Die Autoren danken Marcia Boulina aus der DRI imaging-zentrale Einrichtung für die Hilfe mit den Mikroskopen. Diese Arbeit wurde von NIH Zuschüsse 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 und R56 DK084321 (AC) unterstützt.

der Tierethik Ausschuss von der University of Miami hat alle Experimente angenommen.
 1. virale Infektion der intakten isolierten menschlichen oder Maus Pankreas Inselchen <ol><li>Insel-Kultur: bereiten Sie die kleine Insel Kulturmedien: Connaught medizinische Forschung Labors (CMRL) 1066, 10 % (V/V) FBS und 2 mM L-Glutamin.
	<ol><li>Menschlichen pankreatische kleinen Inseln werden von der integrierten Islet Vertriebsprogramm (NIDDK, NIH) erhalten. Nach der Ankunft transfer der Inseln (~ 500 Inselchen Äquivalente) auf 35 mm nicht-Zellkultur Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt.</li>
		<li>Maus Pankreas Inseln absperrbar nach vorher festgelegten Protokolle 16. Nach Isolierung, Kultur ~ 200 Inselchen Entsprechungen im Gewebe Kultur 35 mm Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt. 
		Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung transgener Mäuse mit GFP oder YFP Reportern äußerte auf kleinen Inseln zur Vermeidung von Überschneidungen der Fluoreszenz mit NPY-pHluorin.</li>
	</ol></li> <li>Virus Vorbereitung Hinweis: die NPY-pHluorin Fusion wurde in die pcDNA3 Vector 10 kloniert und subcloned in einem adenoviralen Vektor für adenoviralen Produktion [Adenovirus Serotyp 5 (DE1/E3)] durch einen rekombinanten Adenovirus produzierendes Unternehmen. Das Virus wurde regelmÄÑig und bei-80 ° c gelagert Die virale Lager erfolgt durch das Unternehmen bei Titer von 10 12 10 13 Viruspartikel (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>Für in-vitro- Inselchen Infektion, Einsatz 10 6 PFU/mL, was eine ungefähre Multiplizität der Infektion (MOI) von rund 2 (siehe Diskussion für Details)</li></ol></li>
	<li>Virusinfektion des Pankreas Inselchen 
	Achtung: Arbeiten mit Adenoviren erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) Verfahren und Zertifizierung. Überprüfen Sie mit dem institutionellen Biosafety Officer für Beratung und Schulung auf BSL2 Verfahren.
	<ol><li>Mensch/Maus Inselchen vorbereiten, wie oben beschrieben.</li>
		<li>5-10 µL Lager Virus hinzufügen jede 35 mm Petrischale mit Mensch/Maus Inselchen in 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin). 
		Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke des Virus nach der viralen Titer verwendet, wie es von der Firma Datenblatt.</li>
		<li>Kultur der Inseln in Virus-haltigen Medien bei 37 °C/5% CO 2 für 24 Std.</li>
		<li>Nach 24 h, aspirieren Sie die Virus-haltigen Medien und ersetzen durch 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin).</li>
		<li>Kultur der Inseln für 4-6 Tage bei 37 °C/5% CO 2, Austauschen der Medien alle 3 Tage.</li>
		<li>Nach 4 - 6 Tagen Kultivierung, erwarten rund 30 % der Inselzellen, angesteckt zu werden. Inselchen können dann für live-imaging-Experimente verwendet werden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal Imaging von infizierten Inselchen Hinweis: beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Materialien und Ausrüstung für die konfokale Bildgebung erforderlich.
<ol><li>Reagenz Vorbereitung und Versuchsaufbau <ol><li>bereiten extrazelluläre Lösung: Fügen Sie 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % BSA, pH 7,4, steril gefiltert. 
		Hinweis: Dieser Puffer wird normalerweise ohne Glukose vorbereitet und kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. Glukose wird am Tag des Experiments zu erreichen die gewünschte Endkonzentration hinzugefügt.
		<ol><li>Prepare basalen Glukose (3 mM) Medium: 50 mL extrazelluläre Lösung 75 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen.</li>
			<li>Hyperglycemic (16 mM) Medium: extrazelluläre Lösung 50 mL 400 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen</li></ol>
		</li> <li>Zusätzliche Anreize (z.B., KCl oder Adenosintriphosphat (ATP)) in extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose verdünnen.</li>
		<li>Vor dem Start eines Experiments vorbehandeln Deckgläsern mit Poly-D-Lysin indem das Deckglas für 1 h 30 µL Poly-D-Lysin-Lösung (1 mg/mL) hinzufügen und gründlich spülen es mit H 2 O. 
		Hinweis: Die Poly-Lysin beschichtet Deckgläsern können bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gespeichert werden.</li>
		<li>Mindestens 1 h vor dem Experiment, mit einer 1-mL-Pipette, übertragen die Inseln auf einer 35-mm-Petrischale, extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose enthält. Halten Sie die kleinen Inseln auf 37 ° C und 5 % CO 2. 
		Hinweis: Bei Bedarf können die Plasmamembran in diesem Arbeitsschritt beschriftet werden. Fügen Sie 2 µM di-8-ANEPP Farbstoff um die Plasmamembran zu beschriften hinzu, die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Inkubieren Sie die Inseln in Farbstofflösung für 1 h bei 37 °C/5% CO 2. Der Plasmamembran Farbstoff kann begeistert sein, auf 488 nm und entdeckt bei 620 nm.</li>
		<li>min vor dem Start ein Experiment, das Deckglas zuordnen der bildgebenden Kammer durch mit Vakuum Silikonfett abdichten. Die bildgebende Kammer zur imaging Plattform zu beheben. Mit einer Pipette legen Sie 20-30 Inselchen auf Poly-D-Lysin-behandelten Bereich das Deckglas und lassen die kleinen Inseln an der Oberfläche für 20 min. haften 
		Hinweis: Es ist wichtig, nicht das Deckglas zur Vermeidung von Beschädigungen der Insel vollständig trocknen lassen.</li>
