The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Preparazione di cristalleria e culture <ol><li> Prima di procedere con questo esperimento, preparare agar sangue 5% di pecora (SBA) piastre per coltivazione MRSA. Incubare le piastre SBA per 24 ore a 37 ° C. Dopo questo periodo, singoli, colonie ben isolate dovrebbero essere presenti per essere utilizzato per le successive vaccinazioni in mezzi liquidi. Conservare striato piastre SBA con singole colonie a 4 ° C per 1 - 2 mesi. NOTA: piastre di agar sangue di pecora sono disponibili in confezioni precostituiti contenenti da 20 - 25 piastre base al produttore, e tipicamente costituiti da una base di soia agar Tryptic con l&#39;aggiunta di 5% w / v di sangue di pecora. </li><li> Fare 500 ml di brodo di soia trittico (TSB) supplementato con 1% di glucosio e 0,1% NaCl. Dopo questo, raccogliere e pulire 2 provette di vetro. Se coperchi autoclavabili non sono disponibili per provette, usare fogli di alluminio come un cappuccio. Autoclave TSB e provette insieme a una scatola di punte per pipette 1 ml. </li><li> Sotto un armadio biosicurezza o vicino ad una Bunsen bruciatore pipetta 5 ml di precedentemente sterilizzati in autoclave TSB in provette in autoclave. Attenzione a garantire che il tempo è stato dato a lasciare il TSB e provette raffreddare a temperatura ambiente. Da un 5% piastra SBA precedenza striato, inoculare una singola colonia in 6 ml di brodo TSB. Una conterrà MRSA, e la seconda provetta sarà utilizzato come controllo negativo per garantire la sterilità. </li><li> Prendere provette inoculate prova TSB e metterli in un incubatore reciproca per 24 ore a 37 ° C ea 200 rpm. Dopo questo tempo la crescita microbica dovrebbe essere evidente nella provetta MRSA mentre nessuna crescita dovrebbe essersi verificato nella provetta di controllo. </li><li> Prendere 1 ml di cultura 24 ore e trasferirli in 6 ml di TSB fresco. Incubare a 37 ° C per 6 ore a 200 rpm. </li><li> Pipettare 1 ml di 6 ore sub-cultura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare per 3 min a 850 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di H 2 O. deionizzata Centrifuga, ripetere, e ri-sospensione. </li></ol><ol><li> Prendere acciaio e dischi campione oro AFM (20 mm e 10 mm di diametro rispettivamente) e pulire ogni lato con 5 ml di H 2 O. deionizzata Tenere dischi campione nella mano dominante con una pinza e utilizzare la mano sottodominante pipettare 5 ml su ciascun lato del disco campione. Dopo aver lavato entrambi i lati, dischi campione posto in un becher contenente 20 ml di H 2 O deionizzata seguita da sonicazione per 1 min. </li><li> Dopo l&#39;uso sonicazione pinze per rimuovere i dischi campione dal bicchiere. Posizionare i dischi in modo che si affacciano ad un angolo di 60 ° contro il bordo di una piastra di Petri aperta su un tovagliolo di carta. Utilizzare il coperchio della piastra Petri per coprire i dischi di essiccazione. Lasciate asciugare completamente i dischi prima di procedere. Il tempo di asciugatura può variare tra 4 - 8 ore. </li><li> Una volta asciutto, usare il forcipe per inserire i dischi di campioni in una piastra di Petri. <ol><li> Facoltativamente, funzionalizzare le superfici dei dischi campione con qualsiasi materiale (ad esempio, collagene, acido ialuronico, argento nano-particelle, ecc). </li><li> Per questo esperimento, utilizzare poli-L-lisina per rivestire la superficie del substrato. Per poli-L-lisina funzionalizzazione, pipette 200-400 ml di 0,1% di poli-L-lisina (in H 2 O) su dischi di esempio, e lasciate incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una piastra di Petri. </li><li> Dopo 1 ora, utilizzare pinze per tenere il disco del campione, e lavare con 1 ml di H 2 O. deionizzata Lasciate asciugare su carta assorbente come descritto al punto 2.2. </li></ol></li><li> Prendere 2x cellule ri-sospeso lavati e piastra 200-400 ml su dischi di campioni all&#39;interno di un armadio biosicurezza. Se dischi campione sono rivestiti con poli-L-lisina, incubare