Name: measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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Diese Studie wurde unterstützt durch das Korea Institute of Science and Technology intramuralen Forschungsstipendium (2E27513) und die hohe Mehrwertsteuer Food Technologie Entwicklung Programm (IPET) gefördert durch das Ministerium für Landwirtschaft, Food and Rural Affairs (315067-03).

Hinweis: das gesamte Experiment muss in einem sauberen isolierten Labor gehalten bei 20 ° C mit staubarme und Minimierung der Kontamination während der Wurm und bakterielle Behandlung durchgeführt werden. Zu diesem Zweck Experimente unter die Flamme eine Alkohol-Lampe oder mit einem sauberen Werkbank durchgeführt werden müssen.
 1. Wartung von C. Elegans und Ei-Vorbereitung auf die chemische Prüfung <ol><li>pflegen C. Elegans N2 (var. Bristol) weiterleben einer NGM Nährbodenplatte gefüttert mit E. Coli OP50 bei 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>Vorbereiten Alter synchronisiert Eiern entweder Bleichen Lösung Behandlung 5 oder die Zeit Ei Verlegung Methode 6 , 14 , 15. 
	Hinweis: vor dem Ei Zubereitung, Mantel die Etoposid-haltigen NGM-Platte mit Hitze-E. Coli OP50 wie unten beschrieben inaktivierten. Hitze-inaktivierten E coli OP50 wird verwendet, um die metabolische Aktivität von E. Coli 6 , 16 minimieren.</li>
</ol> 2. Vorbereitung von Hitze-inaktivierten e.coli OP50 Feed C. Elegans während Toxizitätstest <ol><li>500 mL doppelte Hefe Tryptone (DYT) Medium vorzubereiten, wie in Tabelle 1 beschrieben, und eine einzige Kolonie von E. Coli OP50 kultiviert auf impfen ein Luria-Bertani (LB) Agar Platte 5.</li>
	<li>E. Coli OP50 in einem schütteln Inkubator für 14 h bei 37 ° C und 150 u/min inkubieren.</li>
	<li>Nach Zentrifugation für 30 min bei 3.220 x g und 20 ° C, alle überstehenden DYT Medium zu entfernen, und fügen Sie eine Pre-Mischung von 25 mL S-Puffer, 250 µL 1 M MgSO 4 und 25 µL 5 mg/mL Cholesterin (gelöst in Ethanol). Alle diese Lösungen sind steril.</li>
	<li>Die Bakterien aufzuwirbeln und übertragen Sie sie auf eine 50 mL Einweg-Kunststoff-Rohr.</li>
	<li>Für die Hitzeinaktivierung brüten die resuspendierte E. Coli OP50 in einem Wasserbad für 30 min bei 65 ° c</li>
	<li>Abkühlen auf Raumtemperatur und Store bei 4 ° C bis zur Verwendung. Dies kann bis zu einem Monat gelagert werden.</li>
</ol> 3. Vorbereitung der NGM Platten enthält entweder 1 % DMSO oder 750 µM Etoposid <ol><li>bereiten zwei saubere 200 mL Glasflaschen. Eine Flasche 0,6 g NaCl, 0,5 g Pepton, 3,4 g Agar, 195 mL destilliertem Wasser und einem Magnetrührer hinzufügen. Die leere Flasche ein Magnetrührer hinzufügen.</li>
	<li>Autoklaven diese beiden Flaschen für 15 min bei 121 ° C, und dann abkühlen die Flaschen in einem Wasserbad für 30 min bei 55 ° c</li>
	<li>0,2 mL 1 M CaCl 2, 0,2 mL von 5 mg/mL Cholesterin, 0,2 mL 1 M MgSO 4 und 5 mL 1 M KPO-4 (alle diese Lösungen sind steril) hinzufügen und mischen sie dann durch magnetische rühren auf einer heißen Platte bei 55 ° c</li>
	<li>Unterteilen das gemischte NGM-Medium in zwei Flaschen mit dem gleichen Volumen (100 mL). Anschließend eine Flasche fügen Sie 1 mL DMSO hinzu, mischen Sie es erneut mit der magnetischen rühren. Speichern Sie die andere Flasche in einem Wasserbad bei 55 ° C erst im nächsten Schritt. Aliquoten 3 mL DMSO-haltige Mittel-bis jeweils 35 x 10 mm 2 Petrischale. Ca. 33 DMSO-haltige NGM Platten können von diesem Schritt gemacht werden.</li>
	<li>Mischen die andere Flasche mit der magnetischen rühren, fügen Sie 1 mL 75 mM Etoposid (bestand in DMSO gelöst) nochmals mixen und die aliquoten wiederholen (Schritt 3.4). Ca. 33 Etoposid (750 µM)-mit NGM Platten von diesem Schritt gemacht werden kann. 
	Hinweis: In der korrelierten zurück Papier 6 testeten wir 0, 250, 500 und 1.000 µM von Etoposid. Basierend auf diesen Daten, wir entschieden uns für die 750 µM Etoposid Dosis in diesem Papier.</li>
	<li>Cool hinunter die Chemikalie-haltigen NGM Platten auf Raumtemperatur durch verlassen sie bei Raumtemperatur für ca. 3 h und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. 
	Hinweis: Im Falle von lichtempfindlichen Chemikalien zu blockieren, Licht, Licht-induzierten Zersetzung zu minimieren. 
	Hinweis: Stellen Sie optional eine normale NGM-Platte ohne Chemikalien für die Eiablage Assay, die mit zwei verschiedenen chemischen Behandlungsbedingungen wie unten beschrieben durchgeführt werden kann.</li>
