We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).

HINWEIS: Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren wurden von der Bioethik-Kommission der Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankreich (CEEALV / 2011-08-01) zugelassen. 1. Instrumentenaufbereitung <ol><li> Bereiten Sie und reinigen Sie die folgenden Instrumente zur Kathetereinführung: Mikro-Pinzetten, Mikroscheren, Mikrogefäßklemme, große Scheren, chirurgische Faden (Black geflochtenen Seide 4-0) und eine 14 G-Katheter. Heparinisierung den Katheter mit einer Heparinlösung (5000 U / ml). </li><li> Bereiten Sie und reinigen Sie die folgenden Instrumente für die Laminektomie: große Schere, Skalpell und einer Knochenschneider. Führen Laminektomie mit einem maßgeschneiderten Knochenschneider entwickelt, um das Risiko der Schädigung des Rückenmarks während der Laminektomie (Abbildung 1) zu reduzieren. </li><li> Aufbau des 3D-Rahmens für die Positionierung und Stabilisierung des Tieres verwendet. Maßgeschneiderte Rahmen ist mit den Elementen eines Fixateur externe Hoffman 3 in Verbindung mit einer Pinzette, gebaut which haben, um die Lendenwirbelsäule des Tieres passen gebogen worden. </li><li> Bereiten Sie das Gewicht-Drop-Einrichtung (Impaktor) zum Rückenmark biomechanischen Verletzungen verwendet. HINWEIS: Die maßgeschneiderte Schlagvorrichtung wurde mit einer 3D-Software entwickelt und in 3D gedruckt. </li><li> Schalten Sie das Ultraschallgerät. </li><li> Bereiten Sie das Kit zur Rekonstitution des Kontrastmittels. HINWEIS: Das Kit enthält 1 Durchstechflasche mit 25 mg gefriergetrocknetes Pulver, 1 Fertigspritze mit 5 ml Natriumchlorid und einem Mini-Spike-Transfersystem (Abbildung 2). Die Schritte zur Rekonstitution des Kontrastmittels sind nachstehend aufgeführt (siehe Abschnitt 5). </li></ol> 2. Vena jugularis Katheterisierung (Abbildung 3) <ol><li> Betäuben das Tier mit 4% Isofluran. Legen Sie das Tier in Rückenlage. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch die Gewährleistung, dass das Tier nicht reagiert, wenn die Pfoten sind mit einer Zange gequetscht. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit, während und verhinderner Anästhesie. </li><li> Rasieren Sie den Hals und reinigen die Haut. Einen Einschnitt auf der Mittellinie des Halses. Fahren Sie den sternocleidomastoidian Muskel, um die internen Halsschlagader zu finden. Ziehen Sie eine Ligatur am rostralen Teil der Vene. </li><li> Tragen Sie eine mikrovaskuläre Klemme an der Vene, 1 cm unterhalb der Ligatur. Übergeben Sie einen anderen Thread um die Vene, direkt unterhalb der Klemme mit dem Knoten bereit zu sein anziehen, wenn die Klemme gelöst wird. </li><li> Öffnen Sie die Wand der Vene (Venotomie) zwischen der Klemme und dem rostralen Ligatur. Einführung einer 14 G-Katheter in das Lumen der Vene und schieben Sie es in Richtung des Herzens. </li><li> Wenn es darum geht gegen die Klemme, lassen Sie die letztere und schieben Sie den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter in die Vene, durch festes Anziehen der Knoten auf der Vene mit dem Katheter im Inneren. </li><li> Beurteilen Durchgängigkeit des Katheters durch Entnahme einer kleinen Menge von venösem Blut in den Katheter und in der Folge dann Spülen mit heparinisierter Kochsalzlösung. Dies verhindert Verstopfung der catheter durch eine Potential Blutgerinnsel. </li><li> Verbinden flexiblen Schlauch an den Katheter für eine weitere Injektion von Kontrastmittel (Mikroblasen). Halten Sie es