The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen (Sterilbank) und mit vorab sterilisierten Materialien (durch Autoklavieren 126 ° C, 11 min). Eine LB-Platte mit ausgestrichen E. coli OP50 bei 4 ° C gehalten wird benötigt, streifen out auf frische LB-Platten zu restreak jeden Monat. 1. Die bakterielle Food (Escherichia coli OP50) Herstellung <ol><li> Tag 1 beimpft 2 x 5 ml LB in zwei Universal-Flaschen mit einer Einzelkolonie von E. coli OP50 und Platz im Schüttelinkubator bei 37 ° C (220 rpm) für 8 h. </li><li> Nach 8-stündiger Inkubation, verwenden Sie 2 ml E. coli OP50 LB-Kultur zu je 3 x 200 ml LB zu inokulieren Ort Kolben in Schüttelinkubator (220 UpM) O / N (17 Stunden) bei 37 ° C. </li><li> Wiegen 20 x 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schreibgewicht auf dem Schlauch. </li><li> Tag 2. Mit einem serologischen Pipette aliquote 30 ml O / N E. coli OP50 Kultur in das vorgewogen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 7.741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand, halten Sie den Schlauch mit Deckel umgekehrt auf und lassen Sie es für einige Minuten stehen lassen. Mit einer Pipette zu entfernen überschüssiges Überstand, der im Deckel angesammelt haben kann. Wiegen des Rohres und berechnet das Gewicht des Pellets. </li><li> Berechnen die benötigt wird, um eine Suspension von 30 g / L bereitzustellen, und markieren dieses Volumen an der Rohrvolumens. Datum, Bezeichnung und Ort Röhrchen bei -20 ° C für den Einsatz innerhalb von 1-3 Monaten oder bei - 80 ° C, wenn die Speicherung länger als 3 Monate. </li><li> Bereiten Bakteriensuspension für den Anbau von Nematoden; ermöglichen Bakterienpellet auftauen und fügen erforderliche Volumen des S Komplettmedium 11,12 in jedes Röhrchen, Vortex vorsichtig, um Pellet resuspendieren, Pool Inhalte der verschiedenen Rohren, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Arbeiten unter sterilen Bedingungen. </li></ol> 2. Herstellung von Drug Standards in einer 96-Well-Plattenformat HINWEIS: Bei Verwendung eines Medikamentenbibliothek, sind Drogenplatten an einem einzigen bereitgestelltKonzentration der Verbindung in DMSO. Primärscreening werden Verbindungen in einer einzigen Konzentration zu testen. Anweisungen für die Vorbereitung der Drogenplatte für den Zweitverbindung Tests in einem Bereich von Konzentrationen zwischen 0 bis 160 &amp; mgr; M, nachdem eine statistische Signifikanz bei 10 uM ausgewählt. Die folgenden Schritte können angepasst, um andere Konzentrationen zu testen. VORSICHT! Folgen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Drogen (im allgemeinen Gesichtsmaske, Schutzbrille, Schutzhandschuhe sind erforderlich). <ol><li> Bereiten Drogenplatte mit Arbeitsnormen für den Zweitscreening: wiegen die erforderliche Menge an Verbindung in sterile 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten 16 mM Verbindung in DMSO (dh konzentrierte 100x relativ zum gewünschten Spitzenkonzentration für die Exposition). </li><li> Seriell zu verdünnen 16 mM Stamm 1: 2 in DMSO zu erhalten, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 mM Standards (steril). Diese sind 100x konzentriert und wird bis auf Endkonzentrationen von 0 (nur Vehikel) verdünnt werden,2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 &amp; mgr; M (in 1% DMSO) während der Arzneimittelexposition. </li><li> In einer Sterilbank, legen 20-50 ul pro Vertiefung der Verbindung Standards innerhalb einer Spalte einer 96-Well-Platte, zum Beispiel Plattenposition A1: 16 mm, B1: 8 mm, C1: 4 mm, D1: 2 mm, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0.25 mM Wirkstoff und H1: DMSO. Verwenden Sie verschiedene Spalten für Verdünnungsreihe von verschiedenen Drogen. </li><li> Aliquot Fahrzeug zu den Vertiefungen der Spalte 12 in dem Arzneimittel Platte. Hinweis: das Testen von Fahrzeugsteuer Spalten nach unten zusätzlich zu der Prüfung entlang der Zeile H zu erleichtern, so dass Fahrzeug in Positionen repräsentativ für die gesamte Platte getestet. HINWEIS: Jedes Medikament Platte für den Zweit Screening hält Verdünnungsreihe für maximal 11 verschiedene Medikamente getestet werden und der Fahrzeugsteuerung. </li><li> Label und Dichtungsplatte, mit Folie abdecken und Ort bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Nematode Experimente HINWEIS: Führen Sie alle Schritte under sterilen Bedingungen, aseptisch und mit vorher sterilisiert Materialien und Reagenzien. Pflegen C. elegans Stämme routinemäßig auf NGM-Platten mit E. coli OP50. 12 Vorgeschlagene Zeitpunkte für die verschiedenen Protokollschritte sind in Tabelle 1 angegeben. <ol><li> Tag 1 Aufgabe: bis Flüssigkultur von Biosensor-Stamm für die spätere Synchronisation eingestellt. <ol><li> Nehmen Sie Nematoden von einem 6 cm NGM Platte (mit viel jungen Larven, wo Lebensmittel ist soeben abgelaufen) in 2 ml S vollständig und zu übertragen, mit 30 g / l E. Kanne coli OP50 in S komplette (Gesamtvolumen 30 ml in einem 250 ml fassenden konischen Glaskolben). Inkubiere 3 Tage lang bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Tag 4 Task (gewähren ungefähr 30-35 min): Bleich Kultur, Eier zu ernten und Wurmpopulation zu synchronisieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte für 1 min, 600 x g. <ol><li> Bereiten Sie Bleichmittel-Lösung unmittelbar vor Gebrauch: zu je 16 ml 0,156 M KOH / NaOH 4 ml Bleichmittel. </li><li> Gießen Sie 2 x 14 mlWurmkultur in 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Erlauben Würmer durch die Schwerkraft (3 min) zu begleichen. Entfernen und entsorgen Sie Flüssigkeit über siedelt Nematoden. 