The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.

Bu protokol 10 fareler 10 7 ARAÇ T hücreleri, her ile tedavi edilir bir deneysel tasarım dayanmaktadır. Bu durum, 10 8 ARAÇ T hücreleri gerektiği anlamına gelir; verim canlılığı kaybı hesabına 5 x 10 7 -1 x 10 8 tarafından abartılmıştır edilmelidir. Aşağıdaki protokol yaklaşık 200 x 10 6 hücre oluşturmak için ölçeklenir. Hücreler daha sonra, mevcut KR158B astrositom veya B 16 melanoma hücre hatları geliştirilen, 9 gün kurulmuş singeneik EGFRvIII pozitif kafatası içi tümörlerine sahip dişi C57BL / 6 farelerine damar içinden tatbik edilir. Buna paralel ARAÇ T hücresi üretimi ile, tümör taşıyan farelerin lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) ve WBI (16.5 Gy) klinik açıdan anlamlı dozlarda tatbik edilmektedir. Fareler muhafaza ve Duke Üniversitesi Tıp Merkezi (DUMC) ile patojensiz şartlar altında yetiştirildi. Tüm hayvan deneyleri Duke Üniversitesi Kurumu tarafından onaylanan protokollere göre yapıldıEl Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC). Tümör taşıyan fareler için temozolomidin 1. İdare Gün ile 4 0: <ol><li> Farelerin sayısı enjekte edilecek hesaplayın ve yayılma (16.5 mi TMZ hesaba (örneğin, 30 farenin x 0,5 ml = 15 mi TMZ) ihtiyaç TMZ çözeltisi miktarını belirlemek ve bu birime 1.5 mi eklemek için 0.5 ile çarpın ). </li><li> 3 mg bu toplam hacmi çarpın / ml gerekli liyofilize TMZ ağırlığını belirlemek için (örneğin, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). 50 ml&#39;lik konik içine bu tartılır. DİKKAT: TMZ inhalasyon, sindirim ve gözlerle, cilt ile temasında ve mukozal membranlar tarafından toksiktir. Maruz kalma riskini azaltmaya yönelik öneriler için kurumun iş güvenliği ve / veya çevre sağlığı ve sağlıklı yaşam departmanı danışın. </li><li> Dimetil sülfoksit hacmini belirlemek için 0.15 ile toplam hacmi çarpın (DMSO) (örn, 16.5 x gerekli0.15 = 2,475 mi DMSO). Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron filtre içinden DMSO Bu hacim (artı yayılma için hesap ilave 2 ml) içinde sterilize edilir. TMZ toz, steril DMSO 2,475 mL ekleyin. </li><li> 10-15 dakika süre ile 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde, su içinde bir çanak içinde TMZ / DMSO çözeltisi yerleştirin. TMZ tamamen çözüldükten sonra çözelti, renk soluk sarı bir olmalıdır; Çözelti pembe olursa, o zaman TMZ parçalanır ve yeni bir solüsyon TMZ taze bir çok hazırlanmalıdır. </li><li> Toplam hacmi (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml serum fizyolojik) tarafından 0.85 çarpılarak gerekli steril serum fizyolojik uygun hacmini hesaplayın. 50 ml&#39;lik bir konik steril tuzlu su içinde 15 ml ilave edilir. TMZ DMSO, 65 ° C ısı tuzlu su içinde eritilmesi iken. </li><li> Girdap TMZ / DMSO çözeltisi TMZ tozu tamamen çözündürüldü ve yavaş yavaş TMZ / DMSO çözeltisi ısıtılmış tuzlu su eklemek olduğundan emin olmak için. </li><li> Hemen hazırlandıktan sonra, tam 15 x 1 ml tüberkülin syring yük4 gün yerleşik tümör taşıyan farelere tatbikat için TMZ çözeltisi ile es. </li><li> Beş TMZ idarelerinin toplam 4 arasındaki günlerde 1 bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> Tümör taşıyan fareler 2. Tüm Beyin Işınlama Gün 2 ile 4: <ol><li> X-ışını irradiator Güç ve ısınma tam gerilime izin verir. Uygun filtre yeri ve giriş doğru voltaj ve akım ayarları (Şekil 2A) olduğundan emin olun. NOT: irradiator ve dozimetre gerilim ayarları ve ızgara düzeni (Şekil 2A, B) Uygun belirlemek için önceden tesis edilmelidir. </li><li> 5.5 Gy X-ışınlarıyla neden gerekli süreyi hesaplayın. X-ışınları 2 Gy / dk&#39;lık bir hızda verilmektedir, örneğin, daha sonra 2.75 dakika 5.5 Gy toplam sağlamak için gereklidir. Giriş uygun zaman süresi. Not: Tablo 2 fare WBI bir ölçerleri sağlarİnsanlarda ND klinik benzerleri. Yüksek dereceli gliomlarda bağlamında, 60 Gy TBI (6 hafta boyunca 2 Gy fraksiyonları, 5 gün / hafta) parçalandı bakım klinik standart ve burada kullanılan kemirgen eşdeğer 16.5 Gy (Gy x 3 5.5) &#39;dir. </li><li> 2 mi ketamin ve nihai çözelti, 10 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin olduğu şekilde, 1 ml ksilazin mi 17 tuzlu su ekleyerek