geschlossen (abgedichtet) bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Zugriff auf die Wirbelsäule, Laminektomie und Rat Positionierung (in der 3D-Rahmen) <ol><li> Legen Sie das Tier in einer flachen anfällig horizontale Position. Rasieren und reinigen Sie den Rücken (Brustbereich) des Tieres. </li><li> Identifizieren Sie die letzten Rippe (XIII bei der Ratte) durch Palpation (Abbildung 4). Dies erlaubt es, die Position des XIII Brustwirbel (ThXIII) zu schätzen. </li><li> Machen Sie eine 4 cm Hautschnitt auf der Mittellinie, auf ThXIII zentriert. Öffnen Sie den Hautschnitt sowie die zugrunde liegenden Schleimbeutels. Beachten Sie die Aponeurose der Rückenmuskulatur sowie die Spitzen der Wirbelsäule Prozesse. </li><li> Die Wirbelsäule Prozess der ThXIII sorgfältig zu lokalisieren durch Palpation XIII Rippen. HINWEIS: Der XIII Rippe zu ThXIII verbunden und stellt somit eine einfach zu locate anatomische Landmarke für die Identifikation von ThXIII. Dieser Schritt ermöglicht die Lokalisierung des ThXII auf Dornfortsatz sowie L1 und L2 (ersten und zweiten Lendenwirbel) THIX. </li><li> Schneiden Sie die Muskelsehnenplatte und nehmen Sie die Muskeln auf beiden Seiten, um die Dornfortsätze, die Lamellen und der Facettengelenke aus Thix zu L2 aus. Setzen die lateralen Seite von L1 und L2 durch Ablösen Muskeln von den Querfortsätzen. </li><li> Haken Schneidezähne des Tieres auf der 3D-Rahmen, um die Position (Abbildung 5) zu sichern. Klemmen die L1- und L2-Wirbel mit den modifizierten Pinzette. Schließen Sie die modifizierte Zange zum 3D-Rahmen, um das Tier zu stabilisieren. </li><li> Gently kaudal ziehen die Zange Halten der Lendenwirbelsäule, um die gesamte Wirbelsäule festziehen und den Brustkorb von der Bank zu erhöhen. HINWEIS: Bei der beschriebenen Anordnung sollte das Tier in der Lage zu atmen ist. Außerdem besteht, auch Atembewegungen des Brustkorbs, der Wirbelsäule und des RückenKabel sollte auch unbeweglich bleiben. </li><li> Entfernen Sie die Dornfortsätze processess von Thix zu ThXII. Die untere Klinge des Knochenschneider Schieben Sie unter dem linken Lamina ThXII und schließen Sie die Knochenschneider, um die Lamina (Abbildung 6) zu schneiden. </li><li> Wiederholen Sie das gleiche Manöver für den rechten Lamina und nacheinander entfernen Sie den hinteren Bogen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für die Wirbelkörper ThXI zu Thix um ein Vier-Stufen-Laminektomie zu erreichen. Entfernen Sie die beiden Facettengelenke für jeden Wirbel. HINWEIS: Während des gesamten Verfahrens, reinigen Sie das Operationsfeld von lokalen Blutungen. Dafür verwenden Wattestäbchen und Spülung mit lauwarmem Salzlösung. Hämostase systematisch erfolgt innerhalb weniger Minuten. </li></ol> 4. CEU Probe Positioning <ol><li> Decken Sie die Dura mater mit Ultraschall-Gel. Dies erlaubt eine wirksame Übertragung der Ultraschallwellen zwischen der Sonde und des Rückenmarks (Abbildung 7). </li><li> Stabilisierung der Ultraschallsonde witha Klemme, die nachfolgend zu dem 3D-Rahmen durch eine Gelenkarm verbunden werden kann. Manuell positionieren Sie die Sonde. Sicherzustellen, dass die Sonde so ausgerichtet ist, um einen schrägen Längs Sagittalscheibe erhalten. In einer korrekten Position befindet, ist das Rückenmark streng horizontal auf dem Bild und der Zentralkanal im Rückenmark entlang der vollen Segment des Rückenmarks ist sichtbar. HINWEIS: Positionierung sollte von der Echtzeit-B-Modus-Bild auf dem Bildschirm des