	<li>Hinzufügen 100 µL der Hitze-inaktivierten e.coli OP50 (wie beschrieben in Abschnitt 2) und auf jeder NGM Platte verteilen. Lassen Sie über Nacht trocknen in einem C. Elegans Inkubator bei 20 ° C für die chemischen Test</li>
</ol> 4. Messung von C. Elegans Wachstum <ol><li>Übertragung Alter synchronisiert C. Elegans Eiern auf der NGM-Platte ergänzt mit 1 % DMSO oder 750 µM Etoposid.</li>
	<li>Inkubieren C. Elegans in einem Inkubator bei 20 ° C für 4 Tage. Beobachtet die Würmer mit einem Stereo-Mikroskop, und mikroskopische Bilder jeden Tag. 20 X Vergrößerung (1 X Objektiv, 2 X Zoom-Vergrößerung und 10 X Okular) eignet sich in der Regel für die Beobachtung des Wachstums von C. Elegans. Auch eine mikroskopische Bild Mikroskop Bühne Mikrometer für die Kalibrierung Wurm Größe nehmen. 
	Hinweis: Hunger betrifft die Toxizitätstest. Daher füttern mit ausreichend Bakterien oder passen Sie die übertragenen C. Elegans Ei Zahlen am Anfang. Bis 3 Tage Hunger auszuschließen beobachten.</li>
	<li>Messen die Körperlänge von C. Elegans mit DMSO oder Etoposid zu jedem Zeitpunkt mit ImageJ-Software behandelt. 
	Hinweis: Für jede Probenmessung reichen 50 Würmer für die statistische Auswertung.
	<ol><li>In ImageJ, öffnen Sie das Mikroskopbild Bühne Mikrometer (&#39; Datei &#39; &#8594; &#39; öffnen &#39;). 
		Hinweis: Die Mikrometer Bild und Wurm Bilder (Schritt 4.2) müssen die gleiche Vergrößerung.</li>
		<li>Ziehen Sie eine Linie von 1.000 µm Mikrometer Kalibrierung Bild mit &#39; geraden &#39; Tool.</li>
		<li>Klicken Sie &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; Skala eingestellt &#39; und geben Sie 1.000 und µm in der &#39; Entfernung bekannt &#39; Feld und &#39; Längeneinheit &#39; box, bzw.. Überprüfen Sie &#39; Global &#39; und klicken Sie auf &#39; OK &#39;.</li>
		<li>Öffnen Sie die Wurm-Bilder (&#39; Datei &#39; &#8594; &#39; offene &#39;). Zeichnen Sie eine Linie entlang des Features jeder Wurm mit &#39; Freihandlinie &#39; Werkzeug. Der Körper Längendaten zu erhalten, indem Sie auf &#39; Analyse &#39; &#8594; &#39; Maßnahme &#39;.</li>
		<li>Wiederholen Sie diese Schritte für 50 Würmer.</li>
	</ol></li></ol> 5. C. Elegans Ei Verlegung Assay <ol><li>Inkubation der Alter-synchronisierte Eiern auf der NGM Platte mit DMSO oder Etoposid für 64 h (vor der Geburt des ersten Kindes) bis zum jungen Erwachsenen Stadium bei 20 ° c 
	Hinweis: Es ist optional, die Würmer aus dem Wachstumsversuchen Messung zu verwenden. Es ist bequem, die Messung von Wachstum und Ei Verlegung Assay zusammen.</li>
	<li>Transfer 5 Erwachsenen Würmer, die neue NGM Platten ohne Chemikalien (Bedingung 1, chemische Behandlung innerhalb einer bestimmten Frist Zeit, aus den Eiern zu jungen Erwachsenen Stadium) oder neue NGM Platte enthält die gleiche chemische Vorbehandlung (Bedingung 2, kontinuierliche Exposition des Chemikalien durch die insgesamt experimentelle Periode), und dann inkubieren sie 24 Std. 
	Hinweis: Es empfiehlt sich, Wiederholungen mit 3-5 NGM Platten für jede Behandlung zu machen; Diese Wiederholungen können für statistische Auswertungen verwendet werden.</li>
	<li>Auf die neue NGM-Platte zu übertragen, wie oben beschrieben, und die Anzahl von Eiern täglich. Zählen Sie die Würmer, die aus kroch, starben und wurden intern LukeHg.</li>
	<li>Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Würmer nicht mehr, in der Regel innerhalb von 5 Tagen Eiablage.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl von Eiern pro Wurm aus jeder Platte gelegt, und addieren Sie diese Werte jeden Tag für 5 Tage, um die Gesamtzahl der Eiablage festzustellen. 
	Anmerkung: Ohne die Anzahl der Würmer, die gecrawlt aus- und intern aus der Berechnung geschlüpft.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel beschreiben wir die Toxizität Bewertung von Chemikalien in C. Elegans, ein Boden-Nematoden mit Etoposid als vergiftendes Beispiel. Zu diesem Zweck haben wir zwei Versuchsbedingungen verwendet. In der ersten Reihe C. Elegans auf Etoposid mit Platten aus Eiern, die jungen Erwachsenen Stadium angebaut wurden, und dann durften die Würmer zur Eiablage auf normalen NGM-Platten ohne Chemikalien. In der zweiten experimentellen Gruppe wurden C. Elegans kontinuierlich mit Etoposid wä...