sistemik anestezi için, ketamin / ksilazin taze bir çözelti hazırlayın. </li><li> Fareler tartılır ve hayvanlar 100 mg / kg ve 10 mg / kg ksilazin ile ketamin dozu almış gibi vücut ağırlığının gramı başına karın içinden ketamin / ksilazin 10 ul yönetmek. Fareler tamamen uyuşturulmuş ve gözle görülür ketamin / ksilizin yönetiminin 2 dakika içinde nefes olmalıdır. </li><li> Sedasyon hayvanlarda göz nemi korumak için, yavaşça her göz yapay gözyaşı merhem küçük bir miktar sürün. </li><li> Kafaları en yüksek X-ray aldığı alanda konumlandırılmış şekilde ızgara üzerinde sedasyon fareler yerleştirintensit (Şekil 2B, C). Aşağı uygun olan boyundan kalkan organları sistemik X-ışını teslim (Şekil 2B) engellemek için kurşun boru büyüklüğünde. </li><li> Izgara düzeni X-ışını demetinin odak noktasını gösteren lazer koordinat (0,0) olacak şekilde X-ışını altında konumlandırılmış fareler yerleştirin. X-ışını teslim başlayın. </li><li> X-ışını teslim tamamlandığında, sıcak ısıtma yastığı irradyatör ve yerden hayvanları kaldırın. Hayvanlar sternum recumbence korumak için yeterli bilinci yerine kadar bilinçli hayvanlar ile sedasyon hayvanları ev etmeyin. Hayvanlar, sternum recumbence korumak geri uygun kafeslerinde bilinçli hayvanları yerleştirebilirsiniz kez. </li><li> Radyasyon üç bölünmüş dozlarda olmak üzere toplam gün 3 ve 4 bu prosedürü yineleyin. </li></ol> 3. Transfeksiyon Gün -1: <ol><li> Dulbecco M, 500 ml, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ilave edilerek D10 ortamı hazırlamakdeğişmemiş Eagle Ortamı (DMEM). </li><li> 500 ml RPMI-1640 ortamı için 5,5 ml L-glutamin, 5.5 ml sodyum piruvat, 5.5 mi temel olmayan amino asitler ve 5,5 ml penisilin / streptomisin (pen / strep) ilave edilerek, T hücre ortamı (TCM) hazırlayın. Daha sonra, 2-merkaptoetanol ve 550 ul gentamisin 550 ul ilave edin. Son olarak, 50 mi FBS ekleyin. </li><li> Hasat, in vitro kültürlenmiş HEK293T hücreleri ve D10 ortam içinde 7.5 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona getirin. </li><li> Levha 10 mi D10 ortamı ve 16 x 10 cm, poli-D-lisin (PDL) kaplı plakalar her HEK293T hücre süspansiyonu 1 ml. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> Gün 0: <ol start="6"><li> Hücreleri transfecting önce 10 ml taze D10 en az 30 dakika Ortamı değiştirin. </li><li> + 1 (= 17 + 16 1) 14.1 ng plakalar toplam sayısı ile çarpılarak transfeksiyon için gerekli olan vektör plazmidinin miktarı, PCL-Çevre vektörü ve lipozomal transfeksiyon reaktifi belirlemekvektör plazmid (14.1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9.9 ug PCL-Eko vektörü (9.9 x 17 = 168,3 mikrogram) ve 60 ul lipozomal transfeksiyon reaktif (60 x 17 = 1.020 ul). Tüm reaktifler çözeltilerin hazırlanması önce oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Tüp A içinde iki boruyu, A ve B Etiket 239,7 ug vektör plazmidi ile (1.5 x 17) ile 168.3 mg PCL-Çevre vektörü eklemek indirgenmiş serum kartal ortamı (RS-MEM) modifiye ml olmuştur. Tüp B&#39;de, (1.5 x 17) ml&#39;lik RS-MEM 1020 ul lipozomal transfeksiyon reaktif ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrı ayrı A ve B inkübe edin. </li><li> (1-2 saniye boyunca girdap ya da birkaç kez ters çevirin) hafifçe bir arada A ve B karıştırın ve lipid / DNA kompleksi oluşturmak üzere oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 cm&#39;lik bir tabakta HEK293T hücrelere damla Lipid / DNA kompleksi damla ekleyin. </li><li> 6-8 saat için 37 ° C&#39;de inkübe veya gece (24 saat aşmayın). </li><li> 6-8 saat kuluçkadan sonra viral üretim için taze TCM 12 ml orta yerine. Bu medya kaplamaT hücre transdüksiyonu için viral süpernatan olarak 2 gün kullanılacaktır. </li></ol> 4. splenektomi ve T-hücresinin hazırlanması Gün 0: <ol><li> Dalak toplama süre ile buz üzerinde 50 ml konik ve yerine TCM 10 ml dökün. </li><li> CO2 asfiksiyasyonu ve ikincil başları kesilerek hayvanların uygun sayıda Kurban: Talep hayvanlar Amerikan Veteriner Tıp Derneği kılavuzlar (en fazla 5 hayvan olabilir başına% 10-30 kafes hacim / dakikalık bir akış hızında CO2 alan bir kafeste solunum sonlandığı kadar ve bundan sonra iki dakika için) aynı anda kurban. CO 2 