per 0,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Dopo incubazione di cellule su dischi campione, lavare dischi campione delicatamente con 1 ml di H 2 O. deionizzata Lasciate asciugare i dischi durante la notte prima di imaging. </li></ol> 3. KPFM Imaging NOTA: Per questo esperimento,utilizzare una serie Agilent 5500 ILM-AFM. <ol><li> Per iniziare AFM, accendere il gruppo computer con HEB e MAC III controllore della AFM. Software di imaging aperto AFM (ad esempio, di Agilent PicoView). Assicurarsi di selezionare inizialmente ACAFM o qualsiasi denominazione corretta è sulla AFM per l&#39;imaging in modalità intermittente contatto. </li><li> Utilizzando pinze AFM nella mano dominante, e tenendo premuto il supporto a clip a molla aperto con la mano sottodominante, inserire un cantilever KPFM in testa al pezzo. Prestare attenzione durante la manipolazione e il trasferimento del capo-pezzo AFM al AFM come questa unità (almeno sul 5500 ILM-AFM) contiene l&#39;unità di cristallo piezoelettrico fragile che controlla X, Y, Z e direzionalità scansione. NOTA: I cantilever KPFM utilizzati in questo caso sono stati Mikromasch DPE conduttivo (basso rumore) cantilever con frequenze medie di risonanza di 80 kHz e primaverili costanti di 2,7 N / m. Cantilever con queste frequenze di risonanza e costanti primaverili sono stati scelti per la loro facilità d&#39;uso.Cantilevers con costante elastica più grandi e più elevate frequenze di risonanza possono essere utilizzati anche per l&#39;imaging. </li><li> Sistemare con cura testa pezzo al AFM e collegare i fili appropriati (in questo caso due fili bisogno di essere collegato in: luce laser e motore di sollevamento stadio). </li><li> Allineare il laser sulla punta del cantilever. Alcune unità contengono una funzionalità della telecamera, che agevola l&#39;allineamento. Se la funzionalità della fotocamera non è presente su AFM, allineare sulla punta cantilever come descritto di seguito: <ol><li> Ruotare il front-to-back in senso orario per spostare il laser sovrastano il chip a sbalzo. Quando il laser raggiunge il chip verrà bloccato e non sarà più visibile. Solo ruotare la manopola un paio di volte. </li><li> Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario fino a quando il punto laser riappare. Il laser è ora sul bordo del chip. </li><li> Ruotare la manopola sinistra a destra per posizionare il laser sul cantilever. Come il laser passa sopra il cantilever sarà scomparire e riapparire in rapida successione. Il punto laser deve essere visibile nella copertura di vetro smerigliato in cui l&#39;unità fotodiodo sarà poi sedersi. </li><li> Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario per spostare il punto lungo la mensola verso la punta fino a quando il punto sul vetro smerigliato scompare. </li><li> Ruotare la manopola front-to-back solo leggermente in senso orario per posizionare il laser in modo che esso si trova appena sulla punta cantilever. Lo spot laser riapparirà sul vetro smerigliato. NOTA: Questo è il metodo di posizionamento laser per cantilever trampolino. Per a forma triangolare, il processo di allineamento è leggermente diversa. </li></ol></li><li> Una volta che il laser è allineato, tenere il motore fase di sollevamento in posizione &quot;aperto&quot; per 10 sec per garantire spazio sufficiente tra la mensola e del campione durante il fissaggio del campione alla AFM. </li><li> Posizionare campione sul palco del campione KPFM. A terra il campione utilizzando un filo di rame. Collegare i cavi appropriati dalla AFM alla fase di campionamento. Collegare le stage alla AFM. Nella maggior parte dei casi la fase viene tenuto in posizione mediante magneti. </li><li> Nel software AFM, sintonizzare il cantilever e poi iniziare approccio della punta cantilever al campione. Assicurarsi che tempo di assestamento è fissato a non più di 10 msec, e che velocità di avvicinamento non superi 2,0 micron / sec per evitare danni punta. </li><li> Una volta che la punta è sbalzo sulla