Ultraschall-Maschine angezeigt leiten. Die Brennweite der Ultraschallsonde sollte mit der Zentralkanal im Rückenmark ausgerichtet werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die hintere Seite des Rückenmarks zugänglich ist, die letztlich für die Positionierung des Stoß ermöglichen. </li><li> Bei optimalen, sperren Sie die Gelenkarm, um die Position zu stabilisieren. </li></ol> 5. Herstellung von Kontrastmittel - Mikroblasen Rekonstitution <ol><li> Verwenden Sie den Inhalt einer kommerziellen Rekonstitution Kit und schließen Sie die Kolbenstange durch Befestigung tightly in die Spritze (im Uhrzeigersinn). Öffnen Sie das Transfersystem Blister und entfernen Sie die Spritze Spitzenkappe. Öffnen Sie das Transfersystem Kappe und schließen Sie die Spritze mit dem Transfersystem (Befestigung fest). </li><li> Entfernen Sie die Schutzscheibe aus dem Fläschchen. Schieben Sie die Schale in die transparente Schutzhülle aus der </li><li> Transfersystem und drücken Sie sie fest, um die Ampulle zu sichern. </li><li> Leeren Sie den Inhalt der Spritze in die Durchstechflasche, indem Sie an der Kolbenstange. Kräftig schütteln für 20 Sekunden, um alle Inhalte in der Ampulle zu mischen, um eine milchig weiße homogene Flüssigkeit zu erhalten. </li><li> Das gesamte System und vorsichtig in die Spritze zurückziehen das Kontrastmittel. Schrauben Sie die Spritze aus dem Transfersystem. Nach der Zubereitung (wie vorgeschrieben), 1 ml der erhaltenen Dispersion enthält 8 ul Schwefelhexafluorid in den Mikrobläschen. Zeichnen Sie die Suspension von Mikrobläschen in einen 100-ml-Spritze. Legen Sie die 100-ml-Spritze in die Elektropumpe. Schließen Sie den Deckel. </li><li> Starten konstanter Bewegung der Wiederkonstituierten Mikrobläschen. Erhalten konstantem Rühren durch langsames Drehen der Spritze, die die Mikrobläschensuspension beibehält. Schließen Sie die Pumpe an die Jugularkatheter durch den Schlauch. Stellen Sie das Ultraschallgerät auf &quot;Harmonic Mode&quot;. HINWEIS: Die Letzterer entspricht dem Modus, in dem die Mikrobläschen spezifisch nachgewiesen und visualisiert werden. Dieser Modus hat eine geringe mechanische Index, der die Mikrobläschen nicht zerstört, im Gegensatz zu dem B-Modus. </li><li> Spülen Sie den Katheter durch Infusion eine erste Dosis (400 ul) des Kontrastmittels. Während dieser ersten Infusion, überprüfen Sie, dass die Mikrobläschen haben auf dem Ultraschallbildschirm. Dies bestätigt, dass die gesamte Schaltung (aus der Spritze in den Blutkreislauf der Ratte) intakt und offen ist. </li><li> Stellen Sie das Ultraschallgerät auf &quot;B-Modus&quot;, um das Rückenmark Parenchym und die Zerstörung der wenigen Mikrobläschen in den Blutkreislauf verbleibende zu visualisieren. Die hohe Frequenz der &quot;B-Mode&quot; tranSmits hohe Energie, um den Mikrobläschen, die es ihnen ermöglicht Zusammenbruch. </li><li> Lassen Sie das Tier lag noch für ca. 30 min. Diese Frist ermöglicht die Stabilisierung der hämodynamischen Parameter. </li></ol> 6. Bewertung der SCBF im Intact Spinal Cord <ol><li> Stellen Sie das Ultraschallgerät auf die &quot;Harmonic Mode&quot;. Starten Sie gleichzeitig (1) Infusion von Kontrastmittel (400 &amp; mgr; l) und (2) des Chronometers. HINWEIS: Während der Infusion sollte die Konzentration der Mikrobläschen in den Blutkreislauf zu erhöhen, so dass der Kontrast Vorstellung des Rückenmarks (Abbildung 8). Da die Mikrobläschen schnell zerstört, die Blutkonzentration von Mikrobläschen abzunehmen beginnt, sobald