Toxikologische Bewertung ist wichtig für die Entwicklung von Arzneimitteln, Nutraceuticals, und Cosmeceuticals, sowie die Risikobewertung von verschiedenen Umweltgiften. Das Nagetiere Modell ist eines der beliebtesten in Vivo experimentelle Systeme für Toxikologie Studie; nicht-Säugetier-Organismen wie C. Elegans sind alternativ auch am meisten benutzt. Toxikologische Bewertung nicht-Säugetier-Modelle sind vorteilhaft, weil nicht nur tierische ethische Fragen aber auch ihre Komfort und Nützlichkeit unter Berücksichtigung von Wirtschaftlichkeit, Wartbarkeit, Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit1,2 ,3,4.
C. Elegans, einen Boden runden Wurm, hat als Modell Tier in verschiedenen Grundlagen- und angewandter Biologie und Chemie Forschung ausgenutzt worden. Es ist ein 1 mm lang, transparente Nematoden, die einfach in fester oder flüssiger Nematoden Wachstum Medien (NGM) gefüttert mit den Bakterienstamm Escherichia coli OP50 beibehalten wird. C. Elegans hat einen kurzen Lebenszyklus und Wildtyp N2 C. Elegans legt ca. 300 Eiern. Daher ist es leicht propagiert, um als experimentelle Materialien3,4,5verwendet werden. C. Elegans hat auch in den toxikologischen Studien vieler Medikamente und Umweltgifte6,7,8,9verbreitet.
Weil viele Krebsmedikamente schnell teilenden Krebszellen richten, können sie auch Schaden, sich schnell teilenden normale Zellen wie Knochenmark, Darmepithel und Haarfollikelzellen. Zum Beispiel gezielt Topoisomerase hemmenden Krebsmedikamente der DNA-Replikation werden von Krebszellen; Daher hemmen sie auch, sich schnell teilenden normale Zellen. Jeder lebende Organismus hat Adenin und diese Topoisomerase-Hemmer am ehesten Einfluss Umwelt Ökosysteme6,10,11. Somit ist eine Droge toxikologische Bewertung Plattform mit einem Modell Tier wertvoll für die Entwicklung von Arzneimitteln und Umweltverträglichkeitsprüfung.
In diesem Artikel beschreiben wir die detaillierte Protokolle, um der Toxizität von Etoposid, die einen klinischen Anti-Krebs-Agent ist, dass Ziele Topoisomerase II, als Modell giftige Chemikalie in C. Eleganszu testen. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Messmethode von Körpergröße und die Gesamtzahl der Eiablage in C. Elegans mit Etoposid behandelt.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

