-made plates</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.</td></tr></tbody></table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

表面電位は、表面を基板への微生物の付着力に支配的な役割を果たしている物理的特性を一般に見落とされる。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は、ナノスケールでの表面間の接触電位差を測定する原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMとKPFMの組み合わせは表面電位と、細菌細胞などの生体試料の地形図の同時生成を可能にする。ここでは、例えば、ステンレス鋼、金などの医学的に関連する表面への微生物付着に対する表面電位の影響を調べるためにKPFMを採用する。表面電位マップは、異なる材料の基板上での微生物膜の表面電位の違いを明らかにした。ステップ高さのグラフは、基板表面と微生物との間の境界領域での表面電位の差を示すために生成された。細胞膜の表面電位の変化は、変化に関連している細胞代謝と運動性で、S。したがって、KPFMは、様々な基材表面への接着の際に微生物の膜表面電位の変化を調べるために利用することができる強力なツールを表す。本研究では、KPFMを使用してステンレス鋼、金個々のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100細胞の表面電位を特徴付けるための手順を示す。

KPFMを使用してSPを測定する能力は、試料表面とカンチレバーチップの両方がある程度導電性であるという原理に依存している。ステンレススチールとゴールドは、MRSAが取り付けられていたように導電性表面を務めた。 KPFM画像は512×512の解像度を持つ、と5×5ミクロンから10×10μmの範囲のスキャン領域と両面に15 MRSA細胞から採取された。走査は、0.02ライン/秒から0.05ライン/秒の範囲のライン?...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K ビュー.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

生物工学

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

環境学

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em&gt;その場での</em細菌バイオフィルム物性&gt; 3Dマッピング

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and chemical composition of sample with nanoscale resolution. By combining AFM with IR, the spatial resolution limitation of conventional IR is overcome, enabling a resolution of 20&#8211;100 nm to be achieved. This opens the door for a broad array of new applications of IR toward probing samples smaller than several micrometers, previously unachievable by means of conventional IR microscopy. AFM-IR is eminently suited for bacterial research, providing both spectral and spatial information at the single cell and intracellular level. The increasing global health concerns and unfavorable future prediction regarding bacterial infections, and especially, rapid development of antimicrobial resistance, has created an urgent need for a research tool capable of phenotypic probing at the single cell and subcellular level. AFM-IR offers the potential to address this need, by enabling detail characterization of chemical composition of a single bacterium. Here, we provide a complete protocol for sample preparation and data acquisition of single spectra and mapping modality, for the application of AFM-IR toward bacterial studies.

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) provides a powerful platform for bacterial studies, enabling to achieve nanoscale resolution. Both, mapping of subcellular changes (e.g., upon cell division) as well as comparative studies of chemical composition (e.g., arising from drug resistance) can be conducted at a single cell level in bacteria.

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

化学

Co-localizing Kelvin Probe Force Microscopy with Other Microscopies and Spectroscopies: Selected Applications in Corrosion Characterization of Alloys

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin probe, both of which measure the Volta potential difference (VPD) between an oscillating probe tip and a sample surface by applying a nulling voltage equal in magnitude but opposite in sign to the tip-sample potential difference. By scanning a conductive KPFM probe over a sample surface, nanoscale variations in surface topography and potential can be mapped, identifying likely anodic and cathodic regions, as well as quantifying the inherent material driving force for galvanic corrosion.
Subsequent co-localization of KPFM Volta potential maps with advanced scanning electron microscopy (SEM) techniques, including back scattered electron (BSE) images, energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental composition maps, and electron backscattered diffraction (EBSD) inverse pole figures can provide further insight into structure-property-performance relationships. Here, the results of several studies co-localizing KPFM with SEM on a wide variety of alloys of technological interest are presented, demonstrating the utility of combining these techniques at the nanoscale to elucidate corrosion initiation and propagation.
Important points to consider and potential pitfalls to avoid in such investigations are also highlighted: in particular, probe calibration and the potential confounding effects on the measured VPDs of the testing environment and sample surface, including ambient humidity (i.e., adsorbed water), surface reactions/oxidation, and polishing debris or other contaminants. Additionally, an example is provided of co-localizing a third technique, scanning confocal Raman microscopy, to demonstrate the general applicability and utility of the co-localization method to provide further structural insight beyond that afforded by electron microscopy-based techniques.

Kelvin probe force microscopy (KPFM) measures surface topography and differences in surface potential, while scanning electron microscopy (SEM) and associated spectroscopies can elucidate surface morphology, composition, crystallinity, and crystallographic orientation. Accordingly, the co-localization of SEM with KPFM can provide insight into the effects of nanoscale composition and surface structure on corrosion.

ケルビンプローブ力顕微鏡と他の顕微鏡および分光法との共局在化:合金の腐食特性評価における選択されたアプリケーション

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin ...

工学

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

生物学

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

要約

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原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

ケルビンプローブ力顕微鏡と他の顕微鏡および分光法との共局在化:合金の腐食特性評価における選択されたアプリケーション

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

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原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

ケルビンプローブ力顕微鏡と他の顕微鏡および分光法との共局在化:合金の腐食特性評価における選択されたアプリケーション

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化