odasından hayvanları kaldırın ve başını kesmek. Not: Yaklaşık 4.5-5 x 10 7 splenositlerin verecek bir 6-12 haftalık dişi C57BL / 6 fare dalak biri. Burada, 4 dalakları yaklaşık 200 x 10 6 hücre hasat edilir. </li><li> Sağ tarafı yukarı bakacak şekilde fareyi Lay, ve% 70 etanol ile sprey. Forseps ile, sol göğüs kafesi altında derinin ince bir kat kapmak ve makas ile hafif bir kesi kesti. Peel geri cilt, dikkatle forseps ile periton ince bir kat kapmak ve bir küçük boşluğu kesti. </li><li> dalak düzleştirilmiş fasulye benzer bir küçük, ince uzun, koyu kırmızı bir organdır; ince çevreleyen bağ dokusu uzak keserek forseps ve tüketim ile dalak kapmak. Buz üzerinde TCM 10 ml içeren konik içine eksize dalak yerleştirin. </li><li> 70 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden fazla dalak dökün ve tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 5 ml&#39;lik bir şırınga içinde bir kör ucu olan ezme ile ayrıştırılacaktır. İki dalak maksimum örgü süzgeç başına tasnif edilmiş olmalıdır. </li><li> Dikkatle kalan splenositlerin toplamak için parçalanmalanna aşağıdaki süzgeç yıkamak için TCM küçük bir hacim kullanın. Bir tek hücre süspansiyonu halinde tüm ayrıştırılmış dalak havuzda toplayın. Bir yıkama bir TCM&#39;nin ile 50 ml nihai hacim getirin10 dakika için 300 xg&#39;de dönmeye d. </li><li> 5 mi 10x lisis tamponu ile 45 ml steril suyun eklenmesiyle 1x lisis tamponu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırma, kırmızı kan hücreleri, 50 ml&#39;lik konik dalak başına 1x lizis tamponu 5 ml tekrar süspansiyon pelet, ortadan kaldırmak için. 5 dalak aşan Eğer, bir 250 ml santrifüj tüp kullanın. 5 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde konik ya da santrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Su banyosu parçalama reaksiyonu çıkarın ve 1 at TCM ekleyin: reaksiyonu nötralize etmek lizis tamponu ile 1 oranında. 10 dakika için 300 xg&#39;de iplik yıkayın. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme TCM aspire süpernatant ve tamamen tekrar süspansiyon pelet (2 ml / dalak, 4 dalak için 8 ml toplam). </li><li> 190 ul tripan mavisi (01:20 seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek hücreleri saymak. Toplam hücre sayısını elde etmek için 20 x 10 x 4, toplam hacmi (8 ml) dört kareli meydanlarından birinde elde edilen numarayı çarpın (örneğin, 125 hücre x 20 x 10 4 </skadar&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 splenositleri). </li><li> 2 ug / ml konkanavalin A (Con A) ve 50 lU / ml rekombinant insan interlökin-2 (rhlL-2) ile desteklenmiş TCM, 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, hücrelere seyreltin. Bu durumda, 200 x 10 6 splenosit, 8 mi hücreleri, 200 ug ConA ve 5000 IU rhlL-2 92 ml ortamı eklenir. </li><li> 4 x 10 6 hücre de her olmak için, 24-çukurlu doku kültürü tedavi levhaların her çukuruna 2 ml hücre ekleme (örneğin, hücre 100 mi, yaklaşık 4 plakayı gerektirir). </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> 5. İletimi 1. Gün: <ol><li> Olmayan doku kültürü sayısı 2 ile hasat dalak numarası (8 plaka 4 dalak için gerekli olan) çarpılması suretiyle transdüksiyonu için gerekli olan, 24 oyuklu plakalar tedavi hesaplar. </li><li> Daha sonra, yeniden birleştirici insan fibronektin parçası (RHFF) çözeltisi gerekli hacmi hesaplamakçarpılarak kat plakalarına gerekli (kuyuların toplam sayısı + 3) 0.5 ml x (8 tabak x 24 kuyu = 192 + 3 = 195) 0.5 ml = 97.5 ml x. </li><li> 25 ug (97.5 x 25 = 2437,5 ug) ile toplam hacmi çarpılarak 25 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda RHFF içeren 97.5 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) hazırlayın. 97.5 ml PBS RHFF bu miktar ekleyin. </li><li> Kat olmayan doku kültürü başına 0.5 ml PBS / RHFF çözeltisi ilave edilerek, 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi. </li><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li></ol> Gün 2: <ol start="6"><li> Olmayan doku kültüründen, PBS / RHFF çözeltisi dökümü 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi. </li><li> PBS içinde 1 ml / göz,% 2 sığır serum albümini (BSA) ilave edilir ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Sıkıca plaka upending tarafından BSA çıkarın. 