Die vorliegende Studie wurde unterstützt durch einen ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233460), dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr 256974 (EPC-TM-NET) und keine 602.783 (CAM-Pac ), der Subdirección General de Fomento y Evaluación de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02.643) und die Programa Nacional de internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo wurde von Roche Fellowship unterstützt. M. Cioffi wurde von der La Caixa Predoctoral Stipendienprogramm unterstützt.

Menschen PDAC Tumoren wurden mit schriftlicher Einwilligung (Comunidad de Madrid, Spanien (CP CNIO-CTC-11 erhalten. - CI 11/103-E) Implantation menschlicher Pankreastumoren in immundefizienten Mäusen bedarf der Zustimmung des Institutional Review Board sowie Institutional . Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Die Verfahren von Xenotransplantat Pankreastumor Mausmodelle müssen in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt werden (, Madrid in Spanien, hier Ethikkommission des Instituto de Salud Carlos III Protocol PA 34_2012). 1. Kultur Medien <ol><li> Bereiten Komplettmedium. <ol><li> Ergänzen RPMI-Medium mit 10% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin. Für 500 ml RPMI dazu 55 ml hitzeinaktiviertem FBS und 6 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml, 100 x). </li><li> Lagern Sie das Komplettmedium bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten CSCs Medium. <ol><li> Ergänzen Sie die Serum-freien DMEM / F12 medium mit 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin. </li><li> Bewahren Sie die CSC Medium bei 4 ° C. B27 (1:50) und 20 ng / ml bFGF wird frisch auf dem Medium vor jedem Versuch zugesetzt. HINWEIS: Die Zugabe von B27 wurde gezeigt, dass Tumorkugelbildung zu erhöhen und die mehreren Passagen der Kugel 32 Kulturen aufrechtzuerhalten. Die Zusammensetzung des Mediums ist ein entscheidender Schritt und muß für jeden Zelltyp in Kultur getestet werden. Wir empfehlen Tests Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazität von Kugeln und die Expression von CSC Marker mittels Durchflusszytometrie analysiert (dh CD133 + und CD44 +). </li></ol></li><li> Bereiten Extracellular Flux Assay-Medium. <ol><li> Diese spezielle Medium ist basal DMEM 5030 enthält Vitamine, Aminosäuren und andere Ergänzungen, aber ohne Glutamin, Glukose, Pyruvat und Hydrogencarbonat. </li><li> Für das laufende Test, ergänzen das Medium mit 2 mM Glutamin, 8 mM Glucose und 2 mM Natriumpyruvat zu einer vollständigen mitochondrialen Stoffwechselaktivität. HINWEIS: Die Abwesenheit von Natriumbicarbonat ist wichtig, um die genaue Messung der extrazellulären Ansäuerung der Zellen in Kultur zu wachsen, da reguläre Medium, enthaltend Bicarbonat wird pH-Schwankungen während der Assay-Puffer. Darüber hinaus ist die Verwendung eines Grundmedium ermöglicht eine genaue Kontrolle der Konzentration von L-Glutamin (L-alanyl-Glutamin) Glucose oder Natriumpyruvat für unterschiedliche Testbedingungen und / oder von Anwendungen notwendig. </li></ol></li></ol> 2. Sphere Forming Assay und Analyse HINWEIS: Alle Gewebekulturprotokolle und Manipulationen müssen mit sterilen Techniken mit großer Aufmerksamkeit die sauberen, Reinigungsmittelfreie, sterile Gläser durchgeführt werden. Vor der Verwendung vorge warmen alle mittleren und Lösung in einem 37 ° C Wasserbad (alternativ können Sie Medium und Lösungen auf RT vorgewärmt verwenden). Erhalten Menschliche PDAC Tumoren wie vorher beschrieben 21. <ol><li> Isolierung von CSCs von Menschen PDAC (Abbildung1) <ol><li> In einer sterilen biologischen Sicherheitswerk Übertragung der menschlichen PDAC Gewebes auf ein 60 x 15 mm-Kulturschale, die 1 ml steriles 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Hackfleisch, den Tumor in kleine Stücke (1-5 mm) mit einer sterilen Skalpell und Pinzette. </li><li> 1 ml sterile 1X PBS in die Kulturschale und wiederholen den Verreiben Schritt, bis das Gewebe vollständig dissoziiert, regelmäßig das erfordert 3-4 Runden. Übertragung der Gewebesuspension (oben bis zu einem Endvolumen von 5 ml mit 1X PBS) in ein steriles Röhrchen und mechanisch homogenisieren mit Dissociator wie gentleMACS. </li><li> Inkubieren des homogenisierten Gewebes mit Kollagenase (Verwendung 2,5 mg / ml Kollagenase in 1X PBS) für 60 min bei 37 ° C und anschließend für 5 min bei 900 x g zentrifugieren. Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml vollständigem Medium. Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um-Sieb und Zentrifuge für 5 Minuten bei 900 x g. </li><li> Dekantieren Sie den Überstand und resuspendierenPellet mit 5 ml roter Blutzellen Lysepuffer (Ammoniumchlorid-Kalium, ACK), und Inkubation der </li><li> Das Pellet in CSCs Medium Platte auf mit Gelatine beschichtete Schale, und bei 37 ° C für 1 Stunde. Dieser Schritt wird die meisten der Fibroblastenzellen, die sich schnell an der Platte zu befestigen entfernen. </li><li> Die Platte aus dem Inkubator und vorsichtig erholen Zellsuspension und Quantifizierung der Zahl der lebensfähigen (Trypanblau-negative) Zellen mit einer Zählkammer. Zu diesem Zweck mischt vorsichtig der Suspension und einer Pipette 20 ul der Suspension in ein Eppendorf-Röhrchen. In 20 ul (1: 1-Verhältnis) von Trypanblau auf die Zellen in der Mikrozentrifugenröhrchen und gut mischen. Pipette ca. 10 &amp; mgr; l der Mischung auf die Zählkammer. </li><li> Zählen Sie alle klar Zellen innerhalb der vier Quadranten der Ecke der