das Einspritzen beendet, die eine fortschreitende Abnahme in Kontrastdarstellung des Rückenmarks erzeugt. </li><li> Nach 1 min, wählen Sie (drücken) der &quot;Clip-Store&quot; auf der Ultraschall-Maschine. Dies wird eine Lage zu versetzen, 1 min von r sparenaw Ultraschalldaten und die Bildvideoaufzeichnung (der zuvor auf dem Ultraschallbild angezeigt wird). </li><li> Stellen Sie das Ultraschallgerät auf &quot;B-Mode&quot;. Dadurch werden die verbleibenden Mikroblasen zu beseitigen. </li></ol> 7. Experimentelle SCI <ol><li> Verwendung des Mikromanipulators in die 3D-Rahmen verbunden ist, zu positionieren, das Gewicht Drop Schlagvorrichtung so, dass die Spitze des Prüfkörpers in Kontakt mit der Dura mater (auf der Mittellinie des Rückenmarks), an der Verbindung zwischen THX und ThXI (Figur 9) . ANMERKUNG: Diese Ebene sollte bis zur Mitte des Segments der Wirbelsäule mit dem Ultraschallgerät beobachteten entsprechen. Der Stürmer und der Körper des Schlagkörpers sind 8 mm Durchmesser. Die Spitze des Stoßkörpers, der die Verletzung generieren wird, ist 3 mm Durchmesser. </li><li> Legen Sie die Stürmer der Schlagvorrichtung auf einen 10 cm hohen Position. Induzieren die experimentellen SCI durch Lösen der Stürmer der Schlagvorrichtung. Der Stürmer fällt und gibt the Impaktor, Verletzungen des Rückenmarks. Das Maß impaction liefert ein schlag entspricht einem 10 g Gewicht fiel aus einer Höhe von 10 cm. </li></ol> 8. Beurteilung der SCBF 5 min Post-SCI <ol><li> Wiederholen Sie die in Abschnitt 6 (Bewertung der SCBF) beschriebenen Schritte. Die Mikrobläschen nicht in der Lage, durch die beschädigte Mikrogefäßsystems und der Schädigung Epizentrum passieren wird dunkel bleiben (Abbildung 10). </li></ol> 9. Tieropfer <ol><li> Euthanize das Tier mit intraperitonealen tödliche Injektion von Pentobarbital (100 mg). </li></ol> 10. Die Quantifizierung der SCBF von Offline-Analyse <ol><li> Starten Sie den Ultra Extend Software für die Quantifizierung (auf Ultraschallgerät) eingesetzt. Wählen Sie &quot;Datei&quot; und wählen Sie dann zuvor gespeicherte Rohdaten, und öffnen Sie die zugehörigen Dateien. Aktivieren Sie die &quot;Quantifizierung Modus&quot; durch Drücken (Auswahl) die Taste &quot;Chi Q&quot;. Select &quot;Set ROI&quot; (Taste) und wählen Sie die Kreisform. </li><li> Wählen Sie &quot;ROI zeichnen&quot; (Schaltfläche) und zeichnen sieben benachbarten kreisförmigen Regionen von Interesse (ROI) auf das Rückenmark (Abbildung 11). Öffnen Sie das Menü &quot;Fitting&quot; und wählen Sie die Funktion &quot;Kurvenwert&quot;. Beachten Sie die Software Darstellung mehrerer Kurven, die jeweils auf die Veränderungen der Mikrobläschen-Konzentration innerhalb einer ROI entspricht. HINWEIS: Jede Kurve einen &quot;Perfusions-deperfusion&quot; Profil hat. Die erste Phase der Kurve ist flach und entspricht dem Zeitraum vor der Ankunft der Mikrobläschen. In der zweiten Phase die Konzentration von Mikroblasen schneller ansteigt als Ergebnis der Infusion. In der dritten Phase, die, wenn die Infusion beendet ist beginnt die Konzentration von Mikrobläschen fortschreitend abnimmt, wenn sie in den Blutkreislauf disintegratse. </li><li> Legen Sie die erste vertikale Linie zu Beginn der zweiten Phase der cUrve und wählen Sie &quot;SET&quot;. Dies informiert die Software, wo die Analyse zu beginnen. </li><li> Legen Sie die zweite senkrechte Linie an das Ende der Aufnahme und nochmals wählen Sie &quot;SET&quot;. Dies informiert die Software, wo die Analyse zu stoppen. </li><li> Schauen Sie sich im Menü &quot;CV&quot; und notieren Sie die &quot;AUC&quot; Wert, der an die &quot;Fläche unter der Kurve&quot; analysiert entspricht. Dieser Wert ist proportional zur SCBF innerhalb der entsprechenden ROI. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial conflict of interest. The ultrasound machine was graciously lent by the Toshiba France company. The Vueject pump was graciously lent by the Bracco France company.