5 ml Bleichlösung in jedes Röhrchen und starten Timer. Kombinieren Sie Datenträger in einem Rohr. </li><li> Kehren Rohr vorsichtig für 2 min, check Stereoskop für das Brechen von Würmern und der Veröffentlichung von Eier in Suspension. Wenn die meisten Eier freigesetzt werden oder an einer maximalen Zeit von 2 min in der Bleichlösung, zentrifugieren. </li><li> Überstand entfernen sorgfältig. Waschen Pellet 1x mit 14 ml S vollständig und Zentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen, 10 ml Bleichlösung und starten Timer (diese zweite Bleichstufe stellt sicher, dass die meisten der Wurm Karkassen zerfallen und nicht mehr unter Stereoskop sehen). Nach einer maximalen Zeit in Bleichlösung von 2 min, Zentrifuge. </li><li> Wash Pellet 3x in S abgeschlossen ist, vorsichtig dekantieren Überstand und Pellet in 14 ml S komplett nach jeder Zentrifugation. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Ei Pellet in 14 ml S complete. </li><li> Übertragen Sie die Lautstärke auf einen kegelförmigen Glaskolben. Inkubiere 18-24 h bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die geernteten Eiern schlüpfen O / N und Verhaftung Entwicklung bei der ersten Larvenstadium (L1) aus Mangel an Nahrung, damit sie alle auf der gleichen Stufe des Wachstums sein. </li></ol></li><li> Tag 5 Aufgabe: bis synchronisiert Wurmkulturen gesetzt für Drogentests. HINWEIS: Worms in Hungermedium suspendiert sind in der Regel an hydrophobe Kunststoffoberflächen wie beispielsweise Pipettenspitzen und Rohre entsprechen. 0,01% Tween-20 ist ein Tensid, hier verwendet, um Kunststoffoberflächen übertragen hydrophilere und eine größere Genauigkeit beim Zählen (0,01% Triton-X100 kann auch verwendet werden). Wenn Nematoden sind in der Bakterien ergänzten Medium, sie nicht dazu neigen, den Kunststoffstab. <ol><li> Bestimmen Sie Anzahl von schraffierten L1 in Kolben, Kolben zu halten beim Schütteln Plattform (160 Umdrehungen pro Minute). <ol><li> Nehmen Sie 3x 100 ul Proben von Kolben (mit einem sauberen Spitze jedes Mal) in einzelne 1,7 ml Mikroröhrchen mit 900 ul Flüssigkeit medium 0,01% Tween-20. HINWEIS: Aspire 100 ul Probe in die saubere Spitze nur einmal. Dann bei der Abgabe, Pipette nach oben und unten ein paar Mal in den zwischen ergänzten Medium, um alle Würmer an der Spitze anhaftenden freizugeben. </li><li> Zählen Sie die Nematoden in 4x 10 ul Tröpfchen aus jeder Dreifachverdünnungsröhrchen. Berechnen Sie Mittelwert und schätzen die Zahl der in der konischen Glaskolben vorhanden Würmer. </li></ol></li><li> Berechnen Sie das Volumen des schraffierten erforderlich, um mit 10 Nematoden pro 10 &amp; mgr; l Einrichtung einer 2 x 20 ml-Kultur Nematodensuspension. Erhöhen berechnete Volumen um 10%, für einige nachfolgende Nematodenverlust während Zentrifugationsschritte ausmachen. </li><li> (Vorgewogen) dekantieren Volumen in 2 x 15 ml Zentrifugationsröhrchen erforderlich. Wiegen Rohre tatsächliche Volumen verzichtet, Vortex vorsichtig zu erhalten und stellen Sie die Lautstärke, indem überschüssiges Volumen mit einer 5 ml Pipette (nur der sterile Spitze sollte das Rohr geben) zielen. </li><li> Make up Volumen bis 14 ml mit frischem S vollständig warh Nematoden. Zentrifuge (1 min, 600 g). Entfernen und entsorgen Sie Stand mit darauf, dass die Nematoden Pellet stören. </li><li> 5 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50 zu pelletiert Nematoden. Übertragen die 5 ml in jedem Röhrchen in eine konische Glaskolben mit 15 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50. Notieren Sie sich Zeit Nematoden wurden zuerst mit Nahrung versorgt. </li><li> Schüttelkolben sanft (160 rpm), nehmen Sie 9 x 10 &amp; mgr; l Tröpfchen auf Objektträger (mit frischen Spitzen jedes Mal), um Nematoden zählen und zu bestätigen, durchschnittlich etwa 10 (± 2) pro 10 &amp; mgr; l. </li><li> Platzieren Nematoden Kolben in Schüttelinkubator bei 20 ° C, 160 Upm für 42-44 Std. </li></ol></li><li> Tag 7 Aufgabe: Übertragung Nematoden auf 96-Well-Platten und initiieren Arzneimittelexposition. <ol><li> Kombinieren Nematodenkulturen in einem einzigen Kolben, halten wirbelnden Kolben vorsichtig und legen Sie 3 x 4 ml Nematodenkultur in 60 ml sterile Trog. Zeigen Trog auf einem Schütteltisch (160 rpm). </li><li> Verwenden Sie 8 channel Pipette 25 ul suspendiert Nematoden pro Well von 96-Well schwarze Mikrotiterplatten mit einem flachen transparenten Boden Aliquot (für die Aufnahme sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz-Messwerte, oder weiße Platten für Lumineszenz-only). Deckel mit Deckelplatte und beiseite stellen. <ol><li> Nach oben von je 2 Platten setzen, stellen weitere 2 x 2,5 ml Nematoden im Trog, um verlorene Volumen zu ersetzen (halten Sie einen &quot;Totvolumen&quot; in Rinne von ca. 7 ml). </li><li> Bis 13/14 Platten mit Nematoden gesetzt. 11 Nematodenplatten werden benötigt, um zwei 96-Well-Platten Medikament testen. Der 12. Nematodenplatte wird ausschließlich mit Fahrzeug als eine Steuerung geladen werden. Die 13. Platte wird verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz am Tag 8 (siehe unten) festzulegen. Eine zusätzliche Platte für den Einsatz vorbereitet werden sollen Fehler bei der Einrichtung auftreten. </li></ol></li><li> Aliquot 74 ul S komplett in jede Vertiefung und Ort Platte in einer feuchten Kammer (siehe Materialliste) in einem Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) until bereit aliquoten Testverbindungen an der vorgewählten Entwicklungszeit (zB 45 h 30 min nach Essen zur Verfügung gestellt). [Volume pro Vertiefung ist jetzt 99 &amp; mgr; l]. </li><li> Auftauen Drogenplatte (n) zu testen. </li><li> Verwenden Sie Mehrkanalpipette um Nematodenplatten mit Drogen Einrichten, Ändern Spitzen jedes Mal. Erhalten Sie 5 min pro Platte mit 96 Vertiefungen für die Aliquotierung Droge. <ol><li> Nehmen Sie 1 ul vom 1. Säule der Drogenplatte und in den Spalten 1-5 von einer Platte, die Nematoden; wiederholen vom 2. Spalte in der Drogenplatte in Spalten 8-12 der Platte, die Nematoden. 