superficie del campione, selezionare una dimensione della finestra di imaging e area di esposizione ideale. Ottimizzare i guadagni I e P con il set point a sbalzo in modo che l&#39;immagine topografica è ottimizzato. <ol><li> Una volta che l&#39;imaging topografico è ottimizzato, accendere il modulo KPFM (FM o AM, qui, utilizzare la modalità FM). Va notato che l&#39;imaging KPFM è molto impegnativo esterna della finestra di imaging x 5 micron 5 micron. Inoltre, per l&#39;imaging ottimale KPFM, utilizzare una risoluzione di 512 x 512 con basse velocità di scansione (,02-,05 linee / sec). </li></ol></li><li> Per le impostazioni FM-KPFM (non ACAFM impostazioni), impostare la percentuale di auto tra il 5 - 10%. Impostare il fr cantileverequency tra: 1 - 5 kHz con una larghezza di banda di 2 kHz. Set I e P guadagni per le impostazioni FM-KPFM al 0,3%. <ol><li> Variare la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni tra le superfici dei campioni. Per ottimizzare SP immagini, regolare ulteriormente la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni per ottenere immagini ottimali. La gamma raccomandata di guadagni I e P sono 0,22-0,35%. </li></ol></li><li> Elaborare e analizzare le immagini raccolte KPFM utilizzando il software di elaborazione post-immagine per raccogliere i dati SP. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM è stato impiegato come una tecnica innovativa per ottenere dati elettrici di superficie. È stato comunemente usato come metodo per l&#39;esame distribuzione di carica in chimica ed è solo recentemente iniziato da applicare per lo studio di sistemi biologici della micro e nano-scale. Dai dati raccolti abbiamo scoperto che i microbi non sembrano collegare facilmente per pulire le superfici in acciaio inox e oro, anche dopo 3 ore di incubazione statica. Superfici funzionalizzate Poly-L-lisina mostrato attacco rapid...

I biofilm prodotto sulle superfici attrezzature e nelle ferite cutanee rappresentano un problema per l&#39;industria medica come biofilm sono recalcitranti alla rimozione e può portare a un aumento dei tassi di trasmissione di malattie e la resistenza antimicrobica. Attachment è il primo passo nella formazione di biofilm e è la fase più critica a causa della sua reversibilità 1-3. Caratteristiche della superficie del substrato svolgono un ruolo cruciale sull&#39;attaccamento microbica. Fattori quali la durezza superficiale, porosità, rugosità, e idrofobicità hanno dimostrato di effettuare attaccamento microbica; Tuttavia, poche ricerche esaminare il ruolo potenziale di superficie del substrato (SP) sulla adesione microbica è stato fatto 4,5. Superfici cariche negativamente prevenire l&#39;attacco di spore di Bacillus thuringiensis per mica, silicio, oro e 6. Le variazioni del potenziale di membrana cellulare sono indicativi delle variazioni di attaccamento cellulare e motilità 5,7. È stato osservato che hom elettricamentesuperfici ogeneous promuovere più facilmente microbica adesione 5. Caratterizzazione del potenziale superficiale di batteri su nanoscala può fornire un nuovo modo di comprendere la cinetica adesione dei batteri alle varie superfici, e quindi possono facilitare lo sviluppo di strategie anti-incrostanti. A differenza di altri metodi utilizzati per la caratterizzazione della cinetica elettro di batteri, come dispersione elettroforetico luce, potenziale zeta, e determinazione del punto isoelettrico, Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) consente per l&#39;esame di singole cellule invece di intere culture 8-11. Questo è vantaggioso quando si vuole confrontare cellula-cellula o biofilm caratteristiche elettriche con elevata accuratezza e precisione. KPFM è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM). AFM è stato sviluppato come risultato diretto del microscopio a effetto tunnel (STM) 12. Le prime immagini pubblicate utilizzando STM sono stati fatti da Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer nel 1982 12 </sup&gt;. La loro invenzione