Zählkammer für Lebendzellzahl. Hinweis: Die Überlebensfähigkeit und Ausbeute der Zellen können sich zwischen Tumorproben variieren. Für PDAC Proben Lebensfähigkeit reicht regelmäßig between 45-70% und Gewebestücke von makroskopischer Tumorprobe mit einem Durchmesser von 3-5 mm sollte auf etwa 5x10 6 lebensfähigen Zellen zu erhalten. </li></ol></li><li> Sphere Formation Assay und Metformin-Behandlung <ol><li> Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen und fügen Sie den entsprechenden Volumen von CSCs Medium, um eine Zellkonzentration von 2.000 Zellen / ml herzustellen. Die Zellsuspension nicht halten auf dem Eis nicht länger als 1 Stunde und gut gemischt vor dem Beschichten. </li><li> Fügen Sie 500 ul 1X PBS, um die erste und die letzte Zeile einer 24-Well-Platte für die Befeuchtung, um zu helfen mittlere Verdunstung zu minimieren. Saatgut der Zellen in Ultra-Low Befestigungs Zellen Platten mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Vertiefung in 1 ml Tumor Sphäre Medium (2.000 Zellen / ml). HINWEIS: Die Anzahl von Zellen für Tumorkugelbildung Assays verwendet werden, können zwischen Tumortypen variieren. </li><li> Behandlung von mindestens 4 Vertiefungen mit Vehikel (negative Kontrolle) und 4 Vertiefungen mit jeder zugewiesenen Behandlung, z. B. 3 mM von Metformin. PlAss der Zellen im Brutschrank auf 37 ° C eingestellt und versorgen die Zellen mit 5% CO 2 für eine Woche. ANMERKUNG: Das Medium sollte nicht um die ungestörte Bildung von Tumor Kugeln erlauben geändert werden, jedoch können mit Wachstumsfaktoren täglich nachgefüllt werden, wie sie in einem Kulturmedium nicht stabil sind. </li><li> Jeden zweiten Tag hinzuzufügen Behandlung, z. B. 3 mM von Metformin oder ein Fahrzeug zu jeder der Vertiefungen. Beurteilung der Zahl der gebildeten Kugeln Tumor nach 5 und / oder 7 Tage unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler, der zum Zählen der größeren Strukturen (Figur 2) ermöglicht. ANMERKUNG: Nur Tumor Kugeln mit mindestens 40 &amp; mgr; m in Betracht gezogen werden und können so klein kategorisieren (40-80 um) oder groß (80 bis 120 &amp; mgr; m) sind. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der Tumor Kugeln geteilt durch die Anfangszahl der Zellen beimpft (zB 2.000 Zellen) dargestellt werden. </li></ol></li><li> Serielle Passagierung von First Generation Tumor Spheres <ol&gt; <li> Nach 7 Tagen Inkubation Ernte der Tumor Kugeln wurde mit einem 40 &amp; mgr; m Zellsieb und zentrifugieren für 5 min bei 900 · g bei RT. </li><li> Distanzieren des Pellets von Tumorsphären auf einzelne Zellen unter Verwendung von Trypsin, und erweitern Sie dann die erhaltenen Einzelzellsuspension Zellen wieder für weitere 7 Tage, wie oben beschrieben (siehe 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Stoffwechselanalyse (ROS Produktion und Sauerstoffverbrauch) <ol><li> ROS-Produktion <ol><li> In diesem Protokoll haben wir Carboxy-DCFDA als Beispiel verwendet, um ROS-Produktion zu messen, da es sich um eine kostengünstige, schnelle und weit verbreitete Sonde für ROS-Erkennung. Es gibt jedoch mehrere andere Sonden und Methoden, die für diesen Assay verwendet werden kann. </li><li> Behandlung von Tumor-Kugeln mit Metformin als in 2.2 für die zugeteilte Menge an Zeit beschrieben. Am Ende der Behandlung, Ernte Tumor Kugeln wurde mit einem 40 &amp; mgr; m Zellsieb Zentrifugation der Zellen bei 900 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 1 ml trypsin. Inkubieren 20 min bei 37 ° C. </li><li> Sobald Zellen vereinzelt, Zentrifuge bei 900 xg und Resuspendieren der Zellen in HBSS, die 2,5 &amp; mgr; M Carboxy-DCFDA. Die Zellen für 20 min bei 37 ° C im Dunkeln. </li><li> Vor der Zytometrie Analyse fließen schützen gefärbten Zellen von Licht als Carboxy-DCFDA können Foto-oxidiert was falsch positive Ergebnisse sein. Zeigen Röhrchen auf Eis bis zur Analyse. HINWEIS: carboxy-DCFDA fluoreszierend ist nach Reaktion mit einer Vielzahl von reaktiven Sauerstoff und Stickstoffspezies, die in FL1 detektiert (Ex 488 nm, Em 520 nm..). </li></ol></li><li> Sauerstoffverbrauchsmessung <ol><li> Für dieses Protokoll, werden wir die extrazelluläre Flux Analyzer System vom Seahorse Biosciences verwendet, als Beispiel. Beschichtung der gewünschten Zellkultur-Platte mit einer Lösung von 22,4 &amp; mgr; g / ml von Zell- und Gewebekleber für 20 min bei RT. Mit Wasser spülen die Brunnen 2 - 3-mal vor der Aussaat der Zellen. </li><li> Am Ende der Behandlung mit der Ernte Tumorsphären einen 40 &amp; mgr; m Zellsieb Zentrifugation der Zellen bei 900 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 1 ml Trypsin. Inkubieren für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Platte vereinzelnden Zellen in der Zellkulturplatte in einer Dichte von 30.000 Zellen / Well für eine Platte mit 96 Vertiefungen (Endvolumen 150 ul). Resuspendieren der Zellen in Sauerstoffverbrauch Assaymedium, enthaltend 8 mM Glucose und 2 mM Natriumpyruvat enthielt. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen an den Boden des Bohrlochs durch Spin-Zentrifugation der Brunnen bis 100 · g erreicht ist und lassen Sie dann die Zentrifuge Stopp mit Bremse ab. Kehren Sie die Ausrichtung der Platte und wiederholen Sie den Vorgang. Übertragen der Platte an einem 37 ° C Inkubator ohne Zugabe von CO 2 für 30 min. </li><li> In der Zwischenzeit, bereiten die Patrone für den Assay. Jede Vertiefung hat 4 verschiedene Einspritzventile zu laden (25 ul / Hafen): <ol><li> Port A: Metformin. Um eine Endkonzentration von 3 mM in den Brunnen zu erhalten, bereiten Sie einen 8x-Lösung (24 mM) als letzte Band wird 175 seinul nach Injektion von Anschluss A </li><li> Port B: Metformin. Bis 3 mm hinzuzufügen und erhalten eine Endkonzentration von 6 mM in den Brunnen, bereiten eine 9x-Lösung (27 mM) als das Endvolumen 200 ul wird nach der Injektion von Port B sein </li><li> Port C: Metformin. Bis 3 mm hinzuzufügen und zu erhalten, eine endgültige Konzentration von 9 mm in den Brunnen, bereiten ein 10-fach-Lösung (30 mM) als letzte Band wird 225 &amp; mgr; l nach der Injektion von Port C. sein </li><li> Port D: Rotenon 11 uM bis 1 uM als Endkonzentration in der Vertiefung (11x) zu erhalten. Hinweis: Rotenon Rest mitochondriale Aktivität vollständig inhibiert. </li></ol></li><li> Kalibrieren Sie die Patrone und laden Sie die Zellkulturplatte. Führen Sie den Test mit dem Standardprotokoll von Misch- und Messung. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Inhibierung der Gesamt mitochondriale Atmung von Metformin als der Prozentsatz der Hemmung mit Rotenon (als 100%) erhalten erreicht. </li></ol></li></ol> 4.Xenograft Modell für menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebs bei immungeschwächten Mäusen HINWEIS: Bestellen Sie eine ausreichende Zahl von weiblichen athymischen Nackt oder andere, immungeschwächten Mausmodellen wie NOD-SCID, SCID-Beige oder NSG für die Versuche 33. Autoklaven alle chirurgischen Instrumente vor dem Experiment und es ihnen ermöglichen, auf RT vor dem Gebrauch abkühlen. Zur subkutanen Tumoren wir ein Minimum von 4 Mäusen pro Bedingung mit einem Tumor pro Flanke für insgesamt 8 Tumoren. <ol><li> Xenograft Transplantation <ol><li> Bereiten Tumorstücke aus menschlichen Pankreaskrebs Gewebeproben. Übertragen des Tumors in eine Petrischale und sezieren das Gewebe in kleine Stücke (2 mm im Durchmesser, ca. 8 mm 3) mit einem Skalpell und Pinzette, um das Gewebe zu halten. Tauchen Sie die erhaltenen Stücke in gallertartigen Proteingemisch-Lösung auf Eis gehalten. </li><li> Betäuben Mäusen mit 1-3% Isofluran oder andere inhalative oder injizierbaren Anästhetika. HINWEIS: Vor Beginn der chirurgischen procEDURE, sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig Bewusstsein durch die Stimulierung der Bauchhaut verloren geht oder schleppt mit einem Paar von Splitterzangen. Bewerben Augensalbe zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Sobald die Betäubung wirksam geworden ist, wischen Sie die Rückseite der Mäuse mit ethanolhaltigen Haut antiseptisch. Verwalten Buprenorphin (0,05 mg / kg KG) vor der Operation, um postoperative Analgesie zu gewährleisten. </li><li> Heben Sie die Rückseite der Haut mit einer Pinzette, einen 0,7 bis 1,0 cm langen Schnitt mit steriler Mikroscheren und dann unverblümt bereiten einen kleinen subkutanen Tasche, in der ein Stück des Patienten stammenden Bauchspeicheldrüsenkrebs Gewebe eingelegt (~ 8 mm 3). </li><li> Schließen Sie die Wunde mit 1-2 Hautklammern. Entfernen Sie sie nach 7 Tagen. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige und halten sie auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe, bis sie wieder voll aktiv. </li><li> Nach der Tumorimplantation, überwachen die Mäuse mindestens zweimal wöchentlich für das Tumorwachstum und die allgemeine Anzeichen entstehenden Morbidität wie gekräuselte Fell, hunched Haltung und Unbeweglichkeit. </li><li> Sobald Tumoren eine durchschnittliche Größe von 200 mm 3 erreicht hat, werden die Mäuse mit jeweiligen Behandlungen randomisiert. Verwalten Fahrzeug oder Metformin täglich via ip Injektionen (150 mg / kg KG) oder über das Trinkwasser (150 mg / kg KG) bei vergleichbaren Behandlungseffekte. </li><li> Überwachen Tumorlast mit einer Schieblehre und berechnen Tumorvolumen einmal pro Woche (Messung der Tumorvolumen = 1/2 Länge × Atem x Breite). </li><li> Opfern die Mäuse einmal Tumoren 1 cm Durchmesser erreicht oder Mäusen beginnen Anzeichen von Schmerzen oder Krankheit wie oben angegeben. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+and+cancer:+doses,+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena.">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li><li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer.">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li><li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability:+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt.">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li><li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44+CD24-/low+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2++human+breast+cancer+xenografts.">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells.">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2/neu-transformed+mammary+tumorspheres.">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li><li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors.">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells.">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li><li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rodent+neurogenic+regions:+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells,+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors.">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+'side+population'+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+autofluorescence:+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells.">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offen zu legen.

Mit dem Aufkommen und anschließende Validierung des CSC-Konzept für viele Tumoren hat sich auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung neue Impulse für die Entwicklung von effizienteren Krebstherapien und in der Folge die Reduzierung von Risiken für Rezidiv gewonnen, mit dem Potenzial. Allerdings ist der Bereich CSC noch in einem frühen Zustand und es muss mehr in Bezug auf das Verständnis CSC Ursprung und Ausbreitung, und ihre Rolle bei der Gestaltung der Tumorarchitektur und die Förderung der Metastasen erreicht werden. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von reproduzierbaren und sinn CSC Assays sowie die informierte Interpretation der erhaltenen Daten ist ein entscheidender Bestandteil für unser Verständnis von CSC Biologie. Von vielen biologischen Perspektiven hat Sphäre Bildung als äußerst wertvoll Test hervorgegangen; dennoch Benutzer sollten sich bewusst sein, seine Grenzen, um ihre experimentellen Ergebnisse richtig zu interpretieren. Ein wichtiger Aspekt, sogar vor der Bewertung der Kugel forma betrachtention Daten ist der Ursprung der untersuchten Probe, da die aus frischen Patienten stammende Proben erhaltenen Ergebnisse wesentlich verschieden von denen von etablierten Tumorzelllinien erhalten werden. Klassischen Kugelbildung Assays beinhalten Impfen Zellen bei klonaler Dichte in ultraniedriger Befestigungsplatten und Auswerten Kugelbildung in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und / oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF) angereichertes, aber serumfreien Medium 21, 34. Die Zusammensetzung des Kulturmediums ist ebenfalls ein wichtiges Thema, das zu berücksichtigen. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass das DMEM / F12 mit B27, bFGF und Glutamin in Abwesenheit von Serum ergänzt war ein optimales Medium in undifferenzierten Bedingungen wachsen, erweitern und Aufrechterhaltung der CSC. Wir haben festgestellt, dass in diesem Kulturbedingung (mittel und Suspension) exprimieren die Zellen hohe Mengen an Krebsstammzellmarker (einschließlich CD133 +, CD44 + und CD24 +) und nicht zum Ausdruck bringen Differenzierung assoziierten Proteinen (CK-20 Und CK-19). Eine der grundlegenden Annahmen für diese Tests ist, dass jede Kugel ist klonalen, dh führt eine Kugel aus der Erweiterung eines einzelnen Stammzelle. Allerdings sind Kugeln eigen dynamische Strukturen, die anfällig für selbst bei geringen Aussaatdichte 35 zu verschmelzen sind. Plating-Zellen ist ein wichtiger Schritt in der Protokoll und die Dichte einer Zelle / Vertiefung kann sicherlich die Aggregation Problem zu umgehen. Aber auch für prospektiv sortiert Vorläuferzellen, diese regelmäßig zu sehr niedrigen Bildungssphäre durch geringe Eigensphäre Bildungsaktivität und kann auch beschränkt auf autokrine Stimulation durch Verdünnungseffekte zurückzuführen. Nach unserer Erfahrung haben wir beobachtet, dass nur 30% der Zellen ausplattiert können Kugeln bilden. Wir empfehlen, mindestens 100 Zellen / Vertiefung, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Andere Kulturmethoden, um das Wachstum CSC auf festen oder halbfesten 3D-Kulturen (zB auf der Basis, basierend auf mAtrigel, Kollagen oder Methylcellulose). Diese Methoden wurden verwendet, um Zellmobilität und anschließende Zellaggregation 36 zu begrenzen. Jedoch trägt jeder dieser Matrizen ihre eigenen Grenzen. So ist zum Beispiel Matrigel ein lösliches Basalmembran aus Engelbreth-Holm-Swan (EHS) isoliert Tumor und obwohl der Extrakt ähnelt dem komplexen extrazellulären Tumorumgebung in vielen Geweben gefunden wird, enthält es mehrere mehr oder weniger definierten Wachstumsfaktoren, die oft macht mechanistische Studien für spezifische regulatorische Elemente sehr schwierig. Ein weiterer Punkt der Überlegung ist, dass Kugel bildenden Kapazitäten und Stammzellfunktionen sind nicht austauschbar 34 Begriffe. Während bestimmte Stamm- und Vorläuferzellen wurde gezeigt, dass Kügelchenbildungsfähigkeit 37, das Versagen der Kugeln in vitro zu erzeugen in vivo nicht Stammzellen / Vorläuferfunktion auszuschließen aufweisen. Beispielsweise ruhenden Stammzellen kann einfach nicht auf die extrazelluläre Signale durch das zur Verfügung gestellt zu reagierenIn-vitro-Kulturbedingungen ausgewählt. Somit langfristig in vitro als auch in vivo Selbsterneuerungskapazität gereinigte Zellpopulationen, bevorzugt während serielle Passagierung sollte, um zu beweisen oder zu widerlegen Stammzellenfunktion beurteilt werden. In diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit, unterschiedliche Populationen von Stammzellen und Vorläuferzellen prospektiv und gleichzeitig ausbreiten ein entscheidender Aspekt der Kügelchenbildungsassay und macht diesen Test für den Bereich CSC sehr wertvoll; solange seine Grenzen sind im Kopf für die Interpretation der gewonnenen Daten gehalten. Sphere bildenden Tests sind weit verbreitet, um rückwirkend identifizieren Stammzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung auf Einzelzellebene in vitro. Die Entdeckung von Markern, die die prospektiven Isolierung von Stammzellen und deren Nachkommenschaft, die aus ihrer in vivo Nische ermöglichen können die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Populationen zu definieren. Die combination der Sphäre Bildungstest und der FACS ist eine erfolgreiche Strategie, um Zellen aus festem Gewebe zu isolieren oder anzureichern spezifische Subpopulationen von PDAC in Kultur. Zum Beispiel die gleichzeitige Expression von EpCAM, CD24 und CD44 definiert eine Subpopulation von CSCs in der Lage sein: Selbsterneuerung, zu differenzieren und zu initiieren einen Tumor, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors. Hermann et al. zeigte, dass CD133 + Zellen besaß Augmented proliferative Kapazität und CSC verfügt über 15. Andere Marker zur Charakterisierung des CSCS verwendet: ALDH- 1 (Aldehyd-Dehydrogenase-1) Expression mit hoch tumorigenen Zellen im Pankreaskarzinom 38 zugeordnet ist; Zellen in der Lage, die DNA-Farbstoff Hoechst 33342 ausschließen, benannt Seitenpopulation (SP) Zellen, haben die Fähigkeit, Tumoren geprüftes 39 zu initiieren. Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine subzelluläre Autofluoreszenz Fach kennzeichnet einen deutlichen Population von menschlichen Zellen mit exklusiven CSC Züge in verschiedenen Tumorarten40. Obwohl keines dieser Marker scheint selektiv charakterisieren eine reine Population KSZ, mehr und mehr komplexe Kombinationen von Markierungen müssen mit FACS verwendet werden, zu reinigen verfeinerten Zellpopulationen. Viele Fragen bleiben über die genaue Rolle von CSCs in der Herkunft, der Progression und Arzneimittelresistenz von Tumoren. Zum Beispiel besteht ein Weg, um die Frage der klonalen Evolution Adresse zu definieren, ob und wie eine einzelne CSC initiiert einen Tumor, könnte es sein, die Patientenproben bei verschiedenen Stadien der Erkrankung zu analysieren, und zwar folgendermaßen die Zahlen des CSCS während und nach der Behandlung. Durch die Beantwortung dieser Fragen, können wir sinnvolle Fortschritt unserer Kenntnis von CSCs in soliden Tumoren zu machen und zu entwickeln, Drogen-Therapien, um letztlich zu verhindern Tumorprogression und Rückfall.

Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist eine der aggressivsten soliden Tumoren. Es ist derzeit die 4. häufigste Krebs-Todesfälle in der westlichen Gesellschaft und wird voraussichtlich auf der 2. häufigste Ursache innerhalb des nächsten Jahrzehnts steigen (~ 400.000 Todesfällen pro Jahr weltweit) 3 .Am Zeitpunkt der Diagnose 90% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, die eine 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5% aufweist. Diese Überlebensrate enttäuschend trotz immer intensivere Forschungsaktivitäten 4 unverändert in den letzten 50 Jahren. Von den verbleibenden 10% der Patienten, die potenziell &quot;heilbar&quot; Krankheit durch chirurgische Resektion haben, werden 80% von Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu sterben. Seit vielen Jahren die Standardtherapie bei fortgeschrittener Erkrankung ist Gemcitabin-Monotherapie, aber dies nur verleiht eine marginale Überlebensvorteil 5. Kleine Verbesserungen in kurzfristige Überleben wurden durch die Zugabe erreicht wurdevon Erlotinib 6 oder 7 Capecitabin jedoch die Überlebensvorteil in der Größenordnung von Wochen mit der mediane Gesamtüberleben noch ~ 6 Monate. In jüngster Zeit haben mehrere ermutigende Ergebnisse für Gemcitabin / nab -paclitaxel 8 und die FOLFIRINOX Kombination Regime 9,10 entstanden. Diese Therapien verbessert mediane Überlebenszeit von bescheidenen 2 und 4 Monate sind, aber sind sehr giftig und Langzeitüberlebenden immer noch eine seltene Ausnahme. Obwohl die Behandlung bietet das Potenzial für Verbesserungen, diese sind giftig Regime, auf die viele Patienten nicht reagieren oder nur zeigen, schrittweise Verbesserung des Gesamtüberlebens. In der Folge gibt es eine dringende Notwendigkeit, die derzeitigen Therapien ergänzen und sich auf neue, wahrscheinlich multimodale Therapieansätze zu entwickeln. Tumor Heterogenität Es wird immer deutlicher, dass Krebs Heterogenität ist nicht nur auf unterschiedliche evolutionäre Subklone withi beschränktn jeden Tumor 11, sondern auch durch phänotypische und funktionelle Heterogenität und Plastizität in jedem Subklon 12 angetrieben. So genannte Krebsstammzellen (CSCs) oder tumorfördernde Zellen sind für intraklonale Heterogenität 13-16 verantwortlich. Insbesondere CSCs stellen eine Untergruppe der Krebszelle, für die wir und andere haben schlüssige Nachweise erbracht hat, bis in die einzelne Zelle, die sie vertreten die Wurzel der Krankheit durch, die zu allen differenzierten Nachkommen in jedem Subklon 17 Krebs. Noch wichtiger ist, sind diese Zellen die für metastatische Verhalten und auch eine wichtige Quelle für Rezidiv nach der Behandlung, auch bei relativ wirksame Medikamente zur Induktion anfänglichen Tumorrückbildung (zB nab -paclitaxel) 15,18-20. Es ist wichtig zu beachten, dass KSZ stellen nicht notwendigerweise bona fide Stammzellen, noch haben sie aus Gewebestammzellen entstehen in vielen Fällen, sondern sie haben acquired bestimmte Merkmale von Stammzellen. Die meisten davon sind funktional definiert, beispielsweise CSCs sind mit unbegrenzter Selbsterneuerungskapazität macht sie resistent gegen herkömmliche Chemotherapie ausgestattet und zeigen eine erhöhte Invasivität, die metastatische Aktivität fördert. Funktionelle Krebsstammzellen Phänotypen Die funktionelle Phänotyp KSZ beruht auf ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung, die in vitro unter Verwendung serieller Formation Kugel und Koloniebildungstests jeweils getestet werden kann, nach. Noch wichtiger ist, CSCs in der Lage sich selbst zu erneuern Bär in vivo Tumorbildung, die durch Grenzverdünnung in vivo-Tests als die ultimative Funktionsanzeige, vorzugsweise während serielle Transplantation Hinweis auf ausschließliche langfristige Tumorbildung getestet werden können. Darüber hinaus gibt es die Heterogenität innerhalb des CSC Raum, mit einem deutlichen Subpopulation von CSCs mit dem exklusiven Fähigkeit, Anlass zu Metastasen zu geben, die nicht nur einedirekte Konsequenz aus der exklusiven in vivo Tumorbildung. Tatsächlich metastastitic CSCs erwerben die Fähigkeit, den Primärtumor zu umgehen, zu überleben und schließlich anoikis translozieren und Samen sekundären Standorten. Diese erweiterten funktionalen Fähigkeiten können in vitro unter Verwendung von modifizierten Invasion Assays und in vivo mit Metastasen Assays getestet werden. Targeting Cancer Stem Cells Wir und andere haben überzeugende Beweise, dass Behandlungen, die sich auf die Großtumor differenzierter PDAC-Zellen, auch in Kombination mit Stroma-Targeting-Mittel zur Verfügung gestellt, die nicht über einen großen Einfluss auf die Tumorprogression und anschließende Ergebnis, es sei denn mit einem CSC-Targeting Strategie 21 kombiniert, 22. Somit, bezogen auf die wesentlichen Funktionen des CSCS in den Krankheitsverlauf und Therapieresistenz Diese Zellen sollten ein wesentlicher Bestandteil für jede neue Behandlungsansatz 18,20 bedeuten, aber ein viel besseres Verständnis o erfordernf Regulierungsapparat CSCs. Obwohl CSCs und deren differenzierter Nachkommen tragen identische genetische Grundzustände in Bezug auf genetische Veränderungen, CSCs zeigen deutliche und damit epigenetisch bestimmten Genexpressionsprofilen, die Aktie Module mit pluripotenten Stammzellen. Die meisten der in Erzeugungs induzierte pluripotente Stammzellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) beteiligten Gene nicht nur im Zusammenhang mit Krebs, aber ihr Ausdruck ist vor allem auf die CSCs Raum beschränkt. Darüber hinaus haben die funktionelle Relevanz von CSCs loss-of-function-Experimente unter Verwendung genetischer Werkzeuge für die Ausrichtung CSCs jetzt fest etabliert die CSC-Konzept für mehrere Krebsarten 23-25. Während die meisten dieser Ansätze beruhen auf Mausmodelle basieren und sind daher nicht leicht übertragbar in der Klinik bieten sie proof-of-concept für die potentielle klinische Bedeutung Targeting KSZ in Kombination mit Massentumorzellen. Studieren Cancer Stem Cells In Vitro ihre Achillesferse Identifizieren Um neue und klinisch anwendbare Möglichkeiten für die Ausrichtung CSCs zu identifizieren, werden ihre Funktionen regelmäßig in vitro untersucht und Kugelbildung ist weit verbreitet in diesem Zusammenhang verwendet. Ursprünglich für das Studium normalen Stammzellbiologie, einschließlich Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazität entwickelt, wurde dieser Test später angepasst CSCs in vitro zu studieren und hat für die Untersuchung von CSCs von PDAC 20 getrennt verwendet. Wir haben festgestellt, dass Tumor-Kugeln aus primären humanen PDAC Zellen gebildet tragen alle unterschiedliche Merkmale von CSCs daher anzeigt, dass sie nach Treu und Glauben Bauchspeicheldrüsen CSCs 21 enthalten. Somit wird der Tumor Sphäre Assay stellt ein leistungsfähiges Tool, um Bildschirm für effektivere Therapien in vitro, aber die Ergebnisse müssen weiter in strenger in vivo-Tests bewertet werden. Tatsächlich sollte Daten mit diesem in-vitro-Test erzeugt mit großer Vorsicht behandelt werden, wie the-Test kann mit erheblichen Irrtum. Hoch standardisierte Protokolle, darunter automatisierte Zählung der gebildeten Kugeln, eingerichtet werden, um reproduzierbare und Vorhersagedaten zu gewährleisten. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich dieses Assays Bauchspeicheldrüsenkrebsstammzellen aus einem unterschiedlichen Satz von primären humanen PDACs abgeleitet screenen und zeigte, dass diese Zellen höchst anfällig für metabolische Umprogrammieren antidiabetische Verbindung Metformin. Zuvor war nachgewiesen worden Metformin zur Krebszellexpansion durch indirekten Aktivierung von AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) Signal- und anschließender Inhibierung von mTOR 26, was zu einer reduzierten Proteinsynthese und die Zellproliferation hemmen 27. Zusätzlich zu diesen Wirkungen auf die Schütttumorpopulation haben wir und andere herausgefunden, dass Metformin imstande zum Ziel und tatsächlich keine CSCS Subpopulation in einer Reihe von festen Tumoren, wie Brustkrebs, Speiseröhrenkrebs, Glioblastom und Bauchspeicheldrüsenkrebs 