1 ul Fahrzeug Spalten 6 und 7 der Nematode Platte. Hinweis: 100-Verdünnung der Verbindung / Fahrzeugs: Das Gesamtvolumen pro Vertiefung in dem Fadenwurm Platte werden 100 &amp; mgr; was zu einem 1 sein. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang durch Zugabe von 1 &amp; mgr; l des 3. / 4-ten Spalte des Medikaments Platte, um Spalten 1-5 / 8-12 des zweiten Fadenwurm Platte; Fahrzeug in den Spalten 6 und 7 des Fadenwurms Platte.</li><li> Weiter zum übrigen Drogenbodenkolonnen zu testen. Richten Sie ein Minimum von einem Nematoden Platte mit Fahrzeug in alle Vertiefungen durch Abtasten von Spalte 12 der Arzneimittelplatte. Platz Platten zurück in feuchten Kammern im Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) für 20 bis 22 h (siehe Hinweis für Tag 8). </li></ol></li><li> Part-Vorbereitung der Lumineszenz-Puffer zum nächsten Tag: add DMSO und 10% Triton-X-100 auf das erforderliche Volumen des S vollständig auf 1% DMSO und 0,15% Triton X-100 zu erhalten. Lassen Sie 5 ml pro Platte Lese für Lumineszenz, plus 1 ml zur Grundierung Luminometer Injektor. </li></ol></li><li> Tag 8 Aufgabe: Lesen experimentellen Endpunkten - Fluoreszenz und Biolumineszenz. (GFP Fluoreszenzmesswerte werden als ein Mittel, um Daten zu normalisieren Biolumineszenz empfohlen). HINWEIS: Richten Sie den Endpunkten von 66-67 Stunden nach dem Essen zu lesen, um Nematoden, um signifikante Nachkommen Produktion unter den beschriebenen Versuchsbedingungen zu verhindern. <ol><li> Richten Sie Platte, die als Hintergrund Steuerung für GFP Messwerte zu verwenden. Combine auch Inhalte vom 13. Platte in eine 15-ml-Tube. Erlauben Nematoden zu begleichen (2-3 min). Verwenden Sie Überstand, um eine Mikroplatte (schwarz mit transparentem Boden) mit 100 ul Bakteriensuspension pro Vertiefung zu laden. <ol><li> Beachten Sie Hintergrundsteuerplatte unter Mikroskop notieren Brunnen, wo Nematoden zu sehen. Auszuschließen diese vom Hintergrundschätzung in nachfolgenden Datenanalyse verwendet. </li></ol></li><li> Lesen Fluoreszenz jeder Platte mit 96 Vertiefungen, einschließlich der Hintergrundsteuerung. (Einstellungen: Optik von der Unterseite der Platte; Filter 485/20 Anregungs; 528/20 Emissions.) </li><li> Bereiten Puffer für Lumineszenz-Messungen: add Luciferin (20 mM) auf Teil vorbereitet Puffer (vom Vortag), Lumineszenz-Puffer mit 1% zu erhalten DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) und 0,3 mM Luciferin (3x ). Prime Luminometer Injektor 6x mit 150 ul Puffer Lumineszenz. <ol><li> Vorheriger Schritt wird davon ausgegangen 1% DMSO als Fahrzeug während Arzneimittelexposition. Als Vehikel Wasser ist, stellen Sie die Zusammenarbeitncentration DMSO in Lumineszenz-Puffer auf 3% (dh 3 ×). </li></ol></li><li> Arbeiten mit einer Platte zu einem Zeitpunkt. Dispense 50 ul Lumineszenz Puffer pro Vertiefung. (150 &amp; mgr; l Endvolumen in gut; 3x Verdünnung von Lumineszenz-Puffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 und 0,1 mM Luciferin Endkonzentrationen.) Unmittelbar am Bewegungstisch und starten Timer. <ol><li> Nach 3 min auf Schütteltisch (160 rpm), lesen Sie Lumineszenz (1 Sekunde pro Messung). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Subtrahieren durchschnittliche GFP Hintergrund Lesen von Fluoreszenz Ergebnisse. Teilen Sie Biolumineszenz durch entsprechende GFP Lesen. <ol><li> Wenn eine hohe GFP-Wert wird für Nematoden in eine Verbindung ausgesetzt detektiert messen Fluoreszenz der Verbindung auf ihren eigenen, für jede Verbindung, Fluoreszenz zu berücksichtigen. Wenn höher als der Durchschnitt, verwenden Sie diese als Hintergrund statt. </li></ol></li><li> Express Biolumineszenz, GFP normalisierten Biolumineszenz einnd GFP-Fluoreszenz-Daten als Prozentsatz des Durchschnittswerts für die Fahrzeugsteuerung in jeder Platte. </li><li> Plot Durchschnittswerte und Fehlerbalken für jede Konzentration. </li><li> Test auf statistische Signifikanz unter Verwendung von 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Wirkung von &#39;Konzentration&#39;, &#39;Experiment&#39; und ihre Wechselwirkung (jeder Datenpunkt bezieht sich auf eine einzige gut), und verwenden Sie den Dunnett-Test als post-hoc-Test (vs . Fahrzeugsteuerung). HINWEIS: Wenn das &quot;Experiment&quot; oder die &quot;Interaktion&quot; Begriffe sind signifikant, können weitere Experimente erforderlich, um Antwort zu bestätigen. Wo keine Variabilität zwischen Experimenten ist aus der Beobachtung der Datengrundstücke ersichtlich ist, kann ein Einweg-ANOVA auf gepoolten Daten aus unabhängigen Experimenten durchgeführt werden. <ol><li> Für die statistische Analyse der Platte (n) nur mit Fahrzeug, wählen Sie alle Vertiefungen in den Spalten 6 -7 und alle Vertiefungen in der Reihe H als Kontrollgruppe (das sind die Positionen während Verbindung Tests routinemäßig Fahrzeug zugeordnet). </li&gt; </ol></li></ol>