Zwar haben wir beschrieben, wie man CEU in einem Ratten-SCI Prellung Modell verwenden, kann dieses Protokoll geändert, um andere experimentelle Ziele oder SCI-Modellen passen. Wir haben uns entschieden, SCBF nur an zwei Zeitpunkten zu messen (vor Verletzungen und 15 Minuten nach der SCI), jedoch ist die Anzahl der Zeitpunkte und die Verzögerung zwischen SCBF Messungen angepasst werden, um die Bedürfnisse der anderen Studien erfüllen. Beispielsweise in unserer früheren Arbeit 17, haben wir SCBF an fünf a...

Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Zustand führt zu erheblichen Beeinträchtigungen in motorischen, sensorischen und autonomen Funktionen. Bisher wurde noch keine Therapie seiner Effizienz bei Patienten nachgewiesen. Für solche Grund ist es wichtig, neue Techniken, die die Bewertung der potenziellen Behandlungen zu verbessern und kann weiter aufzuklären Verletzungen pathiophysiology 1 zu identifizieren. SCI ist in zwei aufeinanderfolgenden Phasen unterteilt, die als primäre und sekundäre Verletzungen. Der primäre Verletzung entspricht der Ausgangs mechanische Beleidigung. Die sekundäre Verletzungen Gruppen eine Kaskade von verschiedenen biologischen Ereignisse (wie Entzündung, oxidativer Stress und Hypoxie), die auf die fortschreitende Expansion des ursprünglichen Läsion, Gewebeschäden und damit neurologisches Defizit 2,3 beizutragen. Bei der akuten Phase der SCI werden neuroprotektive Therapien zur Verringerung der Sekundärverletzung Pathologie und sh gerichtetOuld entsprechend verbessern neurologischen Folgen. Unter den vielen sekundären Verletzungen Ereignisse, spielt eine entscheidende Rolle Ischämie 4,5. Auf der Ebene des SCI Epizentrum, die beschädigten parenchymal Mikrogefäßen behindern effektive Rückenmark Blutfluss (SCBF). Außerdem SCBF wird ebenfalls deutlich in der Region rund um das Epizentrum Verletzungen, einen Bereich speziell als &quot;ischämischen Penumbra Zone&quot; bekannt reduziert. Wenn SCBF nicht schnell in diesen Regionen wieder hergestellt werden kann, um Ischämie Zusatz parenchymal Nekrose und weitere Nervenschäden Gewebes führen. Als auch nur die geringste Gewebekonservierung kann erhebliche Auswirkungen Funktion haben, ist es von großem Interesse, um Medikamente und Therapien, die Ischämie post-SCI zu reduzieren entwickeln. Um dieses Phänomen zu markieren, hat früheren Arbeiten, dass die Erhaltung der nur 10% der markhaltigen Axonen gezeigt war genug, um zu Fuß in Katzen erlauben post-SCI 6. Obwohl mehrere Techniken beschrieben worden, um SCBF, die beurteileny alle haben erhebliche Einschränkungen. Zum Beispiel kann die Verwendung von radioaktiven Mikrosphären 7,8 und C14- iodopyrine Autoradiographie 9 erfordert nachfolgende Tieropfer und kann nicht zu späteren Zeitpunkten wiederholt werden. Die Wasserstoff-Clearance-Technik 10 ist abhängig von der Einfügung intraspinal Elektroden, die weiter beschädigen können das Rückenmark. Während Laser-Doppler-Bildgebung, Photoplethysmographie 14,15 und in-vivo-Lichtmikroskopie 16 