è stata in grado di risolvere le strutture atomiche da raster scansione di una punta conduttiva affilata su una superficie conduttiva in aria. Le implicazioni di ottenere immagini ad alta risoluzione biologi che rapidamente tentato di usare STM per immagini campioni essiccati di DNA, proteine ​​e virus 12 eccitato. STM può essere fatto anche in liquidi con punte di controllo specializzati 13. Questo è stato dimostrato da Lindsay et al., Che usava STM e AFM di immagini molecole di DNA in 10 mM HClO 4 e in acqua, su elettrodi di oro 13. KPFM è stata dimostrata nel determinare i potenziali superficiali di DNA e proteine ​​analisi 25 e biomolecole interazione con ligandi 26. KPFM opera misurando la differenza di potenziale di contatto (CPD) tra una punta cantilever AFM conduttivo e un campione idealmente conduttivo (Figura 1, i) 14,15. I campioni non devono necessariamente essere conduttivo (cioè, sampl biologicaes). Imaging può essere eseguita su mica, vetro, e superfici di silicio (non conduttivi), purché la superficie non conduttiva è sottile e non vi è un materiale conduttivo sottostante 6,7. Il CPD è equivalente al potenziale di tensione superficiale e può essere descritto come la differenza nelle funzioni di lavoro tra la punta (tip φ) e il campione (campione φ), diviso per la carica dell&#39;elettrone negativo (- e). Quando una punta AFM conduttivo viene portato vicino ad una superficie del campione (separati da distanza d), viene generata una forza elettrostatica (es F) a causa della differenza di energia di Fermi (Figura 1, ii, a) 15. A questo punto, le energie vuoto della punta e del campione (E v) sono in equilibrio e allineato. Su portando la punta più vicino alla superficie del campione, la superficie della punta e del campione entrano in contatto elettrico e agiscono come condensatori a piastre parallele (Figura 1, ii, b </strong&gt;) 14,15. Al punto, le energie di Fermi della superficie punta e del campione diventano allineate, raggiungendo un equilibrio di stato stazionario (Figura 1, ii, b). Sarà addebitato la superficie punta e campione e un CPD V formerà a causa di una differenza di funzioni E s &#39;contro e di lavoro. Una atti F es sull&#39;area di contatto elettrico a causa della V formata CPD. Questa forza viene successivamente annullato attraverso l&#39;applicazione di un DC V esterna alla punta che ha la stessa grandezza della V CPD formata (figura 1, ii, c). Questa tensione continua applicata elimina carica superficiale nella zona di contatto elettrico, e la quantità di V cc necessaria per eliminare gli es F di V CPD è pari alla differenza tra le funzioni di lavoro tra l&#39;sadi superficie mple e mancia 15. Va notato che la funzione di lavoro della punta è noto ed è fornito dai produttori. In tutti i metodi KPFM, una tensione AC (V AC, circa 100 - 500 mV) viene applicato anche alla punta per generare forze elettriche oscillanti tra la punta e il campione 14. Ciò fornisce una migliore risoluzione per la misurazione dei cambiamenti della V CPD e / o F ES. A questo proposito, cambiamenti nella frequenza o ampiezza di oscillazione elettrica possono essere corretti V DC, e la superficie mappe potenziali possono essere generati. I dati provenienti da specifiche aree di queste mappe possono essere ulteriormente analizzati per fornire informazioni elettrici su specifiche caratteristiche topografiche. KPFM può essere utilizzato in tre modi: (1) modalità ascensore, modalità (2) modulazione di ampiezza (AM), e (3) modulazione di frequenza (FM) modalità 14,16. Modalità Ascensore era il inc inizialearnation di KPFM. Modalità di sollevamento si basa su un metodo a due passaggi in cui una punta oscillata viene trascinato attraverso la superficie per ottenere un&#39;immagine topografica. Per il secondo passaggio della punta viene sollevata una distanza prefissata al di sopra del campione periodo (10 - 100 nm) e scansione indietro attraverso la stessa area. Grazie a questo metodo a due passaggi, modalità di sollevamento, rispetto