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	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Der Modellorganismus C. elegans stellt ein leistungsfähiges experimentelles System. Es ist leicht, Kultur und produziert reichlich genetisch identische Nachkommen mit einer 3,5 Tage Lebenszyklus vom Ei bis zum Reproduzieren Erwachsenen (über juvenile Larvenstadien L1 bis L4). Aufgrund seiner geringen Größe, kann es bequem in 96-Well-Platten gezüchtet werden, die Erleichterung Substanz-Screening. Wir präsentieren eine phänotypische Screening-Protokoll basierend auf Stämme von C. elegans, die als in vivo Sensoren von Energieniveaus dienen. 14 Das Protokoll ist anwendbar auf jedes Labor, obwohl eine 96-Well-Platte Luminometer und einem sterilen Gehäuse ist nicht notwendig. Es ist wichtig, um eine Kontamination in Assays durch die Verwendung eines Labortechnik verhindern. Wenn sie manuell arbeiten, ist die maximale Anzahl der Nematodenplatten erzielbare 13 pro Versuch ermöglicht die Prüfung von 2x 96-well Platten Medikament ist und zwei Fahrzeug-Platten. Repräsentative Ergebnisse sind für die mitochondriale Komplex I Inhibitor Rotenon vorgestellte, die Superoxid-Generator Paraquat, dem Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat und vier Verbindungen mit bekannten Leuchtkäfer-Luciferase-inhibitorische Aktivität. Die ersten beiden Verbindungen führte zu einer Abnahme der Biolumineszenz wie vorherwohin Oxalacetat führte zu einer Verbesserung, eher von größer Erzeugung von ATP führen. Die Oxalacetat Datensätzen auch die intrinsische Variabilität bei Experimenten basierend auf Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu demonstrieren. Ein Minimum von drei unabhängigen Experimenten sind ratsam, um die Robustheit der Antworten auf nicht bekannten Verbindungen festzustellen. Inhibition der Firefly-Luciferase-Aktivität war erkennbar mit einem in vitro-Assay unter Verwendung eines kommerziellen Kits. 3 Eine der Verbindungen führte zu einem erheblichen Anstieg der GFP-Fluoreszenz, die mit dem Inhibitor die Erhöhung des Niveaus der GFP-markierten Luciferase durch Bindung an das Luciferase-Enzym die aktive Stelle und macht sie stabiler. 15 In einigen Fällen(in diesem besonderen Fall) kann dies zu erhöhten Werten von Biolumineszenz 15 führen, wenn der Inhibitor durch überschüssiges Substrat verschoben wird. Es ist daher wichtig, nicht zu Ergebnissen irrtümlich aus Verbindungen, die mit dem Glühwürmchen-Enzyms in Wechselwirkung zu interpretieren, wie verringerte oder erhöhte ATP-Spiegel / Funktion der Mitochondrien. Veränderungen in Lumineszenzsignal korrelieren oft mit zusätzlichen Messungen der Gesundheit wie Bewegung, Entwicklung und Wachstum. Als ein Beispiel, ist eine Verbindung, ein Verdächtiger Luciferase-Inhibitor, wenn ein dramatischer Rückgang der Biolumineszenz-Signal erkannt wird, aber Würmer sind nicht von Kontrollen durch mikroskopische Beobachtung. Eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz, nicht durch das Wachstum oder die Autofluoreszenzverbindung erläutert, kann auch auf eine Inhibitor. Eine Anzahl von Luciferase Inhibitoren 15 sind bekannt und wurden in PubChem eingegeben. Daher in erster Linie ist es gute Praxis, Informationen über Luciferase Inhibitoren durch PubChem gehalten zu konsultieren; gefolgt von testing der Wirkungen der Verbindung in in vitro-Tests mit dem gereinigten Enzym 3 und / oder die Bestätigung von Wirkungen auf die Funktion der Mitochondrien durch zusätzliche Mittel. 16,17 GFP-Fluoreszenz-Messungen ermöglichen die Erkennung von Glühwürmchen-Luciferase-Ebenen (und das Potenzial Nachweis einiger Luciferase-Enzym-Inhibitoren, wie oben erörtert) machen ein starkes Argument für die Messung dieser Endpunkt neben Biolumineszenz, soweit möglich. Normalisierung der Messwerte auf Biolumineszenz GFP ist auch ein Mittel zur Berücksichtigung der Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Vertiefungen (obwohl dies auch durch Einschluss von mehreren technischen Wiederholungen erreicht werden). Zu einer höheren Empfindlichkeit, ist es wichtig, um Hintergrundfluoreszenz von den Messungen subtrahiert. Das Protokoll beurteilt Beitrag der Bakteriensuspension auf die Hintergrund-Fluoreszenz jedoch Nematodenautofluoreszenz ist nicht für (eine Begrenzung der Strom Assay für jede Alterungs stu besonders kritisch entfielenstirbt da Nematoden Autofluoreszenz steigt mit dem Alter). Autofluoreszenz der Testverbindungen sollten auch parallel bewertet werden. GFP Normalisierung scheint unverzichtbar, wo Forscher wollen Protokoll anzupassen, um zelluläre ATP-Pools in verschiedenen genetischen Mutanten oder nach dem Schweigen der verschiedenen Genen zu vergleichen, um für Dehnungsunterschiede auf dem Niveau der Expression des Transgens Biolumineszenz steuern. Kritischen Parameter innerhalb des Protokolls sind die Entwicklungsstufe, bei der Belichtung initiiert wird, der Dauer der Einwirkung und Erhalten ähnliche Anzahl von Nematoden in verschiedenen Vertiefungen. Die Belichtung kann in jedem Stadium der Entwicklung der Nematoden L3 Stadium beginnen jedoch älter ist vorzuziehen. Von diesem Zeitpunkt an, Nematoden sind abhängig von der oxidativen Phosphorylierung für die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter, wie durch einen sehr deutlichen Anstieg der mtDNA Gehalt, Sauerstoffverbrauch und ATP-Spiegel zeigt. 