		<li>, Während die kleinen Inseln das Deckglas einhalten bereiten die Perfusion System durch gründlich mit Wasser spülen. Fügen Sie jede Lösung auf einen anderen Kanal: 3 mM Glukose (Kanal 1), 16 mM Glukose (Kanal 2), 16 mM Glukose mit 100 µM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 10 µM Forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM Glukose (Kanal 4), 10 µM ATP in Glukose () 3 mM Kanal 5). Entfernen Sie alle Luftblasen aus dem System durch jeden Kanal separat öffnen und die Lösung fließen zu lassen, für ein paar Minuten, und stellen Sie sicher, dass die Strömung konsistent (0,5 mL/min) und der Schlauch ist nicht undicht.</li>
		<li>Verbinden die einzelnen Inline-Lösung Heizung der Perfusion Ablaufrohr ins freie ab und stellen Sie die Temperatur des Puffers abfließende auf 37 ° c</li>
		<li>Bereiten die Saugpumpe. Alle Luftblasen aus dem System entfernen, und stellen Sie sicher, dass die Strömung und der Schlauch ist nicht undicht.</li>
		<li>Sobald die Inseln an die Oberfläche Deckglas haften sanft Auffüllen der bildgebenden Kammer die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Zu vermeiden, waschen Sie die Inseln weg von der Oberfläche des Deckglases.</li>
		<li>Legen Sie die Image Plattform mit den Inseln auf den Mikroskoptisch und verbinden Sie es mit der Perfusion System und Saugpumpe.</li>
		<li>Wiederum auf den Fluss und ständig durchspülen der Inseln mit der 3G extrazelluläre Lösung. Das System ist nun bereit für die konfokale Bildgebung.</li>
	</ol></li> <li>Confocal Imaging <ol><li>Suchen Sie die kleinen Inseln im Feld Mikroskop mit geringerer Vergrößerung. Nachdem auf den kleinen Inseln konzentriert, wechseln Sie zu höheren Vergrößerung Ziele (z.B., 63 X Wasser eintauchen Ziel (63 X / 0.9 NA)).</li>
		<li>Den Erwerb mit Software (Table of Materials) öffnen und die resonante Scanner-Modus zu aktivieren.</li>
		<li>Den XYZT-imaging-Modus wählen und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt: <ol><li>biegen Sie auf die Argon Laser 488 nm Laser Linie und passen Sie die Leistung des Lasers zu 50 % bei pHluorin Erregung.</li>
			<li>Sammeln Emission bei 505-555 nm.</li>
			<li>Wählen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixel. Drücken Sie die &#34; Live &#34; Schaltfläche Starten Sie Imaging und passen den Gewinn (typische Gewinn beträgt rund 600 V).</li>
			<li>Set, Beginn und Ende der Z-Stapel: konzentrieren Sie sich auf der Spitze der Insel und wählen Sie &#34; Begin &#34; und wechseln zur letzten Ebene, die konzentriert werden, und wählen Sie &#34; Ende &#34;. Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.</li>
			<li>Legen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel in der Nähe von 1,5-2 s und wählen Sie die Option &#34; erwerben bis &#34; für die kontinuierliche Bildgebung.</li>
			<li>Drücken Sie den &#34; Start &#34; Schaltfläche "ini"tialize.</li>
		</ol></li> <li>Verwenden verschiedene Protokolle Stimulation induzieren Granulat Exozytose Vorrichtung die Inseln mit den gewünschten reizen. Stimulation-Protokolle können angepasst werden die gewünschten wissenschaftlichen Zweck (siehe unten).</li>
	</ol></li> <li>Stimulation Protokolle Hinweis: In jedem Protokoll Stimulation beginnen, durch die Aufnahme von mindestens 2 min Inselchen Hintergrundaktivität während konstante Perfusion mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Durchspülen Sie mit ein Stimulans für den gewünschten Zeitraum. Die Reihenfolge der Stimulanzien, Dauer der Stimulation sowie Dauer der Aufnahmen kann der gewünschte wissenschaftliche Zwecke angepasst werden. Achten Sie auf Inseln mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose vor Beginn einer neuen Stimulation gründlich waschen. Unten finden Sie die Probe-Stimulation-Protokolle, die verwendet wurden, um die Methode-Fähigkeiten unter Beweis.
	<ol><li>Stimulieren mit Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) als Positivkontrolle für pHluorin pH-Wert Empfindlichkeit und Virusinfektion Effizienz ( Abbildung 3): 3 mM Glukose (2 min) &#8594; 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM Glukose &#8594; 3 mM Glukose (2 min) Hinweis: im NH 4 Cl Lösung ersetzen NaCl äquimolaren Gesundheitsprüfungen.</li>
		<li>Stimulieren Insulin Granulat Exozytose durch Erhöhung der Glukosekonzentration ( Abbildung 5 und Abbildung 6): 3 mM Glukose (2 min) &#8594; 16 mM Glukose (15-30 min) &#8594; 3 mM Glukose (2 min 
		Hinweis: Um mehrere Aktivitätsspitzen sehen, durchspülen der Inseln ständig mit 16 G Lösung für mindestens 15 min. 
		Hinweis: Um die Konsistenz der sekretorischen Antworten 17 zu erhöhen, können Benutzer Erhöhung der cAMP Agenten (100 µM IBMX und 10 µM Forskolin) die 3 G und 16 G Lösungen hinzufügen. Dies ändert nicht die zeitlichen Muster der Granulat-Sekretion. 15 und Diskussion siehe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis.">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li><li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. 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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die Exozytose von Insulin-Granulat in Beta-Zellen in intakten pankreatischen kleinen Inseln zu visualisieren von konfokalen Mikroskopie verwendet werden kann. NPY-pHluorin verwendet als der fluoreszierenden Reporter in Adenovirus kloniert um eine hohe Transfektion Effizienz zu gewährleisten.
Obwohl die Methode höchst effizient in unseren Händen war, erfordert möglicherweise einige Änderungen, die in erster Linie von zwei Parametern abhängig sind...