Toxikologische Bewertung ist entscheidend für das Verständnis der Auswirkungen von Chemikalien auf lebende Organismen in Grundlagen- und angewandter Biologie Felder. Ein nicht-Säugetier-Boden runden Wurm Caenorhabditis Elegansist eine wertvolle Modellorganismus für die toxikologischen Untersuchungen wegen seiner Bequemlichkeit und Mangel an tierethische Probleme im Vergleich zu Säugetieren tierischen Systemen. In diesem Protokoll wird ein detailliertes Verfahren der toxikologischen Bewertung von Chemikalien in C. Elegans beschrieben. Eine klinische Krebsmedikament, Etoposid, die Ziele menschlichen Topoisomerase II und DNA-Replikation von menschlichen Krebszellen hemmt, wurde als Modell chemische Tests ausgewählt. Alter-synchronisierte C. Elegans Eiern Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Etoposid ausgesetzt waren, und dann wurde das Wachstum von C. Elegans durch die Stereo-Mikroskop-Beobachtung jeden Tag für 4 Tage überwacht. Die Gesamtzahl von Eiern gelegt von C. Elegans mit DMSO behandelt oder Etoposid war auch durch das Stereo-Mikroskop gezählt. Etoposid Behandlung beeinflusst wesentlich das Wachstum und die Vermehrung von C. Elegans. Im Vergleich dazu kann die Gesamtzahl der Eiablage aus Worms mit verschiedenen Behandlungsdauer von Chemikalien, entschieden, dass die reproduktive Toxizität von Chemikalien auf die Reproduktion von C. Elegans reversibel oder irreversibel ist. Diese Protokolle möglicherweise hilfreich für die Entwicklung der verschiedenen Drogen und Risikobewertung der Umweltgifte.

Die Behandlung von Etoposid (24-96 h) verzögert deutlich das Wachstum von C. Elegans. Nach 96 h Inkubation wuchs Etoposid behandelt Würmer auf 0,86 mm Körperlänge, während das Fahrzeug behandelt Würmer bis 1,04 mm (Abbildung 1) wuchs. Retardiertes Wachstum wurde offenbar auch unter Stereomikroskop Beobachtung (Abbildung 2) beobachtet. Wir begannen zu Eiern aus dem Fahrzeug behandelt Worms bei 72 h Inkubationszeit z...

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Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Ein einfachen Protokolls zur Bewertung der Toxizität von Chemikalien in einem Modell Tier, Caenorhabditis Elegans, wird beschrieben. Die Methode ist praktisch und nützlich für die Entwicklung von Arzneimitteln sowie für die Risikobewertung von verschiedenen Umweltschadstoffe.

Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

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Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

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Serie: Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemie

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Umwelt

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Nahrungsaufnahme und Lebensdauer von Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Verhalten

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurowissenschaften

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biologie

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf