本研究はでサポートされていたERC高度な研究者グラント（PA-CSC 233460）、グラント契約なし256974（EPC-TM-NET）となし602783（CAM-PACの下に欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7 / 2007から2013） ）、Subdirección一般デEvaluaciónY Fomento·デ·ラ·Investigación、フォンド·デ·InvestigaciónSANITARIA（PS09 / 02129＆PI12 / 02643）、およびPROGRAMAナシオナルデInternacionalización·デ·ラ·I + D、Subprogramma：FCCI 2009（PLE2009-0105; MINISTERIOデEconomíaY Competitividad、スペイン）。 E. Lonardoはロシュフェローシップによってサポートされていました。 M. Cioffiは、ラ·カイシャ博士号を取得する前のフェローシップ·プログラムによってサポートされていました。

ヒトPDAC腫瘍は書面によるインフォームドコンセント（コムニダードマドリード、スペイン（CP CNIO-CTC-11で得られた - 。CI 103分の11-E）免疫不全マウスへのヒト膵臓腫瘍の移植は、施設内倫理委員会の承認を必要とするだけでなく、制度動物実験委員会（IACUC）異種移植膵腫瘍マウスモデルの手順は、制度や国の規制（インスティテュート·デ·サルド山カルロス3世のここに倫理委員会、マドリード、スペイン、プロトコルPA 34_2012）に従って実施されなければなりません。 1.文化メディア<ol><li>完全培地を準備します。 <ol><li> 10％FBS、100単位/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI培地を補充します。 RPMI 500mlのための熱不活性化FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンの6ミリリットル（10,000 U / mlで、100X）の55ミリリットルを追加します。 </li><li> 4℃での完全培地を格納します。 </li></ol></li><li> CSCはミディアムを準備します。 <ol><li>無血清DMEM / F12のmediuを補います100単位/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMのグルタミンとM。 </li><li> 4℃でCSC媒体に保管してください。 B27（1：50）および20 ng / mlのbFGFを新たに各実験の前に培地に添加されます。 注：B27の添加は、腫瘍球形成を増加させ、球培養物32のいくつかの通路を維持することが示されています。培地組成は重要なステップであり、培養物中の各細胞型について試験されなければなりません。我々は、球体の自己再生および分化能力をテストし、フローサイトメトリー（ すなわち、CD133 +及びCD44 +）でCSCマーカーの発現を分析するお勧めします。 </li></ol></li><li>細胞外フラックスアッセイ培地を準備します。 <ol><li>この特定の培地は、ビタミン、アミノ酸および他のサプリメントを含むが、グルタミン、グルコース、ピルビン酸および重炭酸塩を欠く基礎DMEM 5030です。 </li><li>現在のアッセイのために、完全なミトコンドリアの代謝活性に2 mMグルタミン、8 mMグルコースおよび2mMピルビン酸ナトリウムを含む培地を補います。 注：重炭酸ナトリウムの不在は重炭酸塩を含む定期的な培地は、アッセイ中のpHの変動を緩衝するので、正確に、培養物中で増殖する細胞の細胞外酸性化を測定するために不可欠です。さらに、基礎培地の使用は、異なるアッセイ条件および/またはアプリケーションに必要なグルコースまたはピルビン酸ナトリウム（Lアラニル - グルタミンのような）、L-グルタミンの濃度の厳密な制御を可能にします。 </li></ol></li></ol> 2.球をアッセイおよび分析を形成します注：すべての組織培養プロトコルおよび操作は、クリーン、界面活性剤を含まない、無菌のガラス器具を使用して、大きな注意を払って、滅菌技術を使用して実行する必要があります。 37℃のウォーターバスで使用する前に、事前に暖かいすべての培地および溶液（代替として、あなたはメディアやソリューション室温で予め温めを使用することができます）。以前に21を詳述したようにヒトPDAC腫瘍を入手します。 <ol><li>ヒトPDACからのCSCの単離（ 図1） <ol><li>無菌のバイオセーフティキャビネット内で無菌1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1 mlを含む60×15ミリメートル培養皿にヒトのPDAC組織を移します。滅菌メスとピンセットを用いて - （5ミリ1）小片に腫瘍をみじん切り。 </li><li>培養皿に滅菌1X PBSを1mlを追加し、組織が完全に解離されるまで、摩砕工程を繰り返し、定期的にこれは3-4ラウンドを必要とします。滅菌チューブに（上1×PBSで5 mlの最終容量まで）組織懸濁液を移し、機械的にgentleMACSとして解離とそれを均質化します。 </li><li> 37℃で60分間、コラゲナーゼでホモジナイズした組織を（1×PBS中のコラゲナーゼの2.5 mg / mlのを使用）インキュベートした後、900 X gで5分間遠心します。上清を除去し、完全培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。 900×gで5分間、40ミクロ​​ンストレーナと遠心を介して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li><li>上清を除去し、再懸濁赤血球溶解緩衝液（塩化アンモニウム - カリウム、ACK）5mlでペレット化し、インキュベート</li><li>ゼラチンコートディッシュ上のCSC培地、プレート内のペレットを再懸濁し、37℃で1時間インキュベートします。このステップは、すぐにプレートに付着線維芽細胞の大部分を除去します。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外し、慎重に細胞懸濁液を回収し、血球計数器を用いて（トリパンブルー陰性）生存細胞の数を定量化します。この目的のために、静かにエッペンドルフチュー​​ブにサスペンションのサスペンションやピペット20μLを混合します。マイクロ遠心チューブ中の細胞にトリパンブルーの：（1比1）とよく混ぜ20μlのを追加します。ピペット血球計数器への混合物の約10μlの。 </li><li>生菌数のための計数室の四隅の象限内のすべての明確な細胞を数えます。注：細胞の生存率および収率は腫瘍標本の間で大幅に変化してもよいです。 PDACのための試料の生存率は、定期的にbetweの範囲45から70まで%エン、および3の直径を有する巨視的な腫瘍試料からの組織片- 5ミリ、約5×10 6生細胞に生じるはずです。 </li></ol></li><li>球形成アッセイおよびメトホルミン治療<ol><li>細胞の必要な数を取り、2,000細胞/ mlの細胞濃度を調製するためのCSC媒体の適切な量を加えます。もう1時間以上氷上で細胞懸濁液を保持せず、めっき前に十分に混合しないでください。 </li><li>培地の蒸発を最小限にするために加湿用の24ウェルプレートの最初と最後の行に1×PBSを500μlを追加します。腫瘍球培地1ml（2,000細胞/ ml）中でウェルあたり2,000細胞の密度で超低付着細胞プレートに細胞をシード。 注：腫瘍球形成アッセイのために使用される細胞の数は、腫瘍タイプの間で変化してもよいです。 </li><li>車両（陰性対照）とそれぞれに割り当てられた処理を施した4ウェル、メトホルミンの例えば 、3 mMの、少なくとも4つのウェルを処理します。 PL37℃に設定したインキュベーター中で細胞をエースと一週間、5％CO 2で細胞を供給する。 注：培地は、腫瘍球の乱されない形成を可能にするために変更されるべきではないが、それらは培養培地中で安定でないように日常的に増殖因子を補充することができます。 </li><li>一日おきに、 例えば 、処理を追加します。、メトホルミンまたは車両の3 mMのを各ウェルに。より大きな構造（ 図2）の計数を可能にする自動細胞カウンターを使用して5および/ ​​または7日後に形成された腫瘍球の数を評価します。 注：少なくとも40ミクロ​​ンを有する唯一の腫瘍球が考慮されるべきであり、小型のように分類することができ、それぞれ、 - - （120ミクロン80）（40〜80ミクロン）または大。結果は、播種した細胞の最初の数（ 例えば、2,000細胞）で割った腫瘍球の割合として示すことができます。 </li></ol></li><li>第一世代の腫瘍球の連続継代<ol&gt; <li>インキュベーションの7日後に40μmのセルストレーナーを用いて腫瘍球を採取し、室温で900×gで5分間、それらを遠心します。 </li><li>トリプシンを用いて、単一の細胞に腫瘍球のペレットを分離し、その後上記のように、他の7日（2.2参照）のために再度得られた単一細胞の細胞懸濁液を展開します。 </li></ol></li></ol> 3.代謝分析（ROS生産と酸素消費量） <ol><li> ROS生産<ol><li>このプロトコルでは、我々はそれがROSを検出するための、手頃な価格、迅速かつ広範に使用されるプローブであるため、ROS産生を測定するための一例として、カルボキシDCFDAを使用しています。しかし、このアッセイのために使用することができるいくつかの他のプローブおよび方法があります。 </li><li>時間の割当量を2.2に記載されているようにメトホルミンと腫瘍球を扱います。処置の終わりに、40μmの細胞ストレーナーを用いて収穫腫瘍球を、5分間、900×gで細胞を遠心分離し、tryps 1ml中にペレットを再懸濁しますである。37℃で20分間インキュベートします。 </li><li>細胞が単数化されると、900×gで遠心分離し、2.5μMカルボキシDCFDAを含むHBSSで細胞を再懸濁します。暗所で37℃で20分間細胞をインキュベートします。 </li><li>カルボキシDCFDAは、光酸化偽陽性の結果を与えることができるようにフローサイトメトリー分析の前に、光から染色された細胞を保護します。分析まで氷上にチューブを置きます。 注：カルボキシDCFDAは、FL1（。。例：488nmの、EM 520nmの）で検出される活性酸素と窒素種の様々な、と反応させた後の蛍光です。 </li></ol></li><li>酸素消費量測定<ol><li>このプロトコルのために、我々は、一例として、タツノオトシゴBiosciences社から細胞外フラックスアナライザーシステムを使用します。コー​​トRTで20分間、細胞および組織接着剤の22.4 / mlの溶液と所望の細胞培養プレート。細胞を播種する前に3回 - 水で2井戸を洗浄します。 </li><li>処置の終了時に、収穫腫瘍球は4を使用して0ミクロンセルストレーナー、遠心分離機5分間900×gで細胞およびトリプシン1mlのペレットを再懸濁します。 37℃で20分間インキュベートします。 </li><li> （：150μlの最終体積）プレート/ウェルを96ウェルプレートに30,000細胞の密度で細胞培養プレート中で細胞を単数化。 8 mMグルコースおよび2mMのピルビン酸ナトリウムを含有する酸素消費アッセイ培地で細胞を再懸濁します。 </li><li> 100 XGに達するまで井戸のスピン遠心分離によりウェルの底に細胞を遠心分離した後、ブレーキをオフにして遠心分離を停止させて。プレートの向きを逆にして、プロセスを繰り返します。 30分間CO 2を添加せずに37℃のインキュベーターにプレートを転送します。 </li><li>一方で、分析用のカートリッジを準備します。各ウェルをロードする4つの異なるインジェクタ（25μL/ポート）があります。 <ol><li>ポートA：メトホルミン。ウェルに3 mMの最終濃度を得、最終容積として8X溶液（24ミリモル）を調製するには、175になりますμlのポートAの注射後</li><li>ポートB：メトホルミン。 3 mMのを追加し、ウェル中の6mmの最終濃度を得るためには、ポートBの注射後に200μlになる最終体積として9xの溶液（27 mm）を用意</li><li>ポートC：メトホ​​ルミン。 3 mMのを追加し、よくさ9mmの最終濃度を得るためには、ポートCの注射後225μLになり、最終体積として10倍の溶液（30 mm）を用意</li><li>ポートD：ロテノン11μM、ウェル（11X）に最終濃度として1μMを得ました。注：ロテノンは完全に任意の残留ミトコンドリア活性を阻害します。 </li></ol></li><li>カートリッジをキャリブレーションし、細胞培養プレートをロードします。混合および測定の標準プロトコルでアッセイを行います。 </li><li> （100％に設定）ロテノンで得られた阻害のパーセンテージとしてメトホルミンによって達成総ミトコンドリア呼吸の阻害の割合を計算します。 </li></ol></li></ol> 4。免疫不全マウスにおけるヒト膵臓癌のための異種移植モデル注：オーダーの実験33のためのそのようなNOD-SCID、SCIDベージュ、またはNSGなどの雌の無胸腺ヌードマウスまたは他の、より多くの免疫不全マウスモデルの十分な数。実験前に、すべての手術器具をオートクレーブし、それらを使用する前に室温まで冷却します。皮下腫瘍のために我々は8腫瘍の合計脇腹あたり1腫瘍で条件当たり4匹のマウスの最小値を使用していました。 <ol><li>異種移植移植<ol><li>ヒト膵臓癌組織標本からの腫瘍片を準備します。ペトリ皿に腫瘍を移し、組織を保持するためにメスや鉗子を使用して小片（直径2mm、〜8ミリメートル3）に組織を解剖。氷上に保持しゲル状のタンパク質混合物の溶液中に得られたピースを浸し。 </li><li> 3％のイソフルランまたは他の吸入または注射麻酔薬 - 1を使用して、マウスを麻酔。 注：任意の外科PROCを開始する前にedureは、マウスが完全にトゲの鉗子で腹部の皮膚やトウを刺激することによって、意識を失っていることを確認してください。乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li>麻酔が反映された後、消毒エタノール含有の皮膚を用いたマウスの背中を拭いてください。術後鎮痛を確保するために手術前にブプレノルフィン（0.05ミリグラム/ kg体重）を管理します。 </li><li> 0.7にし、鉗子で背部皮膚を持ち上げる-無菌マイクロハサミで1.0センチの切開をした後、露骨患者由来の膵臓癌組織片が挿入されている小さな皮下ポケット、（〜8ミリメートル3）を作製。 </li><li> 2スキンステープル - 1を使用して傷を閉じます。 7日後にそれらを削除します。ケージにマウスを返し、彼らは再び完全にアクティブになるまで加熱パッド上又は加熱ランプの下でそれらを保ちます。 </li><li>腫瘍移植後、少なくとも週二回、腫瘍の成長や、フリル毛皮、huncheとして生じる病的状態の一般的な兆候がマウスを監視D姿勢、および不動。 </li><li>腫瘍が200mm 3の平均サイズに達したら、マウスを、それぞれの治療に無作為化されます。腹腔内注射（150 / kg体重）を介して、または同等の治療効果の飲料水（150ミリグラム/ kg体重）を介して、毎日車またはメトホルミンを投与します。 </li><li>キャリパーを用いて腫瘍負荷を監視し、腫瘍体積を計算週に一度（腫瘍体積の測定幅×ブレス×= 1/2の長さ）。 </li><li>腫瘍が直径1cmに達しているか、上記で指定されたマウスは、激しい痛みや病気の兆候を示し始めるとマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+and+cancer:+doses,+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena.">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li><li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer.">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li><li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability:+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt.">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li><li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44+CD24-/low+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2++human+breast+cancer+xenografts.">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells.">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2/neu-transformed+mammary+tumorspheres.">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li><li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors.">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells.">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li><li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rodent+neurogenic+regions:+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells,+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors.">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+'side+population'+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+autofluorescence:+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells.">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li></ol>

著者らは、開示することは一切競合する興味を持っていません。

