Diese Arbeit wird von RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) im Rahmen eines Sonderforschungsvereinbarung mit der Wake Forest University School of Medicine finanziert. GL Prasad ist ein Vollzeit-Mitarbeiter von RJRT.

HINWEIS: Eine schriftliche Einverständniserklärung, diese Studie zu tun, wurde in einem örtlichen klinischen Forschergruppe unter IRB-Zulassung erhalten, pro Good Clinical Practices. Verarbeitung von Blut, werden Isolierung von PBMCs und andere Zellkulturexperimenten unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung von mikrobiologisch Sterilgut und Reagenzien. 1. WS-CM Herstellung <ol><li> Generieren WS-CM, wie zuvor beschrieben 12. <ol><li> Bereiten Sie WS-CM, indem Rauch von vier 3R4F Referenz Zigaretten über Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium ohne Phenolrot mit dem folgenden Raucher-Regime: 35-60-2, puff Volumen in ml, Blätterteig-Intervall in Sekunden, und puff Dauer in Sekunden auf. Jedes Präparat erzeugt eine 20 ml Probe. </li></ol></li><li> Label-Röhre (n) mit Datum, Uhrzeit abgeschlossen und Zigaretten Name und Nummer. Bewahren Sie die 500 ul Aliquots bei -80 ° C unmittelbar nach dem Rauchen beendet ist. </li><li> Analysieren Sie Teilmengen von gefrorenem WS-CM, Um die Mengen an Nikotin, spezifischen Nitrosamine und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben 12. </li></ol> 2. Isolierung von PBMCs <ol><li> Sammeln Sie frisches Blut von gesunden Spendern (der nicht-Konsumenten von Tabakerzeugnissen sind) Isolieren PBMCs von frischem Blut, wie nachstehend unter einer separaten Genehmigung von der Wake Forest Baptist Health IRB 15 beschrieben. <ol><li> Vor der Ankunft des Blutbeutels, eine 500 ml Flasche, Schere, Isolationspuffer und Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (RT) bereit, in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Zellkultur Kapuze. Isolation Puffer muss vor Licht geschützt werden. </li><li> Halten Sie den Blutbeutel auf den Kopf und schneiden Sie das Rohr direkt unter, wo es eingespannt worden ist, bleibt mindestens 3 cm Schlauch. </li><li> Entfernen Sie die Kappe von der 500 ml Flasche und halten Sie den Schlauch über der Flaschenöffnung. Nehmen Sie den Blutbeutel und invertieren, damit das Blut ungehindert aus dem Beutel in t fließener die Flasche, bis der Beutel leer ist. Lassen Sie das Blut auf die Innenwand der Flasche gegenüber gerade nach unten zu fließen, wie um zu vermeiden, Blasen. </li><li> Gießen Sie Isolierungspuffer in die Flasche zu einem 1: 5-Verhältnis von Isolierungspuffer, um Blut. Verschließen Sie die Flasche fest und vorsichtig umdrehen es, end-over-end, 10-mal. Lassen Sie die Flasche in der Zellkultur Haube mit Beleuchtung inkubiert aus, für 1 h bei RT. </li><li> Ein leichtes, strohgelbe Schicht wird über dem Blut aufzubauen. Entfernen Sie diese Schicht unter Verwendung einer 25 ml serologische Pipette in 50 ml konische Röhrchen. Der gesammelte Betrag kann variieren von 50 - 300 ml, je nach dem Gegenstand, die Blut gespendet. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 200 x g für 10 min bei RT. </li><li> Saugen Sie das durchscheinende Überstand, so dass die dunkle Blutfarbenen Pellets. Das Pellet wird lose aber viskos sein. </li><li> Pipette 3 ml Isolationspuffer in 15 ml konische Röhrchen. </li><li> Zu dem Pellet, 20 ml DPBS für je 50 ml strohfarbene Flüssigkeit in s gesammelttep 2.1.5. Vortex, um gründlich zu mischen, und Konsolidierung des resuspendierten Flüssigkeit aus mehreren Rohren. Diese Flüssigkeit suspendiert Blutkörperchen enthält. </li><li> Mit einer Transferpipette Transfer 5 ml der suspendierten Blutzellen auf 3 ml Isolationspuffer in Schritt 2.1.8. Kippen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, die die Zellsuspension enthält langsam und sanft, zwei getrennte Schichten zu schaffen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 400 × g für 40 min bei RT mit minimalen Beschleunigungs- und ohne Bremse. </li><li> Verwenden einer Transferpipette, die entstehende trübe Mittelschicht (buffy coat) enthält PBMCs in ein 50 ml konisches Röhrchen zu entfernen. Vermeiden Zeichnung andere klare Schichten darunter. Bringen Sie nicht mehr als 25 ml in jede 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 25 ml kaltem Puffer, um die Zellen zu waschen (oder mehr, die gesamte Restvolumen der 50 ml konischen Röhrchen zu füllen). Zentrifugiere die Zellen bei 400 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet mit 10 ml Laufpuffer. Diese enthält PBMCs. Zählen Sie die Zellen, und verwenden Sie immittelbar oder auf Eis zum Einfrieren. </li></ol></li></ol> 3. Einfrieren und Auftauen der PBMCs <ol><li> Zentrifugation der PBMCs, die in Schritt 2.1.13 für 10 min bei 400 x g gesammelt wurden. </li><li> Füllen Sie den Gefrierbehälter mit Isopropylalkohol pro Anweisungen des Herstellers. ACHTUNG: Isopropylalkohol ist brennbar und akut toxisch. </li><li> Das Pellet mit RPMI 1640-Medium (4 ° C), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Dies ist RPMI 1640 Einfriermedium. Das Pellet mit einer Menge an Gefriermedium, das in einer Suspension mit ca. 5 x 10 7 Zellen / ml auf. Die Anzahl der Zellen zum Einfrieren kann abweichen. </li><li> Dispense 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 2 ml Kryoröhrchen und legen Sie die Kryoröhrchen im Gefrierbehälter. Stellen Sie das Gefrierbehälter mit Kryoröhrchen in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis O / N zu speichern und entfernen Sie die Kryoröhrchen und Transfer zum in einem GeschäftTiefkühlschranks zwischen -150 ° C bis -190 ° C. </li><li> Entfernen der Kryoröhrchen aus kryogenen Lagerung und Auftauen rasch unter leichtem Rühren in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li><li> Die aufgetauten PBMCs in Kryoröhrchen sofortige Umsetzen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640 Komplettmedium (4 ° C), das 10% FBS, 1% Pen / Strep und 1% L-Glutamin. Der Inhalt des aufgetauten Kryoröhrchen sollte so schnell wie möglich übertragen werden, um eine maximale Lebensfähigkeit der Zellen 15 zu erhalten. </li><li> Zentrifugieren PBMCs bei 400 × g für 10 min. </li><li> Das Pellet mit 5 ml RPMI 1640 Komplettmedium und zählen Sie die Zellen. </li><li> Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch etablierte Verfahren wie Trypanblau-Ausschluss-Verfahren. Allgemein Zellviabilität bei dieser Methode ist zu 90 bis 95%. Die PBMCs können nun in Experimenten verwendet werden. </li></ol> 4. Cell Death Bestimmung HINWEIS: Verdünnungen hier aufgeführten sind für die Zwecke dieses study. Die Verdünnungen können entsprechend geändert werden. <ol><li> Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung, wie unten angegeben. </li><li> Verdünne WS-CM auf die folgenden Konzentrationen: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, und 5 ug / ml in gleichem Nikotin Einheiten (basierend auf der Nikotingehalt in WS-CM) 12. </li><li> Verdünne Nikotin in RPMI-Medium mit den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend. </li><li> 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein. </li><li> Für die Zwecke dieser Studie bereiten zwei Sätze von Platten, wie oben. Decken Sie die Platten und Inkubation eine Platte für 24 Stunden und eine Platte für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Passen Zeitpunkte wie nötig. </li&gt; <li> Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt. </li><li> Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 &amp; mgr; l 7-Aminoactinomycin D (7AAD) in jede Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> 100 l Laufpuffer zum Cluster Rohre. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und erwerben die Proben am Durchflusszytometer. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software. </li></ol> 5. EC 50 Bestimmung <ol><li> Die EC 50 -Werte von WS-CM und Nikotin werden von 7AAD-positive Färbung von PBMCs bestimmt. </li><li> Der EC 50 Wert wird als konzentrierte definiertentration, bei der 50% der Zellen wurden in einem 24-Stunden-Test nicht mehr lebensfähig, und die Werte sind als &amp; mgr; g equi-Nikotin-Einheiten / ml ausgedrückt. </li><li> Für die Zwecke dieser Studie wurden die EC 50 -Werte bestimmt als 1,56 &amp; mgr; g / ml und 1,650 &amp; mgr; g / ml für WS-CM und Nikotin auf. </li></ol> 6. Zytokine HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden. <ol><li> Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten. </li><li> Verdünne Nikotin an den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend. </li><li> 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung.Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein. </li><li> Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte bedeckt und schließlich Suspendieren der Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer und Wiederholen der Waschschritt noch einmal. </li><li> Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Nach Zugabe von 200 ul von 10 ug / ml LPS Medium zu jeder Vertiefung. </li><li> Die Platte und Inkubation für 4 h, 24 h, 48 h oder 72 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Einzustellen Inkubationszeiten wie nötig. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min. </li><li> Nehmen Sie 175 ul des Überstands aus jeder Vertiefung und an einem Gefrierschrank bei -80 ° C, um die Tests in den Schritten 7 und 8 durchzuführen. </li></ol> 7. Cytometric Bead Array Assay &lt;ol&gt; <li> Tauen die Zellüberstände aus Schritt 6.10 und den Einsatz in der CBA Assay vorbereitet. Führen Sie die Cytometric Bead Array (CBA) Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 8. IL-8-ELISA <ol><li> Tauen die Zellüberstände aus Schritt 6.10 und den Einsatz in der IL-8-ELISA. Führen der ELISA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 9. intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden. <ol><li> Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten. </li><li> In der gleichen Platte, verdünnten Nikotin den folgenden Konzentrationen: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 und 4000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umwelt hazardous. </li><li> 100 l PBMCs in RPMI-Vollmedium suspendiert bei einer Konzentration von 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein. </li><li> Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt. </li><li> Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium auf die Platte, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Bereiten Sie die Arbeitskonzentrationen von 2 ul / ml GolgiPlug und 10 ug / ml LPS mit RPMI Komplettmedium und 200 ul in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren der Platte für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Am Ende von Schritt 9.8, Waschen der Zellen mit Laufpuffer (4 ° C) und Schleudern bei 300g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> 100 l Cytofix in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen werden 3 Mal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben. </li><li> Hinzufügen 45 ul 1x Cytoperm zu jeder Vertiefung, gefolgt von 5 ul jeder einer der folgenden Antikörper zu jeder Vertiefung: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) und einmal mit Laufpuffer (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben. </li><li> Die Zellen werden mit 200 ul 2% igem Paraformaldehyd (4 ° C). Übertragen Sie die Zellen in 12 × 75 mm Rohre, und die Proben auf Flow Cytometer analysiert. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ätzend, akut giftig und gesundheitsschädlich. </li></ol> 10. K562 Töten Assay HINWEIS: K562 Zellen sollten kultiviert werdenin der Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 mit RPMI Komplettmedium, bis sie bis zu 80% Konfluenz vor dem Assay. <ol><li> Bereiten Sie eine 5 mM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) Stammlösung durch Zugabe von 18 &amp; mgr; l DMSO in das Fläschchen. </li><li> Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung zu den gewünschten gleichwinklig Nikotineinheiten oder Nikotinkonzentrationen für jede Vertiefung zu erzielen. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend. </li><li> 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium in einer Konzentration von 1,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen, die mit WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein. </li><li> Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die K562-Zellen durch Zugabe von 10 ml DPBS und Zentrifuge bei 400 × g für 8 Minuten bei RT. </li><li> Die Zellen mit 10 ml DPBS und zählen Sie die K562-Zellen. </li><li> Bereiten CFSE working Lösung durch Zugabe von 1 ul CFSE-Stammlösung zu 1 ml DPBS. </li><li> 1 ml des CFSE-Arbeitslösung in 1 ml der K562-Zellsuspension, die 1 - 2 x 10 7 Zellen. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT. </li><li> Sofort im 200 ul FBS. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT. </li><li> 10 ml RPMI Komplettmedium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand RPMI und brechen die Pellets und die Zellen werden mit 10 ml RPMI Komplettmedium und zählen Sie die CFSE-markierte K562-Zellen. </li><li> Durch Zentrifugieren der Platte bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der PBMCs. Saugen Sie den Überstand durch Dekantieren der Flüssigkeit. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte. Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium und ein weiteres Mal wiederholen Waschschritt. </li><li> Hinzufügen CFSE-markierte K562-Zellen in einem Verhältnis von 1:15 (100.000 K562s: 1.5 x 10 6 PBMCs) in jede Probenvertiefung der PBMC Platte und weiteren incubate 5 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der Zellmischung. Saugen Sie den Überstand durch die Flüssigkeit verworfen. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte. </li><li> Fügen Sie 200 ul des Laufpuffers und wiederholen Sie die in Schritt 10,14 noch einmal beschrieben Waschschritt. </li><li> Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 ul 7AAD zu jeder Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Füge 100 ul Laufpuffer in jede Vertiefung und übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und Zytometer erwerben die Proben auf Fluss. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positive und CFSE-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software. </li></ol>

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The authors declare that there are no conflicts of interest.

