Dieses Protokoll ist eine einfache und praktikable Möglichkeit für Studenten, authentische Forschung zu betreiben, die zu veröffentlichungsfähigen Ergebnissen führen könnte. Der Hauptvorteil besteht darin, dass die Studierenden originelle Forschung zu Fragen durchführen können, die sie selbst entscheiden. Stellen Sie zunächst einen Lösungsstreuer her, indem Sie eine neun Milliliter große Pasteur-Pipette aus Glas vorsichtig in einer Bunsenbrennerflamme biegen und die Öffnung der Pipette schließen.
Dann sterilisieren Sie den Streuer vor jedem Aufstrich auf der Petriplatte. Mit einem Mikropipetter 100 Mikroliter der Verdünnung auf die Mitte des Agars legen und mit dem sterilisierten Streuer vorsichtig über die Oberfläche verteilen. Dann legen Sie die abgedeckten Petrischalen beiseite und lassen Sie die Lösung in die Oberfläche einweichen, bis sie getrocknet ist.
Für Expositionszeiträume von mehr als 12 Stunden fügen Sie 50 Mikroliter einer Nachtkultur von Escherichia coli zu den Platten hinzu, bevor Sie die Nematoden hinzufügen, während für akute Experimente von 12 Stunden oder weniger E.coli nicht auf den Platten vorhanden ist. Geben Sie mit einer Mikropipette einen Milliliter steriles Wasser auf die Platte der Nematoden. Als nächstes schwenken Sie das Wasser herum, um die Nematoden anzuheben, und entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit den Nematoden zu einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.
Nach 10 Minuten, wenn sich die Nematoden durch die Schwerkraft absetzen, entfernen Sie vorsichtig mindestens 500 Mikroliter des Wassers und entsorgen Sie. Dann suspendieren Sie die Nematoden und entfernen Sie mit einer abgeschnittenen gelben Pipettenspitze 50 bis 100 Mikroliter hängender Würmer auf jede Behandlungsplatte, um sicherzustellen, dass jede Platte mindestens 10 erwachsene Würmer enthält. Bereiten Sie zwei Dias vor, indem Sie ein Stück Etikettenband auf nur eine Seite des Objektträgers legen, um ein Pad mit gleichmäßiger Dicke zu bilden, und positionieren Sie dann ein sauberes, unbenutztes Dia zwischen ihnen auf der Tischplatte.
Legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen geschmolzener Agarose mit einem Mikropipetter auf die Mitte des Objektträgers. Flachen Sie dann den Tropfen ab, indem Sie einen weiteren sauberen Schlitten senkrecht zum Objektträger mit dem Tropfen auf die Oberseite legen, und üben Sie Druck aus, so dass der Agarosetropfen die Dicke des Beschriftungsbandes bildet. Üben Sie anschließend gleichmäßigen Druck aus, um die beiden Folien zu trennen.
Legen Sie dann diese Folie mit der Agarseite nach oben auf die Tischplatte und lassen Sie sie vor der Verwendung ein bis zwei Minuten trocknen. Um Nematoden des vorbereiteten Objektträgers mit dem Agarose-Pad hinzuzufügen, fügen Sie dem Agar-Pad einen Fünf-Mikroliter-Tropfen Wasser mit einem molaren Natriumazid hinzu, der die Würmer betäubt und mobilisiert. Dann bei 10 Nematoden pro Behandlungsobjektträger mit einem Wurmpickel auf das Tröpfchen übertragen, der vor und nach dem Transfer der Nematoden sterilisiert werden sollte.
Als nächstes fügen Sie einen Deckzettel mit einer Pinzette hinzu, indem Sie ihn in einem Winkel platzieren und langsam absenken. Anschließend legen Sie die vorbereitete Nasshalterung auf ein fluoreszierendes Mikroskop, um die Würmer zuerst unter 10-facher Vergrößerung und Phasenkontrast und dann unter 40-facher Vergrößerung mit Phasenkontrast und fluoreszierender Beleuchtung zu beobachten. Platzieren Sie jeweils eine vorbereitete nasse Halterung auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit den Clips der Mikroskoptische, beginnen Sie dann mit der Betrachtung der nassen Halterungen mit dem niedrigsten Vergrößerungsobjektiv, das typischerweise 10X beträgt, und verwenden Sie einen hellen Feld- oder Phasenkontrast, um die Nematoden zu visualisieren und zu fokussieren.
Sobald sich ein Nematode im Sichtfeld befindet, fokussieren Sie ihn mit dem feinen Fokusknopf am Mikroskop, schalten Sie dann die Beleuchtung auf Fluoreszenz, indem Sie das Drehrad drehen und das Licht auf die Kamera richten, um die digitalen Bilder aufzunehmen. Als nächstes passen Sie die Beleuchtung mit der Bildgebungssoftware so an, dass die Neuronen hell beleuchtet, aber nicht übersättigt sind. Erhalten Sie irgendwann ein separates Bild eines Lineals mit der gleichen Vergrößerung wie die Zellbilder, um eine Vergrößerungsskala für ihre Figur bereitzustellen.
Die Auswirkungen von manganhaltigen Pestiziden auf die Morphologie von Dopaminneuronen unter Verwendung eines Stammes, in dem Dopaminneuronen GFP exprimierten, wurden untersucht und zeigten ein helles Signal. Das fluoreszierende Signal bleicht jedoch aus, wenn die Neuronen über einen längeren Zeitraum Licht ausgesetzt sind. Dieses Verfahren kann Teil eines mehrwöchigen studentischen Projekts sein, das auch Verhaltens- oder andere Daten enthalten kann.