2 ml PBS eklenerek yıkanır. </li><li> 250 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, her HEK293T PDL plaka ortamı transfer ederek viral süpernatan toplamak ve 500 x g&#39;de 10 dakika dönerler. </li><li> Dikkatle viral SU aktarmakemin oluşmuş olabilecek hücre pelletini rahatsız etmemek için, tatlı bir 250 ml&#39;lik santrifüj tüpüne pernatant. </li><li> Nihai hacim RHFF kaplı oyuklara için gereken miktardan daha 3 mi daha gibi viral süpernatan taze TCM ekleyin. Örneğin, 192 RHFF kaplı oyuklara için, 192 + 3 ml = 195 mi, viral süpernatanın hacmi getirmek. </li><li> 3 kez her iyi - hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 2 ile kuvöz ve tekrar süspansiyon kültüründe splenositlerin çıkarın. 250 ml&#39;lik konik transfer. Bu adımı hızlandırmak yardımcı olacak transfer edilmeden önce bir steril hazne ile bir çok kanallı pipet kullanarak edin. Daha önce, 10 dakika boyunca 300 x g de tarif edilen ve sıkma sayısı. </li><li> RhlL-2 ekleyin, viral süpernatanın 50 IU / ml&#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. Örneğin, ekleme 50 x 195 = 9,750 IU viral süpernatant 195 ml-2 rhIL. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml&#39;de, viral süpernatan içinde yeniden süspanse splenositlerin </li><li> RHFF kaplı 24 oyuklu plakalara / oyuk splenosit süspansiyonu 1 ml ilave edilir. </li><li>Aşağıdaki ayarlara göre 90 dakika Spin: 770 xg, hızlanma = 4, fren / yavaşlama = 0, 32 ° C. </li><li> 50 lU / ml rhIL-2 ile bir TCM çözelti hazırlayın. Örneğin, 10.000 IU rhlL-2 eklenerek 200 TCM solüsyon hazırlanır. Santrifüj işleminden sonra her bir oyuğa rhlL-2 / TCM 1 ml ilave edilir. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür. </li></ol> 6. CAR T hücresi Kültür ve Hasat Gün 3 ve 4: <ol><li> T hücreleri&gt;% 80 izdiham elde ederse, hücreler (bu genellikle günde 3 ya da 4 gün gerçekleşir) bölünmüş olabilir. Hücreleri ayırmak için, hafifçe yukarı pipetleme ve her bir çukura 2-3 kez aşağı ve bir taze 24-yuvalı doku kültürü tedavi plakanın yeni kuyu içine her bir 1 ml hareket eder. Daha sonra, son hacmi, tüm kaynaklarda 2 mi olduğunu, her bir oyuğa bu 50 lU / ml IL-2 ile taze TCM 1 ml. </li><li> Hücreler&gt;% 80 izdiham ulaşmak yoksa, yavaş yavaş her üst medyanın 1 ml kapalı pipetle iyi bir buçuk medya değişikliği gerçekleştirmek. D kaçınınmedya çıkarırken alt yerleşmiş hücreler isturbing. RhIL-2 ml 50 IU / içeren taze TCM 1 ml ekleyin. </li></ol> 5. Gün: <ol start="3"><li> 250 ml&#39;lik santrifüj tüpüne süspanse CAR T hafifçe yukarı pipetleme hücreleri ve her bir aşağı 3 kere transfer. 10 dakika için 300 xg&#39;de hücreleri Spin. </li><li> Pelet bozmadan Tamamen aspire süpernatant. İkinci bir zaman daha önce tarif edildiği gibi hücre sayımı ve PBS ile yıkayın, bir kez PBS ile yıkayın. Tipik bir ARAÇ T hücre verimi kuyu başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre (8 plakaları x 24 kuyu = 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri) &#39;dir. </li><li> 200 ug hacim içinde 1 x 10 7 bir enjeksiyon için 5 x 10 7 / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, PBS içinde yeniden süspanse hücreler (örneğin, 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri için, tekrar süspansiyon 3.84 ml PBS pelet yıkanmış). </li></ol> Tümör taşıyan fareler 7. CAR T hücre İdaresi 5. Gün: <ol><li> Transpodamardan enjeksiyon için hayvan tesisine buz üzerinde oda sıcaklığı hücreleri. Yük 27 ile insülin şırınga içine 500-1000 ul - tüm kabarcıklar sınırdışı olmasını sağlamak 31 G iğne. </li><li> Kuyruk dibinde bir fare tut ve tüp süzgeç olarak yerleştirin. </li><li> Ven yukarı bakacak şekilde gergin kuyruk çekin, ve kuyruk ven paralel takarak damara iğne deri altında yaklaşık 1-2 mm kayma. Yavaş yavaş damara 200 ul sınırdışı. İğne doğru damar içine takılırsa, hacim kolayca akacak; Aksi takdirde orada direniş olacak ve iğne kuyruk kaldırılacak ve doğru-takılı yeniden gerekir. </li></ol>