18,19,20 Das vorliegende Protokoll initiiert Ausstellungenure im L4-Stadium. Der Grund für das Aliquotieren von Nematoden auf 96-Well-Platten in diesem Stadium nur (und nicht, wenn sie zum ersten Mal mit der Nahrung im L1 Stufe vorgesehen ist), ist, dass obwohl Platten in feuchten Kammern angeordnet, um Verdampfung zu minimieren, eine Verdampfungsgrad noch auftritt unsere Schüttelinkubator, wie sehr kleine Tröpfchen bilden auf den Deckeln zu sehen (das kann nicht ein Problem mit anderen Schüttelinkubatoren sein). Aliquotieren von Nematoden, Platten unmittelbar vor der Zugabe von Arzneimittel-Standards, dem eigentlichen Wirkstoffkonzentration nicht durch irgendeine kleine Veränderung des Volumens durch Verdunstung beeinflusst wird. Laden eines Nematodenplatte mit dem Vehikel allein ist sinnvoll, zu prüfen, ob Nematoden wurden gleichmäßig zwischen Vertiefungen verteilt. Signifikante Unterschiede für das Fahrzeug nur Schild wäre bezeichnend für schlechte Technik werden bei der Abgabe die Nematoden in die Vertiefungen. Die Belichtungsdauer ist ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Wenn Auswirkungen auf den Energiestatus unabhängig von Wachstum sind von Interesse, die Pro-Protokoll modifiziert werden, um kürzere Expositionen (fast unmittelbaren Reaktionen auf, zum Beispiel, 2 h) unterzubringen. Auf der anderen Seite, Eintrag von Verbindungen in C. elegans Geweben kann einige Zeit dauern. Beispielsweise 12-24 h erforderlich sind, um maximale innere Konzentrationen von Resveratrol und 5-Fluor-2&#39;-desoxyuridin (FUdR) zu erreichen. 21 daher eine längere Belichtungszeit (18 bis 24 h) kann gerechtfertigt Belichtungspegel zu maximieren. Die Belichtungszeit sollte auf Zeiten, in denen nicht ein erhebliches Maß an Wiedergabe, um Platz in der gut zu nehmen beschränkt werden. Wir empfehlen, dass die Gesamtentwicklungszeit von Nematoden unter 66-67 h gehalten. Obwohl praktisch, sind Nematoden bis dahin trächtig und haben Eiablage begonnen. Dennoch fanden wir Biolumineszenz-Messwerte von Eierzubereitungen vernachlässigbar zu sein (nicht dargestellt). Die sur-5-Promotor gesteuerte Expression des Transgens zuerst erkannt nur zwei bis zweieinhalb Stunden nach der Befruchtung bei der 100-Zellstadium 22 und der chitinous Eierschale ist wahrscheinlich, um den Eintritt von Luciferin zu begrenzen. Andere haben festgestellt, dass embryonierten Eiern nicht wesentlich dazu beitragen, den Stoffwechsel von schwangeren Erwachsenen. 23 jedoch zu vermeidende Bedingungen, die für bedeutende Nachkommen Produktion sind. Falls gewünscht, kann der experimentellen Zeitskala wieder verschoben werden: Wir haben zuvor initiierten Exposition gegenüber einem Umweltgift am späten L3 Larvenstadium (36 hr) und aus Biolumineszenz und GFP-Messungen bei 55 h durchgeführt 2 Alternativ genetischen Hintergründen, die bedingt steril sind. kann verwendet werden, um Nachkommen Produktion zu verhindern, wie zum Beispiel die fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV-Doppelmutante, die bei 15 ° C gehalten werden kann, ist aber sterile bei 25 ° C. 24. Die Verwendung von FUDR zur ​​Sterilität induziert wird nicht empfohlen, da dies kann selbst betreffen Nematodenstoffwechsels. 25. Der Test konnte auch in Stämmen mit permeabler cuticles wie partielle Verlust-Funkt geführt werdenIonen-Bus-8-Mutanten, die Multidrug-sensitive aufgrund Lässigkeit von Medikamenten zu erhöhen. 26 Dies wird kürzere Belichtungen und niedrigere Verbindungskonzentrationen erleichtern. Die Bedingungen für das Hinzufügen von Luciferin zu diesen Nematoden müssen möglicherweise auch Anpassung dh 1% DMSO und 0,05% Triton-X100 in der Lumineszenz-Puffer kann nicht verlangt werden Luciferin Verfügbarkeit zu verbessern. Das Protokoll verwendet 1% DMSO als Vehikel für Verbindung Lieferung. Obwohl nicht tödlich, diese Konzentration des DMSO hat einige biologische Wirkungen, wie wir in einer früheren Veröffentlichung. 3 diskutiert Viele der verfügbaren Medikamentenbibliotheken werden in 100% hergestellt DMSO, bei Konzentrationen, die nach Verdünnung Fahrzeug für zellbasierte Assays sein wird bis 0,1%. Höhere Konzentrationen der Verbindung erforderlich sind, um Antworten in C hervorzurufen elegans, wenn sie mit menschlichen Zellen, so daß es oft nicht möglich, Tests bei weniger als 1% DMSO durchzuführen, verglichen. Wiederum ist die Verwendung von Stämmen mitlässiger Nagelhaut kann auf die Prüfung mit geringeren Konzentrationen von Fahrzeug zu führen. Konzentrationen von DMSO von über 1% sind nicht zu empfehlen. Eine Reihe Inkubationszeit mit Luciferin vor Lesungen sollten eingehalten werden. Seinen Maximalpegel innerhalb der zweiten Minute, wie zuvor gezeigt, erreicht Lumineszenz nach Zugabe von Luciferin, relativ stabil bleibt für die ersten 5 min, gefolgt von einer langsamen Abnahme der Lumineszenz schrittweise über die nächsten 30 min 1. Kinetischen Antworten auf eine bestimmte Chemikalie kann während dieser ersten Phase von 30 min nach der anfänglichen Dosierung von Luciferin durchgeführt werden. Das Protokoll beinhaltet eine Hungersnot Schritt nach der Entnahme von Eiern, um die Synchronisation der Nematodenpopulation zu erreichen. Wir empfehlen Synchronisation von Nematodentest Populationen seit verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden sich in zellulären ATP-Spiegel und können unterschiedlich auf die Testverbindungen zu reagieren. Durch die Durchführung der Hunger in S KomplettMedium gegenüber M9 werden die Brut Nematoden mit einer Kohlenstoffquelle (Ethanol) 27,28 versehen, so daß Larven entwickeln sich nicht, sind aber nicht vollkommen ausgehungerte. Es hat sich auch gezeigt, dass L1 verhaftet sind für eine schnelle Reaktion auf Lebensmittel grundiert und normale L1 Wachstumsrate wird innerhalb von 3 Stunden nach dem Essen zur Verfügung steht 29 jedoch die Möglichkeit erreicht., es, dass der Hunger-Schritt kann den Stoffwechsel von C. ändern elegans kann nicht ausgeschlossen werden. 