Insulin wird von den Betazellen der Bauchspeicheldrüse Insel produziert und es ist ein wichtiger Regulator der Glukose-Stoffwechsel-1. Tod oder Dysfunktion der Betazellen stört Glukose Homöostase und führt zu Diabetes2. Insulin wird in dichten Kern-Granulat, das in einem Ca2 +freigesetzt werden verpackt-abhängigen Weise3. Aufklärung, wie Insulin Granulat Exozytose reguliert wird ist wichtig zu verstehen, was bestimmt Insulinsekretion und eröffnet neue Wege für die Identifizierung der neue therapeutische Targets für die Behandlung von Diabetes.
Exozytose von Insulin wurde durch elektrophysiologische Ansätze wie Membran Kapazität Messungen und mikroskopische Ansätze in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ausgiebig untersucht. Membran Kapazität Messungen haben gute zeitlichen Auflösung und einzelne Zelle Aufnahmen erlauben. Jedoch Änderungen in der Kapazität reflektieren die Oberfläche Nettoveränderung der Zelle und nicht einzelnen Fusion Ereignisse erfassen oder Insulin Granulat Fusion aus anderen Nichtinsulin sekretorischen Vesikel3zu unterscheiden. Mikroskopisch kleine Ansätze, wie ein zwei-Photonen oder vollständige interne Reflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Sonden und Vesikel Ladung Proteine, geben Sie weitere Details. Diese Techniken steht Einzelveranstaltungen und auch die Pre- und Post-steht Phasen zu erfassen und können für das Studium steht Muster in den Bevölkerungen der Zellen3verwendet werden.
Fluoreszierende Reporter kann von drei Arten: 1) extrazelluläre, 2) zytoplasmatischen oder (3) vesikuläre. (1) extrazelluläre Reporter sind polar Tracer (z.B. Dextrans, Sulforhodamine B (SRB), Luzifer gelb, Pyranine), die durch die extrazelluläre Milieu4eingeführt werden können. Die Verwendung von polar Tracer ermöglicht die Untersuchung der Fusion Pore in einer Bevölkerung der Zellen und nimmt verschiedene interzelluläre Strukturen wie Blutgefäße. Sie berichten jedoch nicht auf Vesikel Ladung Verhalten. (2) zytoplasmatischen Reporter sind fluoreszierende Sonden gekoppelt an Membran-assoziierte Proteine, die Gesicht Zytoplasma und Andocken und Exozytose beteiligt sind. Beispiele hierfür sind Mitglieder der löslichen N- Ethylmaleimide-Sensitive Faktor Anhaftung Rezeptor (SNARE) Proteinfamilie, die erfolgreich eingesetzt in den Neurowissenschaften für das Studium der Neurotransmitter-Freisetzung-5. Solche Proteine haben mehrere Bindungspartner und sind nicht Insulin-Granulat bestimmte. (3) vesikuläre Reporter sind fluoreszierende Sonden verschmolzen, vesikuläre Ladung Proteine, die für die Untersuchung von Fracht-spezifische Vesikel Verhalten ermöglichen. Insulin-Granulat spezifische Ladung Proteine sind Insulin, c-Peptid und Inselchen Amyloid Polypeptid NPY u.a.6,7. NPY ist nur in Insulin mit Granulat und ist zusammen mit Insulin, so dass es einen hervorragenden Partner für eine fluoreszierende Reporter8veröffentlicht.
Die Verschmelzung von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zu NPY hat zuvor eingesetzt, um verschiedene Aspekte der Exozytose in neuroendokrinen Zellen, wie die Anforderungen der spezifischen Synaptotagmin Isoformen9,10 zu studieren und wie die zeitlicher Verlauf der Freigabe hängt von dem Aktin-Zytoskelett und Myosin II11,12. In dieser Studie wählten wir pHluorin als fluoreszierende Reporter, die eine veränderte GFP, die nicht fluoreszierenden ist bei den sauren pH-Wert im Inneren Rumpfkern Granulat wird aber hell fluoreszierende bei Kontakt mit der extrazellulären pH-neutral-13. Reife Insulin Granulat haben einen sauren pH-Wert unter 5,5. Sobald das Untermodul "mit der Plasmamembran und öffnet verschmilzt, ist die extrazelluläre Nullph von 7,4, erlaubt die Verwendung von pH-Sensitive Proteine pHluorin als Reporter7,14seine Ladung ausgesetzt.
Angesichts der Sensibilität der pH-Wert des pHluorin und die selektive Expression von NPY in Insulin-Granulat kann die NPY-pHluorin Fusion Konstrukt verwendet werden, verschiedene Eigenschaften von Insulin Granulat Exozytose zu studieren. Die virale Lieferung des Konstrukts Fusion sorgt für hohe Transfektion Effizienz und arbeitet an primären Betazellen oder Zell-Linien sowie auf isolierten Inseln. Diese Methode kann auch als Richtlinie verwendet werden, für das Studium in einer anderen Zelle Art mit NPY-haltige Vesikel Exozytose. Es kann auch mit einer transgenen Mausmodell Studie zu Auswirkungen von bestimmten Bedingungen (Niederschlägen, Überexpression, etc.) auf Exozytose kombiniert werden. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um räumliche und zeitliche Muster der Insulinsekretion Granulat in Beta-Zell-Populationen in menschlicher Inselchen15zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>Upright laser-scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS-SP5</td><td>includes LAS AF, the image acquisition software</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Imaging chamber platform</td><td>Warner instruments</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 glass coverslips</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum silicone grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel perfusion system</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Suction pump</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish, non-tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Medium, no glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl solution</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl solution</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;solution</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;solution</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES solution</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal imaging of neuropeptide y-phluorin: a technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets

Insulin-Sekretion spielt eine zentrale Rolle in Glukose Homeostasis unter normalen physiologischen Bedingungen, wie bei Krankheit. Aktuelle Ansätze für Insulin Granulat Exozytose studieren entweder Elektrophysiologie oder Mikroskopie gekoppelt, um die Expression von fluoreszierenden Reporter verwenden. Aber die meisten dieser Techniken wurden optimiert für klonale Zelllinien oder erfordern abkoppelt pankreatische kleinen Inseln. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier vorgestellte Methode für Real-Time Visualisierung von Insulin Granulat Exozytose in intakten Pankreas Inseln. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Virusinfektion isolierte pankreatische Inselchen mit Adenoviren, die ein pH-Sensitive grünes fluoreszierendes Protein (GFP), pHluorin, gekoppelt an Neuropeptid Y (NPY) kodiert. Zweitens, beschreiben wir die konfokale imaging von Inselchen fünf Tage nach Virusinfektion und Granulat Insulinsekretion zu überwachen. Kurz, die infizierten Inselchen auf ein Deckglas auf einem bildgebenden Kammer gesetzt und abgebildet unter eine aufrechte Laserscanning-confocal Mikroskop während wird kontinuierlich mit extrazelluläre Lösung, enthält verschiedene Reize durchblutet. Konfokale Bilder über 50 µm der Insel sind als Zeitraffer-Aufnahmen mit einem schnell-Resonanz-Scanner erworben. Die Verschmelzung von Insulin Granulat mit der Plasmamembran kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Verfahren auch erlaubt die Prüfung einer Batterie von Reizen in einem einzigen Experiment ist kompatibel sowohl mit Maus als auch mit menschlichen Inselchen und ist kombinierbar mit verschiedenen Farbstoffen für funktionelle Bildgebung (z.B. Membran potenzielle oder zytosolischen Kalzium Farbstoffe).