Wir und andere haben vorher gezeigt, dass die Behandlung der PBMCs mit TPPs drückt mehreren Antworten, von denen die Expression und Sekretion von Zytokinen und funktionellen Maßnahmen wie Ziel zelltötende 14. Die in der bisherigen Arbeit beschriebenen experimentellen Methoden erfordern längere Inkubationszeiten und waren bescheiden in der Größe 14. Angesichts der potentiellen Anwendungen dieser attraktiven ex vivo Modell für Grundlagen- und angewandten Forschung haben wir untersucht...

Ein wesentlicher Körper des Wissens verweist auf die negativen gesundheitlichen Auswirkungen von chronischen Zigarettenrauchen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und Krebs 1,2. Chronischen Rauchens ist bekannt, Entzündung und Immunsuppression verursachen, und diese Veränderungen werden berichtet, um zu einer erhöhten Gefahr der mikrobiellen Infektion und Krebs bei Rauchern 3 beitragen. In-vitro- und ex-vivo-Techniken nützlich sind bei der Aufklärung der molekularen Grundlage der pathophysiologischen Wirkungen Zigarettenrauch 4-9 (Tabelle 1) und werden als wichtige Instrumente zur Führung des Schwellen Regulierung verschiedener Tabakwaren 10,11 anerkannt. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass brennbare Tabakprodukt Zubereitungen (TPPs) wie Vollrauch konditioniertes Medium (WS-CM) und die Gesamtpartikelmaterial (TPM) sind weitaus zytotoxische und schädlich fürDNA als nichtbrennbar TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten wurde kürzlich berichtet, dass brennbare TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten, die wir vor kurzem berichtet, dass brennbare TPPs verursacht deutliche Immunsuppression. Dies wurde durch die Suppression der Toll-like Rezeptor (TLR) -Liganden belegt, stimuliert Zytokinsekretion und Zielzelle (K562) Tötung durch PBMCs in einem ex vivo-Modell 14. Angesichts der Bedeutung der Entzündung im Zigarettenrauch induzierten Krankheitsprozesse wird eine weitere Optimierung der Testbedingungen, die immunmodulatorische Wirkung von Zigarettenrauch zu bewerten in diesem Bericht. Die ex-vivo-Untersuchungen in der Regel gemessen und intrazelluläre Zytokine sowie die zytolytische Funktion von zytotoxischen T und NK-Zellen in K562-Zellen zu töten Assays 14. Die Assays beteiligt Vorinkubation mit WS-CM und Nikotin und nachfolgende Stimulation von PBMCs mit TLR-Agonisten über einen Zeitraum von 3 Tagen; die endgültige Auslesen durchgeführt werden unter Verwendung von Enzym-Immuntests (ELISAs) und / oder Durchflusszytometrie. Wir verwendeten bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS), die TLR-4-Rezeptoren bindet und stimuliert PBMCs, was zur Produktion von intrazellulären Cytokinen und Sekretion von Zytokinen. Zusätzlich zur Optimierung der verschiedenen Assayschritte zum Auswerten der immunmodulatorischen Wirkung von TPPS präsentieren wir auch Verfahren zur Isolierung von PBMCs, Zelltodassays und IL-8 Quantifizierung. Diese Methoden angewendet werden, um andere Forschungsfragen anzugehen und weiter verfeinert, um Tabakwaren in der Regelungszusammenhang zu bewerten. Tabelle 1 veröffentlichte Berichte über In-vitro- und Ex-vivo-Methoden zur Varilux pathophysiologischen Wirkungen von Tabakprodukt Vorbereitungen studieren CS, Zigarettenrauch Medium. CSC, Zigarettenrauch Kondensat; CSE, Zigarettenrauch-Extrakt; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; qPCR, quantitative Polymerase-Kettenreaktion; RT, Echtzeit quantitative Polymerase-Kettenreaktion; TS, Tabakrauch. <table><tbody><tr><td> Autor (Studienjahr) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Erden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Verwendeten Zellen </td><td> Menschen bronchiale Endothelzellen (BEAS-2B), humanen Neutrophilen </td><td> Menschen Alveolarepithelzellen (A549) </td><td> Menschlichen glatten Atemwegsmuskulatur (HASMC) </td><td> Menschen premonocytic U937-Zellen, menschlichen Monozyten </td><td> Alveolaren Typ II Epithelzellen (ATII) </td><td> Humanen monozytärenZellinie (THP-1), menschliche Lungenmakrophagen </td></tr><tr><td> TPP verwendet </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Methode verwendet </td><td> ELISA, qPCR, Migration, Elektroschalt </td><td> Immunhistochemische