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Somit stellt Metformin eine vielversprechende und sichere neue therapeutische Strategie für verschiedene Krebsarten mit derzeit nicht gedeckten medizinischen Bedarf. Darüber hinaus mit Kugelbildung als eine Möglichkeit, für CSCs zu bereichern, haben wir gezeigt, dass die primäre Wirkung von Metformin über Bauchspeicheldrüsen CSCs war der AMPK-Aktivierung unabhängig und vor allem auf seine bescheidene mitochondriale Toxizität verlassen (über eine Hemmung der Komplex I), die offenbar war tödlich für die Teilmenge von CSCs nur. Für letztere konnten wir ihre zellulären Sauerstoffverbrauch und mitochondriale ROS-Produktion als Indikatoren für Toxizität des Medikaments auf zellulärer Ebene zu bewerten. Anschließend könnten diese in vitro-Daten in präklinischen Mausmodellen validiert werden, und in der Tat zu einer signifikant verlängerten Überlebenszeit 31. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle Erzeugung von Medikamentenempfindlichkeitsprofile für CSCs, einschließlich Studien über ihre Auswirkungen auf die CSC-Stoffwechsel. Wir haben jetzt erweitert experimentelle Einzelheiten über die verwendeten com liefernergänzende in vitro und in vivo-Verfahren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Counting Chamber/Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td>
			<td>Roche Innovatis</td>
			<td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Ultra-low Attachment Plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml sterile tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton Syringe Co</td>
			<td>81075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metformin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D150959-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200 mM, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Sodium Pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Assay medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100965-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution, 0.05%&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50x&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium/F12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2&#39;,7&#39;-DichlorofluoresceinDiacetate)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (vol/vol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>IsoVet, Braun</td>
			<td>571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sterile Cotton tipped applicator</td>
			<td>&#160;Puritan medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with CO2 input&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps</td>
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studying pancreatic cancer stem cell characteristics for developing new treatment strategies

Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) enthält eine Teilmenge ausschließlich tumorigenen Krebsstammzellen (CSCs), die gezeigt haben, um Tumor-Initiation, Metastasierung und Beständigkeit gegenüber Radio- und Chemotherapie zu fahren. Hier beschreiben wir eine spezifische Methode zur Kultivierung von primären humanen Pankreas-CSCs als Tumorsphären in verankerungsunabhängigen Bedingungen. Die Zellen werden in serumfreiem, nicht haftenden Bedingungen, um für CSCs zu bereichern, während ihre differenzierter Nachkommen nicht überleben und vermehren sich in der Anfangsphase nach der Aussaat von Einzelzellen gezüchtet. Dieser Assay kann verwendet werden, um den Prozentsatz der in einer Population von Tumorzellen vorhanden KSZ abzuschätzen. Sowohl Größe (die von 35 bis 250 Mikrometer liegen kann) und die Anzahl der Tumor Kugeln gebildet stellt CSC-Aktivität entweder in bulk Populationen von kultivierten Krebszellen oder frisch geerntet und aufgeschlossen Tumoren 1,2 barg. Unter Verwendung dieses Tests haben wir vor kurzem festgestellt, dass Metformin selektiv abträgt pancreatic CSCs; ein Befund, der anschließend weiter durch den Nachweis verminderte Expression von Pluripotenz-assoziierten Gene / Oberflächenmarker untermauert und in vivo Tumorbildung von Metformin behandelten Zellen reduziert wurde. Als letzter Schritt für die präklinische Entwicklung, die wir behandelten Mäusen mit etablierten Tumoren mit Metformin und Ergebnis signifikant verlängert das Überleben. Klinische Studien testet den Einsatz von Metformin bei Patienten mit PDAC sind derzeit im Gange (zB NCT01210911, NCT01167738 und NCT01488552). Mechanistisch, fanden wir, dass Metformin führt zu einem tödlichen Energiekrise in CSCs durch Verbesserung reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion und die Verringerung der mitochondrialen Transmembranpotentials. Im Gegensatz dazu wurden nicht-CSCs nicht durch Metformin Behandlung beseitigt, sondern unterzog reversible Zellzyklusarrest. Daher dient unserer Studie als gelungenes Beispiel für das Potenzial der in vitro Kugel Bildung als Screening-Instrument, um Verbindungen, die möglicherweise gezielt CSC identifizierens, aber diese Technik weitere in vitro- und in vivo-Validierung erforderlich, falsche Entdeckung zu vermeiden.