Der gesamte Workflow von der Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz, Maus oder menschliche Inseln können mit Adenoviren NPY-pHluorin-Codierung infiziert und abgebildet, nach paar Tagen in Kultur unter einem confocal Mikroskop. Als Granulat mit Plasmamembran und offenen Sicherung, eine Zunahme der Fluoreszenz wird beobachtet und quantifiziert werden kann (Abbildung 1). Um festzustellen, ob NPY-pHluorin in der Tat ein geeigne...

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Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Aufrufe.  University of Miami. Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.

Serie: Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Forschung

Medizin

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Biotechnik

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologie und Infektion

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Biologie

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Intrazelluläre Signalereignisse und Hormonsekretion in menschlichen Pseudoinseln

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Inselanomalien und -funktionen mit einem Pseudoislet-Protokoll 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Schneiden der menschlichen Bauchspeicheldrüse für die Erforschung der Inselfunktion

Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the pancreas endocrine and exocrine physiology and interplay. Much has been learned from the study of isolated pancreatic islets, but this prevents examining their function and interactions in the context of the whole tissue. Pancreas slices provide a unique opportunity to explore the physiology of normal, inflamed, and structurally damaged islets within their native environment, in turn allowing the study of interactions between endocrine and exocrine compartments to better investigate the complex dynamics of pancreatic tissue. Thus, the adoption of the living pancreas slice platform represents a significant advancement in the field. This protocol describes how to generate living tissue slices from deceased organ donors by tissue embedding in agarose and vibratome slicing as well as their utilization to assess functional readouts such as dynamic secretion and live cell imaging.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Typ-1-Diabetes-Forschung mit innovativen Pankreasschnitt-Plattformen

This protocol describes how to generate human pancreas slices from deceased organ donors to study cell function under near-physiological conditions. This innovative approach enables the investigation of normal and structurally damaged islets and the intricate interplay between endocrine and exocrine compartments.

Generierung von menschlichen Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der endokrinen und exokrinen Pankreasphysiologie

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the ...

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Zusammenfassung

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Lepr

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Generierung von menschlichen Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der endokrinen und exokrinen Pankreasphysiologie