Chemie, Elektrophorese Array Kit, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, Elektrophorese </td><td> Gel-Mobility-Shift- </td><td> Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Elektrophorese, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, E-toxate Kits (Sigma), p65-Platten-Assay (TransAM), Elektrophorese, verschiedenen Immunoassay-Kits </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, Migration </td><td> Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, NF-kappaB, IL-8, pI &amp; kgr; B-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, Eotaxin </td><td> Hitzeschock / Stressproteine ​​(HSP / Hsp70), HF-Transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α </td><td> Surfactant Protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-Phosphorylierung cJun: DNA-Bindung, Glutathion, p65: DNA-Bindung </td></tr><tr><td> Endergebnis </td><td> CSE herunterreguliert Zytokin-Produktion durch Unterdrückung der AP-1-Aktivierung. </td><td> H 2 O 2 und CSC verbessern Acetylierung von Histon-Proteine, zu verringern Histon-Deacetylase-Aktivität, differenziell reguliert proinflammatorische Zytokin-Freisetzung. </td><td> Zigarettenrauch kann die Freisetzung von IL-8 aus HASMC, durch TNF-α, 20% CSE weniger IL-8-Freisetzung, Hemmung der Eotaxin und RANTES erweitert durch Zigarettenrauch verursacht. </td><td> TS aktiviert HF Transkriptionsfaktor, der mit Hsp70-Überexpression und Hemmung der NFkB-Bindungsaktivität und TNF-α Freisetzung assoziiert war. </td><td> Reduzierte ATII Zellen abgeleiteten Chemokin Ebenen Kompromisse alveolar Reparatur, einen Beitrag zur Zigarettenrauch induzierten Alveolarschaden und Emphysem. </td><td> Daten liefern mechanistische Erklärung dafür, warum Raucher haben erhöhte Atmungsinfektionen. Unterdrückung des unspezifischen Reaktion wird durch einen Anstieg der IL-8 begleitet. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Unter anderen pathophysiologischen Veränderungen, chronische Exposition gegenüber Zigarettenrauch verursacht Entzündungen und Immununterdrückung, die mit einer erhöhten Anfälligkeit von Rauchern um mikrobielle Infektionen und Tumorhäufigkeit in Verbindung gebracht wurden. Ex-vivo-Unterdrückung der Rezeptor-vermittelten Immunantworten in humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit Rauchbestandteile behandelt ist ein attraktiver Ansatz für die Mechanismen untersuchen und bewerten die möglichen langfristigen Auswirkungen der Exposition gegenüber Tabakwaren. Hier optimierten wir Methoden zur Ex-vivo-Tests unter Verwendung von PBMCs durch bakterielles Lipopolysaccharid, ein Toll-like Rezeptor-4-Liganden stimuliert durchzuführen. Die Auswirkungen der ganze Rauch-konditioniertes Medium (WS-CM) wurde eine brennbare Tabakprodukt Zubereitung (TPP) und Nikotin auf die Zytokinsekretion und die Zielzelle Tötung durch PBMCs in den ex-vivo-Tests untersucht. Wir zeigen, dass Zytokine IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 und IL-8 und intrazellulären Cytokinen IFN-47 ;, TNF-α und MIP-1α in WS-CM-belichteten PBMCs drückt. Die cytolytische Funktion von Effektorzellen PBMCs, wie durch einen K562 Targetzelle töten Assay bestimmt wurde ebenfalls durch Einwirkung von WS-cm verringert; Nikotin war minimal wirksam in diesen Assays. Zusammenfassend stellen wir eine Reihe von verbesserten Assays, um die Auswirkungen TPPs in ex-vivo-Untersuchungen zu bewerten und diese Methoden ohne weiteres zur Prüfung andere Produkte von Interesse angepasst werden.

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (vier Spenderproben) dargestellt. Des Studenten-t-Tests zwischen den behandelten und unbehandelten Kontrollproben wurde unter Verwendung von Excel-Software sowie die T-Testvergleiche für alle Behandlungen mit ihren entsprechenden Kontrollen. Die statistische Signifikanz wurde angegeben: * P &lt;0,05; ** P &lt;0,005; *** P &lt;0,0005. Um den Effekt der Einwirkung von WS-CM und Nikotin zu messen, wurden PBMCs mit verschied...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K Aufrufe.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

Serie: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Design von Cecal Ligation und Punktion und Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...