al AM- e FM-KPFM, richiede più tempo per l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Aumentare la punta lontano dalla superficie assicura che solo a lungo raggio F es viene misurato. Inoltre, cross talk tra i potenziali misure di topografia e di superficie è disaccoppiato a scapito di una maggiore risoluzione laterale e sensibilità. AM-KPFM migliora la risoluzione laterale e la sensibilità utilizzando dual-frequenze per misurare simultaneamente la topografia del campione e il potenziale di superficie (scansione one-pass) 14. In modalità AM, il cantilever è oscillato meccanicamente, generalmente 5% di sotto della sua prima frequenza di risonanza (f 0), e oscillare elettricamente (tttraverso un V AC) alla sua seconda frequenza di risonanza (f 1). Le variazioni di ampiezza di f 0 portano alla generazione di dati topografici, mentre le variazioni di ampiezza di f 1, dovute a variazioni es F e V CPD, danno potenziali dati di misura di superficie. f 0 e f 1 del cantilever sono separati da frequenze significative ed energie che segnale di cross-talk 14 è minimizzato. La centralina di testa (HEB) della AFM separa i due segnali per dare sia topografica e la superficie dei dati potenziali contemporaneamente in una sola scansione. FM-KPFM migliora la risoluzione anche oltre AM-KPFM su superfici biologiche 14. FM-KPFM funziona in modo diverso rispetto AM-KPFM in che misura l&#39;andamento gradienti forza elettrostatica piuttosto che forza elettrostatica (es F) 15. Come modalità AM, FM utilizza dual-frequenze e un single-pass meccanismo di scansione per ottenere topografica e di superficie dati potenziali simultaneamente 14. In modalità FM, il cantilever viene fatto oscillare meccanicamente ed elettricamente f 0 oscillare ad una bassa frequenza modificata (f mod, tipicamente: 1 - 5 kHz). Su interazioni elettrostatiche, f 0 e f mod mix per produrre bande laterali f 0 ± f mod. Queste bande laterali sono molto sensibili alle variazioni di forza elettrostatica, e possono essere separati da f 0 a HEB del AFM. Dal FM-KPFM misura l&#39;andamento gradienti forza elettrostatica, la punte forma apice e la sua manutenzione / integrità giocano un ruolo critico nella superficie complessiva potenziale risoluzione 14, 15. Surface potenziale risoluzione usando AM e FM sono nel range di 1 nm laterale 14 -16. Va notato che l&#39;imaging KPFM può essere realizzata in liquidi non polari, e, più recentemente, è stato dimostrato essere fatto in (&lt;10 mm) liquidi polari bassa ionico (inKPFM modalità ad anello aperto che non richiedono una valutazione polarizzazione, ovviando l&#39;applicazione di una polarizzazione CC) come acqua MilliQ; tuttavia, l&#39;imaging KPFM deve ancora essere fatto su cellule vive in soluzioni polari 17-20. Sfide aggiuntivi associati SP imaging liquido è che le soluzioni comunemente utilizzati per le celle mantenimento (cioè, tampone fosfato salino) hanno alte concentrazioni di ioni mobili, che porterebbero a reazioni faradica, dinamiche carica di polarizzazione indotta, e la diffusione di ioni / ridistribuzione 20. Quindi, per questo esperimento, le misurazioni sono state prese da cellule MRSA essiccati e morti su superfici funzionalizzate inox poli-L-lisina acciaio e oro in condizioni ambientali. Imaging può essere effettuata in condizioni di aria o di vuoto su campioni biologici che sono stati precedentemente essiccati o immobilizzati sulle superfici 20. La presenza di umidità hanno anche dimostrato di influenzare l&#39;imaging KPFM di superfici 6. In questo studio, abbiamo impiegato FM-KPFMe AFM di esaminare il ruolo della SP per il sequestro di meticillino-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) per superfici in acciaio inox e oro funzionalizzate poli-L-lisina. MRSA ha recentemente ottenuto lo status di multi-farmaco resistente (MDR) &quot;superbug&quot; per la sua resistenza naturale selezionato a molti antibiotici β-lattamici e cefalosporine 21. Infezioni da MRSA sono ora più impegnativo, difficile, e formidabile