haben eine sehr begrenzte Tiefe / Bereich der Messung 11-13. Unser Team hat bereits gezeigt, dass kontrastverstärkten Ultraschall (CEU) Bildgebung verwendet werden, um in Echtzeit zu bewerten und in-vivo die SCBF Veränderungen in der Rattenrückenmark Parenchym 17. Es ist wichtig anzumerken, dass eine ähnliche Technik wurde von Huang et al aufgetragen. In einem Schweinemodell SCI 18. CEU legt eine spezifische Form der Ultraschall-Bildgebung, die in Graustufen morphologischen im verknüpfen erlaubtAlter (nach dem herkömmlichen B-Modus erhalten wird) mit der räumlichen Verteilung der Blutfluss 19. Die SCBF Bildgebung und Quantifizierung beruht auf intravaskuläre Injektion von Echokontrastmittel. Das Kontrastmittel besteht aus Schwefelhexafluorid Mikrobläschen gebildet (mittlerer Durchmesser von etwa 2,5 um und 90% mit einem Durchmesser von weniger als 6 &amp; mgr; m), die durch Phospholipide stabilisierte. Die Mikrobläschen reflektieren die Ultraschallstrahl durch die Sonde somit eine Verbesserung Blut Echogenität und Kontrasterhöhung der Gewebe entsprechend ihrer Blutfluss emittiert. Es ist daher möglich, den Blutfluss in einem bestimmten interessierenden Bereich entsprechend der Intensität des reflektierten Signals zu beurteilen. Die Mikrobläschen sind auch sicher und sie sind klinisch beim Menschen angewendet. Die Schwefelhexafluorid wird schnell abgeräumt (mittlere terminale Halbwertszeit beträgt 12 min) und mehr als 80% der verabreichten Schwefelhexafluorid wird in der ausgeatmeten Luft innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion gewonnen. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, um im CEU verwendenAging auf SCBF Änderungen Ratte zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">External Fixator Hoffman 3</td>
			<td style="width:229px;">Stryker, Kalamazoo, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Toshiba Applio</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound machine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Sonovue</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Contrast agent : microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Vueject pump</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Electric pump for infusion of microbubbles bolus</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Aquasonic Ultrasound Gel</td>
			<td style="width:229px;">Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Isovet</td>
			<td style="width:229px;">Piramal Healthcare, Mumbai, India</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Isoflurane used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Ultra Extend</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Software used for quantification of spinal cord blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6</td>
			<td style="width:229px;">Canadian Tire, Toronto, Canada</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Set of pliers for Do-it-yourself job</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast enhanced ultrasound imaging for assessment of spinal cord blood flow in experimental spinal cord injury