30 Aus diesem Grund ist die Länge des Hungers sollte 24 Stunden nicht überschreiten (18 Stunden ist ausreichend für die Synchronisation). Einige Labors haben die Möglichkeit, mit Hilfe eines Copas Biosorter für Alter Synchronisation Umgehung des Hungers Schritt ganz. Andere Laboratorien können eine Präferenz für die Erweiterung des Nematodenpopulation auf festen Medien (NGM-Platten mit OP50) vor dem Bleichen (Schritt 3.1) haben, und das wird auch gut funktionieren. Wir verwenden S Medium während der Verbindung Exposition als Standardmedium für Nematodenkultivierung, however andere Medien ausgewählt werden, zum Beispiel K Medium oder EPA mäßig hartem Wasser werden oft für ökotoxikologische Untersuchungen verwendet. 31,32 Das Protokoll bietet eine Möglichkeit, zu screenen und zu Kandidaten für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien zu identifizieren. Auf der Stufe der primären Screening ist es wahrscheinlich, dass einige Verbindungen wird durch nur eine Konzentration getestet sehen wurden daher Drogen-Bildschirme sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Zugriffe kann durch die Verwendung von Techniken zur Bewertung verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion beispielsweise der Sauerstoffverbrauch, C. validieren elegans-Stämme mit GFP-exprimierenden Mitochondrien, Flecke für mitochondriale Membranpotential und / oder ROS-Messungen. 16,33,34 Die größte Bedeutung der Methodik ist es, eine Einrichtung zum Sortieren von großen Anzahl von Verbindungen und / oder Bedingungen an der vielzelligen Organismen Pegel haben, und vor allem in der Lage sein, die Vorteile der th nehmene genetische Lenkbarkeit von C. elegans, um Wirkmechanismen zu untersuchen. Die Technik kann helfen, zu beschleunigen und zu finden, neue Wege zur Entdeckung interessanter Verbindungen und Ziele. Es ist vorgesehen, dass die Kombination des Sensors mit genetischen Hintergründen mit menschlichen Krankheiten für das Screening von Substanzbibliotheken in einem krankheitsrelevanten Kontext zugeordnet wird viel zu bieten haben.

Der Zweck dieses Verfahrens ist die schnelle Quantifizierung des Energiestatus von C. elegans in vivo im Hinblick auf die mit dieser als ein Endpunkt in Verbindung Screening. Das Grundprinzip ist bei der transgenen Expression der Luciferase in dem Fadenwurm C. basierend elegans 1-3 über das Plasmid pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> Die Luciferase-Enzyms zu dem grün fluoreszierenden Protein GFP fusioniert ist und konstitutiv und ubiquitär im Zytoplasma exprimiert (die Luciferase Peroxisomen-Targeting-Signal entfernt wurde). Dies führt zu einer Lichtemission, wenn das Substrat Luciferin wird exogen bereitgestellt. Da die Schnecken transparent ist, kann das Licht in einem Luminometer als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen werden. Zellulären ATP-Kraftstoffe der Biolumineszenzreaktion und seine Verfügbarkeit bestimmt die erzeugte Lichtpegel. Folglich bietet Luminometrie eine convenient Mittel zur Bewertung in Bezug ATP-Spiegel und durch die Erweiterung der mitochondrialen Funktion, da die ATP-Produktion erfolgt hauptsächlich in den Mitochondrien. Eine Verbindung zwischen mitochondrialen Funktion und Biolumineszenz Ebenen zuvor durch das Silencing der mitochondrialen Elektronentransportkette Gene und damit einhergehenden reduzierten Lichtleistung gezeigt. 1 Die Biolumineszenz-Stämme erzeugt wurden PE254 (feIs4) bezeichnet und PE255 (feIs5) 1 (siehe Materialliste) und können untereinander ausgetauscht werden. 3 Eine Reihe von Studien haben diese Sensor-Stämme verwendet werden, um auf die zelluläre ATP-Spiegel in vivo berichten nach Exposition gegenüber verschiedenen xenobiotischen Chemikalien wie Natriumazid 1, Cadmium 2, Abwasser Schlammextrakt 3, 5&#39;-Fluor-2-desoxyuridin 6 und eine tabakspezifische Nitrosamin 7. Die Stämme sind auch nützlich gewesen, um Auswirkungen der Bestrahlung mit UV-C-Strahlung zu überwachen <sbis&gt; 8 und Wirkungen der Störung der mitochondrialen Atmungskette. 1,9 Eine frühe Version Lumineszenzsensor das Luciferase-Gen exprimieren, ohne GFP-Fusion (PE39) wurde ebenfalls in die Untersuchung der Wirkung von Schwermetallen und eines Atmungs verwendet . Entkoppler 10 Stämme PE254 und PE255 tragen das Luciferase: GFP-Fusions und GFP-Fluoreszenz wurde gezeigt, proportional mit Nematodenmasse zu erhöhen und bietet ein bequemes Mittel zur Normalisierung der Lumineszenz-Werte 6,9 Die Auswirkungen der Unterschiedsbetrag von Würmern pro Vertiefung kann auch sein. indem mehrere technische Replikate in dem Test (mindestens 5 Vertiefungen pro Bedingung) berücksichtigt. 3 Das Protokoll bietet die Möglichkeit der in vivo-Überwachung von Energieniveaus (im Gegensatz zu technisch umständlich in vitro ATP Bestimmungen) ermöglicht Wirkstoff-Screenings und Neupositionierung im physiologischen Kontext der gesamten multicellular Organismus. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von genetischen Hintergründen durch Kreuzung der chromosomal integriertes Transgen in verfügbar Mutantenstämme und / oder durch Abschaltung von Genen durch RNA-Interferenz verlängert werden; somit unter voller Nutzung der C elegans als Modellorganismus. Das Verfahren soll helfen, Spätphasenausfall von Wirkstoffkandidaten zu reduzieren durch mitochondriale Toxizität und einen Beitrag zur Verringerung der höheren Tierversuche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Repräsentative Ergebnisse, um das Verfahren zu veranschaulichen wurden Rotenon (Abbildung 1), Paraquat (Abbildung 2), Oxalacetat (Abbildung 3) und 4-Verbindungen, die sich als Leuchtkäfer-Luciferase-Hemmer im Screening einer Medikamentenbibliothek 13 (Figur 4) aufgenommen wurden erhalten. Das Medikament Exposition