The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Fütterung Bakterien (E. coli-Stamm OP50). <ol><li> Isolieren einer Einzelkolonie von E. coli-Stamm OP50 aus einem LB-Medium (LB) Agarplatten beimpfen und aseptisch in 300 ml autoklaviertes LB-Medium. </li><li> Ermöglichen die inokulierte Kultur über Nacht in einem Schüttler bei 200 rpm und 37 ° C zu wachsen, bis eine Sättigung erreicht wird. </li><li> Übertragen Sie das OP50 in 6 sterile, vorgewogen 50 ml konische Röhrchen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation für 5 min bei 6000 rpm (5000 × g). </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die Bakterien, die mit 50 ml steriler M9. Zweimal wiederholen. </li><li> Nach dem zweiten Waschen das verbleibende M9, sicherzustellen, dass kein M9 im Rohr belassen. </li><li> Bestimmen das Gewicht des Pellets durch Wiegen der Röhrchen mit dem Bakterienpellet und Subtrahieren des Gewichts der 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Das Pellet in M9 in einer Konzentration von 100 mg / ml. </li><li> Lagern Sie die OP50 Lösung bei 4 ° C, bis es für die Schnecke Kultur verwendet wird. </li></ol> 2. Herstellung der Nematode Wachstumsmedium (NGM) Petri Platten HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Herstellung von NGM Petrischalen, die die Platten in dem die C sind elegans-Würmer werden routinemßig im Labor gehalten. <ol><li> Autoklavieren die NGM-Agar-Medium. </li><li> Mit einer sterilen Verfahren, verzichten 17 ml NGM-Agar-Lösung in 6 cm Petrischalen mit einer Schlauchpumpe. ANMERKUNG: Eine konstante Menge Agar in den Platten reduziert die Notwendigkeit der Neuausrichtung des Mikroskops beim Wechsel von einer Platte zur anderen. </li><li> Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für 2-3 Tage vor dem Einsatz, damit der Agar fest werden und lassen Sie das überschüssige Feuchtigkeit verdunstet ist. </li><li> Seed die NGM-Platten mit einer sterilen Technik. 1-2 Tropfen OP50 Flüssigkultur und verbreiten mit einem Glasstab. Achten Sie darauf, nichtum die Bakterien Rasen zu den Kanten der Platten verteilt den ganzen Weg. </li><li> Lassen Sie das OP50 Wiese für 1-2 Tage bei Raumtemperatur, bevor Sie die Platten Würmer wachsen wachsen. </li></ol> 3. Herstellung einer Synchronwurmpopulation HINWEIS: Der Lebenszyklus von C. elegans ist von der embryonalen Phase, vier Larvenstadien (L1-L4) und im Erwachsenenalter bestehen. Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung einer altersSynchron Bevölkerung von Würmern. Alle Materialien kommen in nach der Bleichbehandlung Kontakt mit C.elegans müssen steril sein. <ol><li> Tag 1 - Herstellung von Gravid Worm Bevölkerung <ol><li> Verwenden NGM-Platten, in denen der Großteil der Wurmpopulation aus verhungert L1-Larven. </li><li> Sammeln Sie die L1-Larven mit einer sterilisierten Wurm holen und sie auf frische 6 cm NGM-Platten ausgesät mit OP50. Inkubieren für etwa 65 h bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Würmer graviden Erwachsenen. Bis Zurvermeiden Plattenbelegung und damit die Würmer ohne abbauende Bakterien wachsen, nicht mehr als ein oder zwei Gruppen von L1-Larven auf jede frische NGM Platte übertragen. </li></ol></li><li> Tag 4 - Einrichtung einer Synchronized L1 Larven Bevölkerung <ol><li> Sammeln Sie die trächtige Würmer aus den NGM-Platten durch Waschen mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube. </li><li> Lassen graviden Würmer sedimentieren am Boden der 15 ml konischen Röhrchen für etwa 5-10 min. Entfernen Sie den Überstand ohne den Wurm Pellet zu stören. </li><li> Übertragen Sie die Wurmpellet zu 2-4 Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml Bleichmittel / NaOH-Lösung. Inkubieren für 2-3 min bei RT. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Stereomikroskop zur Bestätigung alle Würmer tot sind. Bleichen Sie nicht länger als 5 Minuten, da die Embryonen sterben. </li><li> Sammle die Würmer durch Zentrifugation für 1 min bei 3000 Upm (900 × g). Entfernen Sie den Überstand und 1 ml sterile M9Neutralisierung der Reaktion. </li><li> Zweimal waschen die Würmer durch Zentrifugation für 1 min bei 3000 Upm (900 × g). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen M9 auf bis zu 100 bis 200 ul. </li><li> Mit einer Glaspasteurpipette einen Tropfen des Wurms / M9 mischen, um NGM-Platten für mindestens 24 Stunden bei 20 ° C klar und inkubieren sie, damit die Embryonen zu schlüpfen. HINWEIS: Ohne Nahrung Wachstum der Larven werden auf der L1 Stadium angehalten werden. </li></ol></li><li> Tag 5 - Einrichtung einer Synchronized L4-Larven Bevölkerung <ol><li> Sammeln Sie die L1-Larven von den klaren NGM-Platten durch Waschen der Platten mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube. </li><li> Lassen Sie den toten adulten Würmern Sediment am Boden der 15 ml konischen Röhrchen ca. 5 min. </li><li> Sammeln des Überstandes, wobei die L1-Würmer sind, in ein neues konisches 15 ml-Röhrchen und fällt die Würmer durch Zentrifugation für 2 min bei 2600 rpm (1000 × g). </li><li> Entfernen Sie den Überstand leaving etwa 500 ul. </li><li> Man bestimmt die Konzentration von Würmern in M9-Lösung, indem die Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Stereomikroskop. Zählen Sie mindestens 5 Tropfen. </li><li> Stellen Sie die Konzentration der Würmer auf 20-25 Würmer / ul und 50 ul der Wurm / M9-Mix auf NGM-Platten mit OP50 ausgesät. </li><li> Inkubationszeit von 65 Stunden bei 15 ° C (für die Inkubation durch das Wochenende), damit der L1 synchronisiert Bevölkerung zu wachsen bis zum L4-Stadium zu erreichen. </li></ol></li></ol> 4. Die Exposition von Worms nach Chemikalien in 96-Well-Platten Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von Pxol1 :: gfp Transkriptionsreporter enthält C. elegans-Stamm, für die Induktion von Aneuploidie screenen. <ol><li> Sammeln Sie die L4-Larven von den klaren NGM-Platten durch Waschen der Platten mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube. </li><li> Lassen Sie den L4 Würmer Sediment am Boden des15 ml konischen Röhrchen für etwa 5-10 min. Entfernen Sie den Überstand ohne den Wurm Pellet zu stören. </li><li> Hinzufügen 3-5 ml M9 und Bestimmung der Konzentration von Würmern in M9-Lösung, indem die Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Stereomikroskop. Zählen mindestens 5 Tropfen für jede Probe. </li><li> Resuspendieren der Würmer bei einer Konzentration von 1,000 Würmern / ml in M9. </li><li> Verdünnen Sie die OP50 Bakterien aus Abschnitt 1 10-fach mit M9. Achten Sie darauf, die resuspendierten Bakterien Raumtemperatur erreichen, weil niedrigere Temperatur wirkt Wurm Entwicklung. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette, erste fügen 100 ul des Wurms / M9-Mix (aus Schritt 4.4) und fügen Sie dann 400 ul der verdünnten OP50 Bakterien (aus Schritt 4,5) in jede Vertiefung einer 2 ml tiefen Rund Platte mit 96 Vertiefungen. Am Ende wird jeder Vertiefung haben 100 Würmer in 500 &amp; mgr; l. </li><li> In 0,5 ul von entweder die Prüfsubstanz oder dem entsprechenden Steuer auf die gewünschten Brunnen, um eine vorgeschlagene endgültige Konzentr erreichenation von 100 uM, einer Konzentration üblicherweise in chemischen Bildschirme in C verwendet elegans 12. Expose Ethanol oder DMSO Lösungsmittelkontrollen in einer Endkonzentration von 0,1%. HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Nocodazol (100 uM) als Positivkontrolle. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit Klebefolie. Achten Sie darauf, die Platte gut verschließen, um eine Kreuzkontamination zwischen den Kavitäten vermeiden. </li><li> Wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie. </li><li> Übertragen der Platte an einem Schüttler (170-180 rpm) der geeigneten Temperatur für die geeignete Zeitdauer (24 oder 65 h). Die Temperatur des Raums beeinflusst das Wachstum der Würmer; Aufrechterhaltung der Temperatur von etwa 20 ° C. </li></ol> 5. Bildaufnahme von Gravid Worms in einer 384-well Platten HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung eines hohen Gehalts Mikroskop zur Abbildung des belichteten Pxol1 :: gfp Würmer, um die Expression von GFP in den Embryonen im Uterus von erwachsenen Hermaphroditen visualisieren. Fürjeder 384-Well-Platte zu sehen sein, verwenden Würmer aus 4 x 96-Well-Platten. <ol><li> Nach Exposition gegenüber Chemikalien in den Shaker, lassen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen Rest für 10-15 Minuten, damit sich die erwachsenen Würmer an die Unterseite der Platte zu sedimentieren. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie 350 ul der M9, sehr vorsichtig, nicht die Würmer in der Unterseite der Platte stören. </li><li> Mit 1 ml M9 und wiederholen Sie Schritt 5.1 Waschen Sie die Würmer. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie 1 ml des M9, dass Vey achten, dass die Würmer in der Unterseite der Platte stören. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette resuspendieren die Würmer in der verbleibenden M9 und sammeln Sie 100 ul der Schnecke / M9-Mix aus den 96-Well-Platten und laden Sie es in die Vertiefungen einer schwarzen Wänden / klarer Boden 384-Well-Platte. Wiederholen des Prozesses mit Schnecken von 4 x 96-Well-Platten, bis alle Vertiefungen der Platte mit 384 Vertiefungen geladen wurden. HINWEIS: Es ist wichtig für alle Brunnen, um das gleiche Volumen, um das zu erhöhenEffizienz und die Geschwindigkeit des Autofokus während der Bildaufnahme-Prozess. Jedes der gut sollte zwischen 80 bis 100 Würmer enthalten. </li><li> 1 ul Levamisol (100 &amp; mgr; M) zu jeder Vertiefung und lassen die Würmer inkubieren etwa 30 min. HINWEIS: Levamisol fungiert als Acetylcholin-Rezeptor-Agonisten und immobilisiert die Würmer. </li><li> Übertragen Sie die Platte auf eine Weitfeldmikroskop hohen Gehalt in der Lage, automatisierte Bildverarbeitung. </li><li> Für die Bildaufnahme verwenden einen hohen Gehalt Bildaufnahme und Analyse-Software nach den Richtlinien des Herstellers. Wählen Sie das 4X Ziel, 1 Bild pro Vertiefung zu erwerben. </li><li> Vor dem Start der Bildaufnahme, passen Sie die GFP Bildparameter bis 45 msec von Belichtung und Bildauflösung auf 2160 x 2160. </li><li> Sammeln der Daten, wenn die Anzahl der GFP-positiven Würmer in dem Bohrloch, dividiert durch die Gesamtzahl der Würmer, wobei die letztgenannte Maßnahme relativ konsistent zwischen den Wells. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die hier beschriebene Methode ist die erste groß angelegte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe. Es erfordert die Verwendung eines GFP transgenen Pxol-1 :: GFP, die Belastung, die getreulich berichtet die Induktion von Aneuploidie in frühen Embryonen, die als Proxy für die Keimbahnstörungen verwendet wird. Das Verfahren beinhaltet die sorgfältige Synchronisation eines C. elegans Wurm Bevölkerung und Belichtung Würmer Chemikalien in 96-Well-Format, gefolgt von Abbildung der GFP p...

Es gibt rund 87.000 Chemikalien für den Handel in den Vereinigten Staaten registriert, aber nur eine kleine Anzahl von ihnen haben zu möglichen Gesundheitsschäden 1 getestet. Von denen, die getestet wurden, wurde nur ein Teil für die reproduktive Gesundheitseffekte teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der Bestimmung der Veränderung der ersten fortpflanzungs Ereignisse bei Säugern, insbesondere bei weiblichen Keimzellentwicklung und -differenzierung bewertet. Tatsächlich sind die ersten Reife Veranstaltungen finden während der frühen Stadien der Embryonalentwicklung bei weiblichen Säugetieren und sind deshalb schwer zugänglich und sammeln in den Zahlen für Screening-Zwecken. Die Keimbahn bietet das entscheidende Bindeglied zwischen den Generationen, und ihre jeweilige Funktion ist abhängig von der genauen Ausführung der komplizierten Programm der Zell- und Chromosomenteilung bezeichnet Meiose. Dysregulation des Reifeprozess kann zu einer verringerten Fruchtbarkeit und die Produktion zur Folge habenGameten und Embryonen mit einer abnormalen Anzahl von Chromosomen, eine Bedingung genannt Aneuploidie. Chromosomensegregation Fehler in der Meiose sind von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Chromosomenanomalien sind häufig, mit einer Frequenz von 1 150 Lebendgeburten, Trisomie 21, 18 und 13 sowie die X- und Y-Chromosomen-Fehler als die am weitesten verbreiteten Arten 2,3. Außerdem angeborene Fehlbildungen, auch die der chromosomalen Ursprungs, sind die Hauptursache für Kindstod in der US 4 Die Idee, dass Umwelteinflüsse können Chromosomensegregation und das Verhalten beeinflussen, ist nicht neu 5, ist aber noch weitgehend unverstanden. Es ist daher wichtig zu untersuchen, welche der in unsere Umgebung eingeführt Chemikalien mit menschlichen Fruchtbarkeit, Frühentwicklung und die allgemeine reproduktive Gesundheit zu stören sind. Angesichts dieser Einschränkungen der Säugetier-Modelle haben wir ein Hochdurchsatz-Screening-Test entwickelt, um die Reproduktionstoxizität im Fadenwurm testen &lt;em&gt; C. elegans. Wir