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer.">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li><li>Hodi, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).</li><li>Schwartzentruber, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gp100+peptide+vaccine+and+interleukin-2+in+patients+with+advanced+melanoma.">gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).</li><li>Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+effector+T+cells+expressing+chimeric+T+cell+receptor+with+antibody+type-specificity.">Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity.</a> Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).</li><li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+T+cells+engineered+to+coexpress+tumor-specific+receptors:+persistence+and+antitumor+activity+in+individuals+with+neuroblastoma.">Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma.</a> Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+depletion+and+remissions+of+malignancy+along+with+cytokine-associated+toxicity+in+a+clinical+trial+of+anti-CD19+chimeric-antigen-receptor-transduced+T+cells.">B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.</a> Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias.">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).</li><li>Wikstrand, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+EGFRvIII+are+tumor+specific+and+react+with+breast+and+lung+carcinomas+and+malignant+gliomas.">Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.</a> Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).</li><li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFRvIII+mCAR-modified+T-cell+therapy+cures+mice+with+established+intracerebral+glioma+and+generates+host+immunity+against+tumor-antigen+loss.">EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.</a> Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).</li><li>Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lymphocyte+function+by+glioblastoma-derived+transforming+growth+factor+beta+2.">Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2.</a> J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).</li><li>Wintterle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+B7-related+molecule+B7-H1+by+glioma+cells:+a+potential+mechanism+of+immune+paralysis.">Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis.</a> Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).</li><li>Fecci, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma.">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li><li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-homolog+1+expression+by+human+glioma:+a+new+mechanism+of+immune+evasion.">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li><li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells,+upon+contact+with+human+glioma+cells,+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway.">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li><li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide:+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours.">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li><li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas.">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li><li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers.">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li><li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion.">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li><li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model.">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li><li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy.">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li><li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas.">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li><li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model.">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li><li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide?+The+glioblastoma+experience.">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li><li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dense+temozolomide+regimens:+antitumor+activity,+toxicity,+and+immunomodulatory+effects.">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li><li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go.">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li><li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+is+more:+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy.">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li><li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma:+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens.">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li><li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8(+)+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice.">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li><li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+CD4++lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide:+a+toxicity+with+therapeutic+implications.">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li><li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity.">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8++T+cells.">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li><li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells.">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li><li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions.">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li><li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma.">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interests to declare.

Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, - (...

Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifade ex vivo mühendislik. Arabaların kompleks, tam uzunlukta, başlıca doku uyumu yerine, bir ya da daha fazla hücre içi T hücresi sinyal molekül (ler) ile bir antikorun hücre dışı değişken bölgesini füzyon tarafından üretilen (MHC) bir T hücresi reseptörü 5 -restricted. Antikor benzeri antijen Tanıma ve ödüller Bu modreaktif antijen spesifik T hücreleri tanımak ve MHC olmadığı halde tümör antijenlerine yanıt ve hemen hemen sonsuz bir antijen repertuar için uyarlanabilir edilmesi için, izin verir. Tümör antijenlerinin çeşitli karşı tasarlanmış ARAÇ T hücreleri klinikte 6-9 preklinik etkinliğini ve üstün söz göstermiştir. Özellikle, GBM kapsamında, bir ARAÇ T hücresi platformu hedefleme epidermal büyüme faktörü reseptörü varyantı III (EGFRvIII), tümöre özel bir mutasyon hücre yüzeyi 10 üzerinde eksprese, gliom taşıyan farelere 11 ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Çeşitlilikleri rağmen, ARAÇ adoptif tedavi klinik yarar tamamen bağlı tümör bağlantılı bağışıklık bastırma ve bağışıklık kaçırma 12-16 olarak oluşturulması ve in vivo olarak antijen-spesifik T hücrelerinin korunmasında zorluklar kısmen fark edilmemiştir. Immünoterapi ile bakım (SOC) standardını yararlanan potansiyel bu l birkaç üstesinden gelebilirtaklidi, hem klinik öncesi ve klinik ortamda gelişmiş etkinlik ile sonuçlanmaktadır. Sonrası rezeksiyon GBM için SOC yüksek doz temozolomide (TMZ), bir DNA alkilleyici ajan 17, ve tüm beyin ışınlaması (TBI) oluşur 1. Bu tedaviler, tümör MHC ekspresyonunun 18-20 yukarı regülasyonu ve ölü tümör hücreleri 17,19,21,22 ile antijen dökülme ile tümör aşıları ile sinerji olduğu kabul edilir. Nitekim, klinik öncesi ortamda bağışıklık temelli tedaviler geliştirilmiş antitümör etkinliğine TMZ 20,23 veya 18,24 WBI potansiyel eklenmesi. Ayrıca, birçok non-spesifik sitotoksik kemoterapötik gibi, TMZ evlatlık tedavi platformları 27-29 host-klima aracı olarak kaldıraçlı olabilir sistemik lenfopeni 25,26, neden olduğu bilinmektedir. TMZ aracılı lymphodepletion bir ADOP artan etkinliğine yol açan antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı ve fonksiyonunu artırmak için gösterilmiştirintrakranial tümörlere karşı 30 tif tedavi platformu. ARAÇ tedavisi bağlamında, lymphodepletion hem böylece anti-tümör aktivitesi 11,34 artırılması, endojen bastırıcı T hücreleri 31 sayısını azaltır ve sitokinlerin 33 için daha az rekabet ettirilerek homeostatik proliferasyonu 32 uyararak konakçı klima bir araç olarak hizmet eder. SOC bağlamında yeni evlat edinen tedaviler ve aşı platformları değerlendirilmesi etkinliğine ilişkin anlamlı sonuçlar çizim için kritik GBM SOC ve immünoterapi platformlar arasında sinerjik bir ilişki göz önüne alındığında. Bu protokol, EGFRvIII pozitif tutan tümörler (tedavi zaman çizelgesi için bakınız Şekil 1) taşıyan farelerde TMZ ve WBI birlikte sıçangil EGFRvIII özgü ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve damar içine uygulama için bir yöntem özetlemektedir. Kısaca, ARAÇ T hücreleri retroviral transdüksiyon tarafından ex vivo yapılır. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T Hücreler daha sonra hasat edilmiş ve paralel olarak kültürlenir aktif sıçangil splenositlerin nakletmek için kullanılan virüs üretmek için (ARAÇ vektör ve PCL-Çevre plazmidleri içeren) bir DNA / lipid kompleksi kullanılarak transfekte edilir. ARAÇ üretimi sırasında, EGFRvIII pozitif intrakraniyal tümörleri taşıyan sıçangil ana klinik SOC kıyaslanabilir dozlarda parçalanmış tüm beyin X-ışını radyasyon ve sistemik TMZ tedavisi uygulanır. ARAÇ T hücreleri daha sonra lymphodepleted bilgisayarlar intravenöz teslim edilir. Aşağıdaki prosedür, yedi ayrı haldeki evreler içinde tarif edilmektedir: Tümör taşıyan, Tümör taşıyan fareler (2) tüm beyin ışınlama, fareler (3) Transfeksiyonu için temozolomid (1) Uygulama (4) splenektomi ve T hücre hazırlanması, (5 Tümör taşıyan fareler için (6) CAR T hücre Kültür ve Hasat ve (7) CAR T hücre yönetimi) İletimi. Bu aşamalar 6-7 güne yayılan ve aynı anda yapılmaktadır birkaç adım oluşmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Name of Material</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:449px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>10045P</td>
			<td>Helper vector for generating CAR retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retronectin</td>
			<td>ClonTech/Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td>Facilitates retroviral transduction of T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>HEK293 culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>T cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM 2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Reducing agent to remove free radicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin (50 mg/mL)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Standard&#160;Grade&#160;</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pharm Lyse (10X concentrate)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Lyses red blood cells during splenocyte processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Filters away large tissue particles during splenocyte processing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356469</td>
			<td>Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temozolomide</td>
			<td>Best Pharmatech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized powder prepared on the day of administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Necessary for complete dissolution of temozolomide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>IM 0132 (5/04)</td>
			<td>Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketathesia HCl</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>11695-0701-1</td>
			<td>Ketamine solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Xylazine sterile solution 100 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of car t cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

ARAÇ T hücreleri EGFRvIII ARAÇ retroviral vektör 11 transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu vektör, MSGV1, murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarı, genişletilmiş öğürme bölgesi ve zarf ekleme sahası içeren SFGtcLuc_ITE4 vektörü 35, geliştirilmiş (bağlayıcı verici, SD, ve alıcı ekleme sa) ve viral edildi paketleme sinyali (ψ). Sıçangil CD8TM ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ CD28, 4-1BB ve...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care at JoVE.com

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K Görüntüleme.  Duke University. The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care. 

Video: Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.