Metformin selektiv auf Bauchspeicheldrüsen CSCs Wir untersuchten zuerst die funktionalen Wirkungen von Metformin auf die in vitro Selbsterneuerungskapazität des CSCS. Zu diesem Zweck führten wir Kugel Bildungstests unter Verwendung von primären humanen Pankreaskrebszellen aus PDAC Gewebe während der Operation reseziert isoliert. Wir beobachteten, dass Metformin stark vermindert die Größe der gebildeten Kugeln (1A). Dies war durch die Hemmung der Ausdehnung der Nachkommen des CSC, die noch stellen den Großteil der Zellen in Bereichen gefunden, wie sie nur für KSZ angereichert am wahrscheinlichsten. Tatsächlich sind die mehr Kugeln ohne Passagieren des umfassen den Ausbau der differenzierteren Nachkommen werden kultiviert. So fanden wir, Metformin, um die Anzahl von Kugeln tatsächlich unabhängig von ihrer Größe ausgebildet signifikant zu verringern, in einer Dosis-abhängigen Weise hindeutet starke Hemmung der Selbsterneuerungskapazität C auftretendenVZ (Daten nicht gezeigt). Wir fanden, dass Metformin bei 3 mm die Anzahl der Kugeln gebildet (Abbildung 1B) deutlich gesunken. Um die langfristigen Wirkungen von Metformin auf die Selbsterneuerungskapazität von CSCs strenger zu studieren, später agiert wir die gebildeten primären Sphären in sekundären und tertiären Bereich. Obwohl nur primäre Kugeln wurden mit Metformin behandelt wurde die Bildung der Kugeln in den zweiten und dritten Durchgänge drastisch und zunehmend reduziert, Metformin verwickelt war die Mehrheit der KSZ (1C) tatsächlich irreversibel eliminiert. So zeigten unsere Daten signifikante Behandlungseffekte für Metformin über die Selbsterneuerungskapazität von primären Pankreas CSCs und so hat uns ermutigt, weitere mechanistische als auch in vivo-Studien durchzuführen. Metformin Hemmt Mitochondriale Sauerstoffverbrauch und induziert ROS Produktion Seit metformin Es wurde gezeigt, wie ein Mitochondriengift durch teilweise Hemmung der Komplex I-Aktivität handeln, neben untersuchten wir die akuten Wirkungen von Metformin auf die zelluläre Sauerstoffverbrauch in der Sphäre stammenden Zellen. Zu diesem Zweck wählten wir Zellen von zwei repräsentativen primären PDAC Tumoren abgeleitet und maß den Sauerstoffverbrauch über der Zeit folgende sequentielle Injektion von 3 mM Metformin (drei Injektionen) und 1 uM Rotenon (eine Injektion). Wie in 2A gezeigt, Metformin Injektion induziert eine schnelle und dosisabhängige Abnahme des Sauerstoffverbrauchs, was erhebliche zwischen den verschiedenen Tumoren variiert. Berechneten wir die Rest mitochondriale Aktivität auf Metformin Behandlung durch Injektion von Rotenon, einem potenten komplexen I-Inhibitor, der in der Lage ist vollständig Hemmung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch ist. Empfindlichkeit gegenüber Metformin in Bezug auf die mitochondriale Sauerstoffverbrauch mit seiner Kapazität korreliert, um ROS-Produktion definiert als eine Verschiebung des Mittelwerts der popu induzierennung nach der Metformin-Behandlung (2B, links), die leicht quantifiziert werden kann (2B, rechts). Wie erwartet, zeigten die primären Zellen, die am empfindlichsten auf die Hemmung der Sauerstoffaufnahme wurden auch die stärkste Zunahme der ROS-Produktion von Metformin Behandlung. Somit sind diese metabolischen in vitro Versuche zeigen, dass Metformin zielt KSZ durch Hemmung ihrer Abhängigkeit von der mitochondrialen Funktion, was zu einer späteren Erhöhung mitochondrialen ROS und eventuell die Induktion von Apoptose. Metformin Stalls PDAC Progression In Vivo Wir untersuchten schließlich die Auswirkungen von Metformin in vivo unter Verwendung von Gewebe Xenotransplantate von verschiedenen Patienten mit PDAC abgeleitet. Wir beobachteten eine signifikante Verringerung bei der Tumorprogression zu Metformin behandelten Mäuse im Vergleich zu der Kontrollgruppe, aber die Tumoren reagieren nie vollständig disappeared (Abbildung 3). Anschließend während Langzeit-Follow-up aller Tumoren schließlich rückfällig darauf hindeutet, Metformin Widerstand der Zellen das Überleben der Frühphase der Behandlung. Dennoch Metformin-Behandlung, auch wenn als Monotherapie angewendet wird, signifikant in allen Mäusen verlängert das Überleben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Abbildung 1. Metformin selektiv auf die CSCs. (A) Metformin verringert die Größe der Kugeln. Repräsentative Bilder von Kugeln nach der Behandlung mit den angegebenen Dosen von Metformin für 7 Tage (rechts) erhalten. Die Quantifizierung der Kugelgröße (n≥6) (links), die angegebenen Zahlen in Abszisse stellen einzelne Tumor. (B) Sphere Bildungsvermögen in Gegenwart oder Abwesenheit von Metformin für 7 Tage (n≥6), wobei die angegebenen Nummern in AbszissenAchse stellen einzelne Tumor. (C) Vertreter Graph von CSC Selbsterneuerungskapazität in sekundären und tertiären Bereichen des primären Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellen. Die Kugeln wurden nur während der ersten Generation Kugelbildung für insgesamt 7 Tage behandelt (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Abbildung 2. Metformin-Behandlung hemmt Sauerstoffverbrauch und induziert ROS-Produktion. (A) Metformin zusätzlich hemmt den Sauerstoffverbrauch (OCR) des Kugel-abgeleiteten Zellen. Zwei verschiedene PDAC Sekundärkugeln wurden mit Metformin behandelt und OCR Veränderungen wurden durch extrazelluläre Flussanalyse gemessen. Rotenon Injektion wurde als Kontrolle für die Gesamt-mitochondrialen OCR Verzehr verwendet.X-Achse stellt die Sauerstoffverbrauchsrate in pmol von Sauerstoff / h durch den Proteingehalt in jeder Vertiefung normalisiert. (B) PDAC Kugeln in A verwendet wurden für 8 h mit Metformin und ROS-Produktion wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung carboxy-DCFDA beurteilt. Links, Vertreter Durchflusszytometrie Parzellen. Right, Zusammenfassung der Daten aus drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Abbildung 3. Metformin Stalls PDAC Progression in vivo. Zwei verschiedene PDAC Xenotransplantat-Gewebe wurden in immungeschwächten Mäusen implantiert und Behandlung zugeteilt nach anfänglichen Tumor take verifiziert wurde. Mäuse wurden mit Metformin (Met) zu der behandelten Trinkwasser (150 mg / kg Körper weight; basierend auf 5 ml Wasserverbrauch pro Tag). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K Aufrufe.  Spanish National Cancer Research Center. Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Serie: Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...