wurde auf der L4-Stadium in allen Fällen begonnen, aber die Paraquat Exposition Experimente wurden bei 41 h begann nach dem Essen als erster Nematoden zur Verfügung gestellt im Vergleich zu 45-46 Stunden für die anderen Verbindungen. Das Protokoll ermöglicht eine Flexibilität bei der Auswahl der Zeit für die Initiierung der Exposition und der Belichtungslänge. Zu Screening-Zwecken, Untergangszeiten sollten eingehalten werden, wenn ausgewählt, für die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten werden. Endpunkte sollte von 66-67 h Entwicklungszeit, um umfangreiche Eiablage und Schlüpfen der Nachkommen in den Vertiefungen zu verhindern, gemessen werden. Richtlinien für die Zeitpunkte sind in T bereitgestelltLage 1. Rotenon, einem mitochondrialen Komplex I-Inhibitor, verringert Biolumineszenz, nachdem beide relativ kurz (2 h) und längere Belichtungszeiten (24 h), um einen Bereich von Konzentrationen (Abbildung 1). In diesem Fall wurden keine GFP Messungen vorgenommen, aber die Anzahl der technische Replikate verwendet (n = 6) ist ausreichend zu glätten irgendwelche Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Wells 3. Die 24-Stunden-Exposition ist ein Fenster der Zeit, über die Nematoden zu wachsen, und langsamere Entwicklung als Folge der komplexen I Hemmung wurde erwartet, dass sie auf den Rückgang der Biolumineszenz beizutragen. Dies wurde durch visuelle Beobachtung unter Stereoskop mit verzögerter Entwicklung angesehen, insbesondere bei Konzentrationen von 20 uM und darüber bestätigt; zusätzlich einige Letalität von 40 &amp; mgr; M bemerkt (qualitative Beobachtungen nicht quantifiziert). Kein Letalität wurde nach 2 h Exposition beobachtet, die jedoch Auswirkungen auf die Schneckenbewegung beobachtet. Ein starker Rückgang der Biolumineszenz relativ zu Kontrollen OCCUbei der niedrigsten Konzentration von Rotenon Rred getestet 2,5 um, für die Effekte wurden nicht einfach durch schnelle visuelle Beobachtung bei 2 St. Exposition erkannt. Dieser Rückgang der Biolumineszenz ist konsistent mit reduzierten zellulären ATP. Maximale Hemmung wurde mit der niedrigsten Konzentration von Rotenon verwendet (2,5 uM), die anzeigt, dass alle nachfolgenden Experimente gezielt Rotenon sollte zwischen 0 und 5 &amp; mgr; M [der Konzentrationsbereich 0-160 uM durchgeführt werden erzielt wurde als Teil eines Vergleichs mit anderen Arzneimitteln ausgewählt zunächst als erhebliche Auswirkungen bei 10 uM identifiziert (an anderer Stelle veröffentlicht)]. Das Herbizid Paraquat wirkt mitochondrialen Funktion durch Erhöhung von reaktiven Sauerstoffspezies. Hier, auf Biolumineszenz von C. zeigen wir seine Wirkung elegans Stamm PE254 nach Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen über 24 Stunden (Abbildung 2). Als der Stamm trägt eine luc :: GFP-Fusions, GFP-Fluoreszenz wurde also als Mittel zur Normalisierung gemessen. 6,9 Paraquat verringert Biolumineszenz GFP-Fluoreszenz und normalisiert Biolumineszenz bedeutend. Dunnet die post-hoc-Test zeigte, daß die Konzentrationen von Paraquat mit signifikanten Unterschieden in Bezug auf die Fahrzeugsteuerung wurden 4 und 8 mm für Biolumineszenz und normalisiert Biolumineszenz sowie 2 mM für normierte Biolumineszenz. Die einzige Konzentration GFP-Fluoreszenz signifikant reduziert war 8 mm, eine Konzentration, bei der Wachstumseffekte und die gelegentliche toten Wurm wurden (qualitative Beobachtungen) zu sehen. Die Abnahme der Biolumineszenz (und normalisiert Biolumineszenz) größer war als die der Fluoreszenz, die mit verringerten mitochondrialen Funktion und Auswirkungen auf die ATP-Produktion. Der Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat auf C getestet elegans-Stamm PE254 bei einer einzigen Konzentration von 8 mM, führte zu einer Zunahme der Biolumineszenz (Abbildung 3). Kein GFP fluoreszierennce Messungen erhalten wurden oder zusätzliche visuelle Beobachtung durchgeführt wird; aber solche Reaktion auf einen einzigen Zusammenschluss weitere bestätigende Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen, und detailliertere Beobachtungen von Effekten zu verdienen. Eine Verbesserung der Biolumineszenz durch diese Verbindung ist nicht überraschend, da sie postuliert, dass eine größere Aktivität des Zitronensäurezyklus führen, wobei letztendlich größere Produktion von ATP (werden dennoch wäre es ratsam, für alle Auswirkungen auf die Luciferase-Niveaus durch die Beurteilung GFP-Fluoreszenz zu steuern In nachfolgenden Experimenten). Die angegebenen Oxalacetat Datensätze zeigen das Ausmaß der Variabilität in Reaktion auf Luciferase-basierte Experimente gesehen. Nach unserer Erfahrung diese Variabilität ist eine Funktion des Testsystems vor allem für weniger schädlich Expositionsbedingungen. Die Glühwürmchen-Luciferase-Inhibitorverbindungen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 und DDD00023047 wurden sowohl in vitro, indem du Auswirkungen auf den pu getestetrified Enzym und in vivo unter Verwendung des C. elegans luc: GFP-Stamm,. Es gab keinen Beweis, daß irgendeiner der getesteten Verbindungen verursachte Nematoden Tod unter den Belichtungsbedingungen. Alle 4 Verbindungen beeinflußt, die die Luciferase-Aktivität in vitro auf die 2 Konzentrationen getestet 25 und 100 um (4A). DDD00001434 tötete die Aktivität des gereinigten Luciferase fast vollständig, die eine glaubwürdige Begründung für die große Rückgang der in vivo Biolumineszenz (4B) zur Verfügung gestellt. Obwohl die in vitro und in vivo-Tests nicht direkt vergleichbar sind, die Antwort auf DDD00023047 war in beiden Assays. DDD0001477 und DDD00000635 verursacht einen größeren Rückgang in vivo als in in vitro. Diese Verbindungen wurden in den lebenden Würmer 22 Stunden vor dem Luciferin-Substrat bereitgestellt, und die Ergebnisse können zu reflektieren, dass sie nicht leicht aus der Luciferase aktiven Stelle verschoben, wenn Luciferin wurde avaiEtikett vorzeigen. Alternativ DDD0001477 und DDD00000635 kann eine zusätzliche Wirkung auf die zelluläre ATP-Spiegel. Dies müsste durch die Glühwürmchen-Luciferase an keine beurteilen. Bemerkenswert war die starke Verbesserung der GFP-Signal in Live-Würmer DDD00000635 Verbindung ausgesetzt. Dies wird nachfolgend erörtert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die mitochondriale Komplex I-Inhibitor Rotenon verringert den Energiestatus von C. elegans durch Biolumineszenz-Stamm PE254 gemessen. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 Stunden nach dem Essen um Larven L1 vorgesehen) auf 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 uM Rotenon in 1% DMSO für 2 frei hr (kurz) oder 24 Stunden (Langzeitbelichtung) vor Lesungen der Biolumineszenz jeweils in 48 und 69 h Schnecken Entwicklung nach dem Essen zur Verfügung gestellt. Biolumineszenz (Einheit relativen Lichteinheiten, RLU) wurde als Prozentsatz des Fahrzeugs (1% DMS exprimiertWerte O). Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen an jedem Rotenon Konzentration (n = 6). Alle getesteten Konzentrationen führte zu einer statistisch hochsignifikant Differenz zur Vehikelkontrolle (p &lt;0,001). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Abbildung 2. oxidativen Stressor Paraquat verringert den Energiestatus von C. elegans-Stamm PE254 in einer konzentrationsabhängigen Weise (durch Biolumineszenz gemessen). Synchronized L4-Stadium Würmer (der Einfachheit halber im vorliegenden Fall auf 41 Stunden nach dem Essen um L1-Larven zur Verfügung gestellt) wurden auf 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 oder 8 ausgesetzt mM Paraquat 24 h. GFP-Fluoreszenz (Einheit relativen Fluoreszenzeinheiten, RFU) wurde verwendet, um Biolumineszenz-Daten (Einheit RLU), beide Endpunkte bei 65 Personalentwicklung erhalten normalisieren. Daten sind als Prozentsatz der Kontrollgruppe (1% DMSO) ausgedrückt. Fehlerbalken zeigen SEM von technischen Replikaten(n = 5 für verschiedene Konzentrationen; n = 18 für die Kontrollen). Einweg-ANOVA: *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat (8 mm) verstärkte die Biolumineszenz von C. elegans Stamm PE254. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 h nach Nahrung zu L1-Larven zur Verfügung gestellt) ausgesetzt waren frisch zubereitet 8 mM Oxalacetat 18 h ± 30 min. Biolumineszenz (Einheit RLU) wurde bei einer Entwicklungszeit von 63,5 h ± 1 h lesen und wurde als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt Fahrzeug (ddH 2 O). Verschiedene Spalten stellen verschiedene Datensätze von 8 technische Replikate auf verschiedene Platten mit 96 Vertiefungen in dem gleichen Experiment zugeordnet. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). 2-Wege-ANOVA mit &quot;set&quot; und &quot;Konzentration&quot; als Faktoren: ̵6; Set &#39;p&gt; 0.05, &quot;Konzentration&quot; p &lt;0,001 und Interaktionsterm p&gt; 0.05. EIN <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Abbildung 4. Prüfung der Antworten auf 4 Verbindungen aus der Dundee Wirkstoffforschung Verbindungsbibliothek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 und C4: DDD00023047) mit bekannter Hemmaktivität auf Glühwürmchen-Luciferase-Lumineszenz. (A) Wirkung von Verbindungen auf die Aktivität der gereinigten Glühwürmchenluciferase (gemessen als Lichteinheiten, RLU), ausgedrückt als Prozentsatz der Fahrzeugsteuerung. Der ATP-Biolumineszenz CLSII Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen mit der gleichen Menge an Luciferase-Enzym in die Vertiefungen (weiße 96-w aliquotiert verwendetell Mikrotiterplatten). ATP wurde zu einer Endkonzentration von 10 uM und 1 ul der Verbindung vorgesehen (Endkonzentration angegeben) oder DMSO (1%) zugegeben. Lumineszenzsignal wurde 10 sec integriert. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 4). Analyse: one-way ANOVA; * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. Unterschiede zwischen 25 und 100 &amp; mgr; M von großer Bedeutung für C1 (DDD00001434; p &lt;0.001) und eine signifikante für C2 und C3 (jeweils DDD0001477 und DDD00000635; p &lt;0,05). (B) In-vivo-Messungen der Biolumineszenz, Biolumineszenz normiert auf GFP-Fluoreszenz und GFP-Fluoreszenz von C elegans Stamm PE254 mit 67 h Entwicklungszeit nach Exposition mit Testverbindungen für 22 Std. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). Die statistische Analyse (Ein Weg-ANOVA) durchgeführt auf gepoolten Daten aus drei Datensätzen (3 xn = 8). * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf jeweilige Fahrzeugsteuerung. Differences zwischen 25 und 100 uM nur statistisch signifikant (p &lt;0,05) für normierte Biolumineszenz nach Einwirkung C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Uhrzeit </td><td> Tag 1 </td><td> Tag 2 </td><td> Tag 3 </td><td> Tag 4 </td><td> Tag 5 </td><td> Tag 6 </td><td> Tag 7 </td><td> Tag 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Schritt 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Übersicht über die Protokollschritte, die an jedem Tag der Nematoden Experimenten (Abschnitt 3) durchgeführt werden und schlug Timings.

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Aufrufe.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Serie: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.