haben mehrere wichtige Merkmale dieses üblicherweise verwendeten genetischen Modellsystem angeboten mobilisiert wie ihre geringe Grße, geringen Kosten, kurze Reproduktionszyklus, hohen Anteil an Keimzellen und leichte Handhabbarkeit 6. Würmer können in 96-Well-Platten oder in großen Mengen Flüssigkulturen gezüchtet werden und wegen ihrer Transparenz kann direkt auf Platten zur Detektion von fluoreszierenden Reportern abgebildet werden. Das im Folgenden beschriebene Test nutzt diese Eigenschaften und nutzt eine Wurm-Stamm, dem fluoreszierenden Reporter Pxol-1 :: GFP zu Keimbahnunterbrechung und Induktion von embryonalen Aneuploidie zu erkennen. Die Verwendung dieser Reporterstamm ist auf der in der Regel seltenen Auftretens von Männchen in einer hauptsächlich Zwitterwurmpopulation beruht. Diese Männchen (&lt;0,2%) natürlicherweise von Fehler in der Trennung von dem X-Chromosom 7. Da Keimbahnunterbrechung führt häufig zu Fehlern bei Trennung von Autosomenund heterochromosomes korreliert er sowohl mit einer erhöhten Inzidenz von männlichen Phänotyp (X missegregation) sowie embryonale Letalität (Autosom missegregation). Um die Induktion von Männern leicht erkennen, unter Umgehung der Frage der embryonalen Letalität, ist männlich spezifischen Promotor (xol-1) verwendet werden, um die Expression von GFP in frühen Embryonen noch innerhalb des Wurms Gebärmutter enthaltenen fahren. Als solches wird das Auftreten von GFP-exprimierenden Embryonen als Proxy für das Vorhandensein von aneuploiden Embryonen verwendet. Dieses Verfahren wurde zuvor verwendet worden, um Gene in die Keimbahn Wartung und Meiose 8,9 gebracht identifizieren. Um chemisches Screening angepasst wird dieser Stamm in einem Medium mit hohem Durchsatz Bildschirm beschäftigt. Wichtig ist, dass die Belastung getreu berichtet die aneugenicity von Chemikalien und ist daher für Säugetier reproduktiven Endpunkte 10. Der hier beschriebene Assay ist besonders nützlich, um Toxikologen in der pharmazeutischen und chemischen Industrie Einstellungen suchen seinum zeitnah die Toxizität von Chemikalien zu reproduktiven Endpunkte. Darüber hinaus dieser Test vollständig ausgerichtet mit den staatlichen Prioritäten in der Toxizität im 21. Jahrhundert 11 Bericht hervorgehoben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

Die Ermittlung der Reproduktionstoxizität von den Tausenden von in der Umwelt vorhandenen Chemikalien ist eines der verlockenden Herausforderungen im Bereich Umwelt und Gesundheit. Dies ist zum Teil auf den Mangel an Modellsystemen, die (1) exakt zu rekapitulieren können Tasten Funktionen der reproduktiven Prozesse und (2), tun dies in einem mittel- bis Hochdurchsatz-Mode, ohne die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Wirbeltieren. Wir beschreiben hier einen Test in dem Fadenwurm C. elegans, die die schnelle Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe können durch die Überwachung der Induktion von aneuploid Embryonen. Durch die Verwendung eines GFP-Reporter Linie ist, werden Fehler in der Chromosomensegregation von Keimbahnunterbrechung resultierende leicht visualisiert und durch automatisierte Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. So ist die Durchmusterung einer bestimmten Satz von Verbindungen für ihre Toxizität in einer 96- bis 384-Well-Plattenformat in wenigen Tagen durchgeführt werden. Sekundäranalyse der positiven hseine durchgeführt, um festzustellen, ob die Chromosomenanomalien von meiotischen Störung oder aus frühen embryonalen Chromosomensegregation Fehler entstanden ist. Insgesamt dieser Test einen schnellen First-Pass-Strategie für die schnelle Beurteilung der Keimbahn Dysfunktion folgenden chemischen Exposition.

Belichtung des Pxol-1 :: GFP-Reporter-Stamm gegenüber chemischen Mitteln wie Mikrotubuli Gift Nocodazol (Figur 1) führt zur Induktion eines hohen Anteils an GFP-exprimierenden Embryonen in den Uterus ausgesetzt erwachsenen Hermaphroditen Vergleich zu DMSO Kontrolle. Die GFP-positiven Embryos sind deutlich heller als die anderen Embryonen als auch die im Darm der Tiere beobachtet Autofluoreszenz beobachtet schwache Hintergrund-Fluoreszenz. Würmer ausgesetzt werden direkt auf 384-Well-Platten ...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Serie: Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...