Reduziert Rückenmark Blutfluss (SCBF) (dh Ischämie) spielt eine Schlüsselrolle bei der traumatischen Rückenmarksverletzungen (SCI) Pathophysiologie und ist daher ein wichtiges Ziel für neuroprotektive Therapien. Obwohl mehrere Techniken beschrieben worden, um SCBF bewerten, sie haben alle signifikante Einschränkungen. Um letzteres zu überwinden, schlagen wir die Verwendung von Echtzeit-kontrastverstärkten Ultraschall-Bildgebung (CEU). Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Technik in einem Rattenmodell der Prellung SCI. A Jugularkatheter zunächst für die wiederholte Injektion von Kontrastmittel, einer Natriumchloridlösung von Schwefelhexafluorid eingekapselten Mikrobläschen implantiert. Der Dorn wird dann mit einem maßgeschneiderten 3D-Rahmen stabilisiert und das Rückenmark Dura mater durch eine Laminektomie bei THIX-ThXII belichtet. Die Ultraschallsonde wird dann an der Hinterseite der Dura mater (mit Ultraschall Gel beschichtet) positioniert ist. Zum Ausgangswert SCBF, eine einzelne intravenöse Injektion (400 ul) contra bewertenst Mittel angelegt wird, um seinen Durchgang durch die intakte Rückenmarks microvasculature aufzuzeichnen. Ein Gewichtsfangvorrichtung wird anschließend verwendet, um eine reproduzierbare experimentelle Quetschung Modell SCI generieren. Kontrastmittel wieder injiziert 15 Minuten nach der Verletzung, um post-SCI SCBF Veränderungen zu beurteilen. CEU ermöglicht die Echtzeit und in-vivo-Bewertung der SCBF Veränderungen nach SCI. In der unverletzten Tier zeigte Ultraschall-Bildgebung ungleichmäßige Blutfluss entlang der intakten Rückenmark. Außerdem, 15 min post-SCI, gab es kritische Ischämie auf der Ebene des Epizentrums während SCBF blieb in den abgelegeneren Gebieten intakt bewahrt. In den Bereichen neben dem Mittelpunkt (beide rostral und kaudalen) SCBF signifikant reduziert wurde. Dies entspricht dem vorher beschriebenen &quot;ischämischen Penumbra zone&quot;. Dieses Tool ist von großem Interesse für die Beurteilung der Auswirkungen von Therapien zur Begrenzung Ischämie und die resultierende Gewebsnekrose im Anschluss an SCI ausgerichtet.

Mit der vorstehend beschriebenen Protokoll ist es möglich, die SCBF entlang einer longitudinalen Rückenmarks sagittalen Segment zuzuordnen. Im intakten Rückenmark scheint es SCBF Unregelmäßigkeiten im Parenchym (Figur 12) sein. Dies kann durch die variable Verteilung der radiculo-medullären Arterien (RMA) von einem Tier zum anderen erläutert. RMA bezieht sich auf Arterien, die vorderen Rückenmarkarterie (ASA) zu erreichen und bieten somit die Blutversorgung des Rück...

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Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Kontrastverstärkten Ultraschall-Bildgebung zur Beurteilung der Spinal Cord Blood Flow in Experimental Rückenmark-Verletzung

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K Aufrufe.  Faculté de Médecine Paris Diderot Paris VII, U942. Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Serie: Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Akute und chronische taktile Sensorische Testung nach Verletzungen des Rückenmarks bei der Ratte

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Forschung

Medizin

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Eine Prellung Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Auswertung der Respiratory Muscle Activation Mit Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) bei Personen mit chronischen Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Ein Radio-Telemetrie-System zur Herz-Kreislauf-Funktion bei Ratten mit Rückenmarksdurchtrennung und embryonalen Neural Stem Cell Grafts überwachen

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Synergetische Nutzung von neuralen Vorläuferzellen und Self-Montage Peptide in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...