Dieses Protokoll ermöglicht die robuste Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen mit funktionellen Assays und phäotypischer Charakterisierung. Die Isolierung von Krebsstammzellen aus einer Tumorprobe könnte eine Plattform sein, um die klinische Anwendung spezifischer Therapien auf einzelne Tumoren zu lenken, Resistenzen und daraus resultierendes Wiederauftreten vorherzusagen. Um nicht haftende Suspensionskulturen vorzubereiten, beschichten Sie zunächst die Zellkulturbehälter mit 50 Mikrolitern pro Zentimeter quadratisch von 15 Milligramm pro Milliliter PolyHEMA, und legen Sie die Behälter mindestens zwei Tage lang in einen 37 Grad Celsius Trockenschrank.
Wenn die Behälter vollständig trocken sind, waschen Sie in 80 bis 90 Prozent konfluente Krebszelllinienkultur mit PBS und lösen Sie die Zellen mit ein bis zwei Milliliter Nader EDTA. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit zwei bis vier Millilitern Frischzellenkulturmedium aufhalten und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation waschen. Das Pellet in einem frischen Kulturmedium zum Zählen wieder aufsetzen und die Zellen in einem frischen Kugelkultivierungsmedium verdünnen, das zwei Prozent Methylcellulose bei einer Konzentration von 500 bis 2000 Zellen pro Zentimeter quadratisch pro Kulturschalenkonzentration enthält.
Um die Kugelmonokonalität zu gewährleisten, säen Sie jede Zelllinie mit geringer Dichte in einer ankerfreien Umgebung. Dann säen Sie die Zellen auf die polyHEMA beschichteten Platten für eine fünftägige Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid, hinzufügen zehn Nanogramm pro Milliliter epidermalen Wachstumsfaktor und zehn Nanogramm pro Milliliter des grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktors zum Zellkulturmedium alle zwei Tage. Drei bis zwölf Tage nach der Beschichtung sollten dreidimensionale kugelförmige Zellkolonien durch Lichtmikroskopie beobachtet werden.
Um abgeleitete Anhängerpopulationen zu erhalten, übertragen Sie die Kugeln auf ein neues Kulturgericht unter den entsprechenden Kulturbedingungen für die ursprüngliche Krebszelllinie. Nach ein bis zwei Tagen Kultur sollte eine Zellmonoschicht beobachtet werden, die um die anhängerhaften Sphären wächst, mit einer Morphologie, die der der Zelllinie des Ursprungs ähnelt. Um die kugelbildende Kapazität der krebszellförmigen Interessenslinie nach Abschluss des kugelbildenden Protokolls zu bestimmen, sammeln Sie die Kugeln durch Zentrifugation.
Setzen Sie das Kugelpellet vorsichtig in frischem Medium wieder auf, und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern zu zählen. Berechnen Sie dann das Prozentuale Verhältnis der erhaltenen Kugel im Vergleich zur Anzahl der anfangs plattierten Zellen. Um die Selbsterneuerungsfähigkeit der Zelllinie von Interesse zu bestimmen, sammeln Sie die Kugeln durch Zentrifugation und setzen Sie das Kugelpellet in Trypsin EDTA für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius sanft wieder auf.
Am Ende der Inkubation fügen Sie enzym- und Aktivierungsmedium in das Rohr ein und pipettedien die Lösung, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Mit Hilfe eines Hämozytometers und der Trypan-Blau-Ausschlussmethode zählen Sie die lebensfähigen Zellen in der Suspension und verschichten die Zellen in polyHEMA-beschichteten Platten für einen kugelbildenden Assay, wie soeben gezeigt. Verwenden Sie nach acht Tagen ein Hämozytometer, um die Anzahl der Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern zu zählen, und berechnen Sie das prozentuale Verhältnis der erhaltenen Kugeln im Vergleich zur Anzahl der ursprünglich plattierten Zellen.
Um den von den Kugeln belegten Bereich auszuwerten, legen Sie die Kulturschale auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einem Bildaufnahmemodul ausgestattet ist, und wählen Sie eine 100X bis 400X Vergrößerung aus. Erhalten Sie Bilder von mindestens zehn zufälligen Feldern pro Bedingung, und verwenden Sie ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm, um Interessenbereiche um die Sphären zu zeichnen. Messen Sie dann die Fläche jedes Interessenbereichs in Pixeln und berechnen Sie die Kugelprojektionsfläche als die mittlere Fläche der gemessenen Pixel.
Die funktionelle Charakterisierung der kugelbildenden Kapazität, Selbsterneuerung und Projektionsfläche der Krebsstammzellen ermöglicht einen Vergleich ihrer entfernten Abstammung und ihres Ursprungsgewebes. Das kugelbildende Protokoll ermöglicht es, kugelförmige Kolonien in Suspension aus mehreren Endometrium- und Brustkrebszelllinien oder nach sanfter enzymatischer Verdauung von Geweben aus menschlichen Tumorproben zu erhalten. Sowohl Endometrium- als auch Brustkrebssphären führen ein bis zwei Tage nach der Beschichtung zu einer Zellmonoschicht mit ähnlichen Morphologien wie ihre Zellherkunftslinie.
In diesen repräsentativen Experimenten zeigte der hormonelle Rezeptor-positive Brustkrebs MCF-7-Zellen eine höhere kugelbildende Fähigkeit, Selbsterneuerungsfähigkeit und Projektionsfläche als die dreifach-negativen HCC1806 Brustkrebszellen. Neben der Krebsstammzellanreicherung über das kugelbildende Protokoll empfehlen wir die weitere Beurteilung ihrer Stammfähigkeit mit komplementären Methoden wie der Durchflusszytometrie. In dieser repräsentativen Analyse von Sphären, die aus Endometriumzelllinien gewonnen wurden, wurden vier Populationen von Zellen identifiziert, die Krebsstammzellmarker exdrücken, die in jeder Zelllinie durch Durchflusszytometrie identifiziert wurden.
Die Bewertung der Tumorsphären durch andere molekularbiologische Techniken kann die Konfirmandalität und Plastizität von Krebsstammzellen bestätigen und die Entwicklung gezielter Therapien erleichtern. Die Western-Blot-Analyse nach sanfter Kugelernte ergab auch einen Krebsstammzell-Phänotyp für die in vitro erzeugten Sphären. Dieses Isolationsprotokoll trägt zu unserem Verständnis der Bedeutung von Krebsstammzellen bei, was sich klinisch auf das Verständnis von Rückfällen, Metastasen und Behandlungsresistenzen niederschlägt.
