Dieses Protokoll zeigt die Verwendung der Kontaktmodus-Rasterkraftmikroskopie zur Beobachtung von Veränderungen in der Zellmorphologie aufgrund einer bestimmten Krankheit oder Behandlung. Es wird dringend empfohlen, für dieses Verfahren versiegelte Behälter zu verwenden, um eine Kontamination zu vermeiden, und die fixierte Probe so schnell wie möglich zu analysieren, um eine Alterung zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Fixierung der Proben auf dem Objektträger, indem Sie den Objektträger mehrmals vorsichtig über eine Flamme führen, bis die Probe trocken ist.
Legen Sie die fixierten Proben in eine Petrischale und transportieren Sie sie zur Beobachtung zum Rasterkraftmikroskop. Schalten Sie als Nächstes den Computer und das Rasterkraftmikroskop ein. Wählen Sie dann den Kontaktmodus, die ContAI-G-Sonden und die Optionen für die automatische Steigung in der Software aus.
Legen Sie die Standardwerte für den Z-Regler fest, indem Sie den Sollwert auf 20 Nanometer, die P-Verstärkung auf 10.000, die I-Verstärkung auf 1.000, die D-Verstärkung auf Null und die Spitzenspannung auf null Millivolt einstellen. Bringen Sie die Proben mit dem 70-Mikrometer-Scanbereichskopf in den AFM-Kontaktmodus. Verschaffen Sie sich einen schnellen Überblick über die Oberfläche des Bereichs unter der Sonde, indem Sie eine Kamera verwenden, die auf zwei in den Scankopf integrierten Linsen montiert ist.
Wählen Sie nun den gewünschten Bereich aus, indem Sie ihn manuell in der XY-Ebene verschieben. Lassen Sie die Sonde elektronisch an die Probenoberfläche heranfahren, bis der Kontakt erreicht ist. Passen Sie die XY-Messebene des Scanners und der Probenoberfläche elektronisch an, indem Sie die XY-Neigungsrichtung verringern.
Stellen Sie die Standardparameter der Software auf eine Zeile pro Sekunde und 256 Punkte pro Zeile ein. Führen Sie dann einen vollständigen Scanbereich von 70 x 70 Mikrometern durch. Wählen Sie den kleineren Bereich mit dem Zoom-Werkzeug aus.
Wählen Sie einen neuen Bereich aus der Probe aus, indem Sie den Ausleger elektronisch zurückziehen und die Probe entlang der XY-Ebene bewegen. Führen Sie dann einen neuen Scan durch, wie zuvor gezeigt. Verwenden Sie anschließend den zeilenweisen Abgleich im Werkzeugmenü des Bildes in der Filterauswahl, um die Datenverarbeitung durchzuführen.
Optimieren Sie die maximale und minimale Höhe in der Farbleiste, um die beste Bildauflösung zu erhalten. Führen Sie abschließend die Bildanalyse über das Analysemenü durch. Wählen Sie den Anfangs- und Endpunkt mit dem gewünschten Werkzeug aus, um die Länge und den Abstand zu bestimmen.
Rasterkraftmikroskopische Analysen der Bakterienkulturen zeigten, dass die Staphylococcus aureus-Kulturen nach Zonen mit Kokkenaggregaten verteilt waren. Vergrößerte Skalen zeigten, dass die Populationsverteilung und die Kokkenmorphologie besser eingeschätzt wurden. Die AFM-Kontaktmodenbilder ermöglichten die Bestimmung der Größe der Kokken, die eine durchschnittliche Breite von 1,25 Mikrometern aufwiesen.
Pseudomonas hunanensis zeigte eine homogene Verteilung auf der gesamten Glasträgerfläche und bildete eine adhärente Monoschicht. Die Kulturen waren stäbchenförmig mit einer Länge von 1,9 Mikrometern und einer Breite von 0,9 Mikrometern. Die Mikroverdünnung von Magnesiumoxid-Nanopartikeln von Staphylococcus aureus führte zum Verlust einer glatten Oberfläche und homogener Konturen aufgrund einer starken Verschlechterung der Zellstruktur.
Die Vesikelbildung und die Freisetzung von zytosolischem Material wurden in Kulturen in höheren Konzentrationen als der MHK beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden in E. coli-Kulturen erzielt, wobei die Kontrollen glatte Oberflächen zeigten, die ihre homogene stäbchenförmige Form hervorhoben. Die Struktur verschwand bei einer Nanopartikelbelichtung von 1.000 ppm vollständig, wobei nur noch Silhouetten erkennbar waren.
Es ist wichtig, die Probenfixierung korrekt durchzuführen, da dies für die weitere Analyse unerlässlich ist. Der Bildfilter sorgt für eine gute Bildauflösung und Probendetails. Mit der Befestigungsmethode konnten berührungslose AFM-Modi angewendet werden, die bei der Untersuchung mechanischer Eigenschaften hilfreich sein können.
Diese Methodik könnte ein kostengünstiges und nützliches Werkzeug für die medizinische und mikrobiologische Forschung sein, die sich auf die Analyse bakterieller Zellschäden konzentriert.