per trattare, portando all&#39;utilizzo di antimicrobici severe come la vancomicina o oxazolidinoni che hanno livelli elevati di tossicità nell&#39;uomo, e pertanto non può essere utilizzato come trattamenti a lungo termine 22. L&#39;acciaio inossidabile è stato scelto per la sua rilevanza medica e di uso comune come materiale in aghi ipodermici, padelle, maniglie delle porte, lavandini, ecc L&#39;oro è stato utilizzato come un metallo comparativa. FM-KPFM è stato utilizzato per esaminare se la membrana microbica SP cambia su attaccamento ai substrati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5500ILM Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9435S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16219</td>
			<td>Stainless steel sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td>
			<td style="width:71px;">Mikromasch</td>
			<td style="width:119px;">#HQ:DPE-XSC11</td>
			<td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.&#160; We utilized cantilever B for experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16218-G</td>
			<td>Gold sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PicoView Software</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797B</td>
			<td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pico Image Software (Pico Image Basic)</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797AU-1FP</td>
			<td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#91201513</td>
			<td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#221261</td>
			<td>Pre-made plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#257107</td>
			<td>Comes as a dry powder.&#160; Instruction on how to make come on the container.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

Potenziale di superficie è una caratteristica fisica comunemente trascurato che gioca un ruolo dominante nella adesione di microrganismi sul supporto, superfici. Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM), che misura la differenza di potenziale contatto tra le superfici a scala nanometrica. La combinazione di KPFM con AFM consente la generazione simultanea di potenziale di superficie e le mappe topografiche di campioni biologici come le cellule batteriche. Qui, ci avvaliamo di KPFM per esaminare gli effetti del potenziale di superficie su adesione microbica di superfici medicalmente rilevanti quali acciaio e oro. Potenziali mappe superficiali hanno rivelato differenze nel potenziale di superficie per membrane microbiche su diversi supporti materiali. Un grafico step-altezza è stato generato per mostrare la differenza di potenziale di superficie in una zona di confine tra la superficie del substrato e microrganismi. Variazioni cellulare potenziale di superficie di membrana sono stati collegati con il cambiamentos nel metabolismo e la motilità cellulare. Pertanto, KPFM rappresenta un potente strumento che può essere utilizzato per esaminare le variazioni di potenziale di superficie della membrana microbica su aderenza a varie superfici del substrato. In questo studio, dimostriamo la procedura per caratterizzare il potenziale superficie delle singole celle Staphylococcus aureus meticillino-resistenti USA100 su acciaio e oro con KPFM.

La capacità di misurare SP utilizzando KPFM si basa sul principio che sia la superficie del campione e punta cantilever conduttivo sono in una certa misura. Acciaio e oro agito come superfici conduttive cui MRSA sono stati attaccati. KPFM immagini sono state prese di 15 celle MRSA su entrambe le superfici con 512 x 512 risoluzioni, e con aree di scansione da 5 x 5 micron a 10 x 10 micron. La scansione è stata effettuata con velocità di linea vanno da 0,02 linee / sec a 0,05 linee / sec. Pertanto, con 512 punti di dat...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K Views.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

Video: Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Ricerca

Bioingegneria

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...