多くの腫瘍のためのCSCの概念の出現とその後の検証では、薬剤開発の分野では、より効率的ながん治療法を開発し、その後、疾患の再発のリスクを低減するための可能性を有する、新たな勢いを得ています。しかし、CSCのフィールドは、CSCの起源と伝播し、腫瘍構造を形成および転移を促進する上で自分の役割を理解するという点で達成されるべき初期の状態、よりニーズにとどまっています。 この文脈において、再現性と意味のあるCSCアッセイの使用だけでなく、得られたデータの情報に基づいた解釈は、CSC生物学の我々の理解を進めるための重要なコンポーネントを表します。多くの生物学的観点から、球の形成は非常に貴重なアッセイとして浮上しています。それにもかかわらず、ユーザーが適切に実験結果を解釈するためにその限界を認識する必要があります。でも球フォーマの評価の前に考慮すべき重要な側面るデータは、新鮮な患者由来の試料から得られた結果は、確立された癌細胞株から得られたものとは大きく異なる可能性があるので、調査サンプルの起源です。 古典的な球体形成アッセイは、21超低付着プレートにクローン密度で細胞を播種し、上皮成長因子（EGF）および/ ​​または塩基性線維芽細胞増殖因子（b-FGF）の存在下で、球体形成を評価する富むが、無血清培地含みます34。培地組成物は、考慮すべき重要な課題です。我々の経験では、血清の非存在下でB27、bFGFおよびグルタミンを補充したDMEM / F12は、未分化状態でCSCを、成長拡大し、維持するために最適な媒体であることがわかりました。私たちは、CK（この培養条件（培地、懸濁液）で細胞が（CD133 +、CD44 +およびCD24 +を含む）がん幹細胞マーカーを大量に発現し、分化関連タンパク質を発現しないことがわかりました-20及びCK-19）。 これらのアッセイのための基本的な前提条件の一つは、各球がクローンであることである、 すなわち、1つの球は、単一の幹細胞の増殖に起因します。しかし、球は本質的に低くても播種密度35で融合する傾向があるダイナミックな構造です。細胞をプレーティングすることは、プロトコルにおける重要なステップであり、1つの細胞/ウェルの密度は確かに集約問題を回避することができます。しかし、たとえ前向きソート前駆細胞のために、これは定期的に低い固有の球形成活性に非常に低い球の形成をもたらし、またによる希釈効果に限定されるもので自己分泌刺激に起因します。我々の経験では、播種した細胞の30％のみが球体を形成することができることを観察しました。我々は一貫して再現性のある結果を得るために/よく、少なくとも100個の細胞を使用することをお勧めします。 成長CSCに対する他の培養方法は、Mに基づいて、固体または半固体の3D培養（ 例えば、に基づいていますatrigel、コラーゲンまたはメチルセルロース）。これらの方法は、細胞の移動およびその後の細胞の集合36を制限するために使用されてきました。しかし、これらの行列の各々は、独自の制限を有します。例えば、マトリゲルは、エンゲル·ホルム·スワン（EHS）腫瘍から単離された可溶性基底膜であり、抽出物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外腫瘍環境に似ているが、それは多くの場合、機械的なレンダリング複数多かれ少なかれ定義された成長因子を含んでいます非常に困難な特定の調節エレメントのための研究。対価のもう一つのポイントは、球形成能力をし、幹細胞の機能が交換可能な用語34ではないということです。特定の幹細胞および前駆細胞は、in vivoでの幹/前駆機能を除外するものではないin vitroでの球を生成するための球形成能37、故障を示すことが示されているが。例えば、静止状態の幹細胞は、単にによって提供外の合図に応答しないことがあります体外培養条件で選択。したがって、 インビトロおよび精製された細胞集団のインビボでの自己再生能力の長期的には、優先的に連続継代中に、幹細胞の機能を証明または反証するために評価されるべきです。この文脈では、前向きと同時に幹細胞および前駆細胞の多様な集団を増殖させる能力は、球体形成アッセイの重要な側面であり、CSCのフィールドのために非常に価値のあるこのアッセイを描画します。限りその限界が得られたデータの解釈の際に留意されま​​す。 球形成アッセイは広く遡及インビトロで単一細胞レベルでの自己再生および分化の能力に基づいて幹細胞を同定するために使用されています。それらのインビボニッチからの幹細胞およびそれらの子孫の将来の分離を可能にするマーカーの発見は精製集団の機能的特性を定義することができます。 C言語球形成アッセイおよびFACSのombinationは、固形組織から細胞を単離または培養中のPDACの特定の亜集団を豊かにするための成功戦略です。元の腫瘍の不均一性を反映し、自己再生、分化し、腫瘍を開始：例えば、EpCAMを、CD24およびCD44の同時発現は、することができるのCSCの亜集団を定義します。ヘルマンら 。 CD133 +細胞は増強増殖能力を保有し、CSCが15を備えていることを示しました。他のマーカーはまた、CSCをの特徴付けのために使用されている：ALDH- 1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ-1）の発現が膵臓癌38において非常に腫瘍形成性細胞と関連しています。 DNA色素ヘキスト33342を排除することができる細胞は、名前のサイドポピュレーション（SP）細胞は、腫瘍39を開始することが証明能力を有します。最近、我々は、細胞内の自家蛍光の区画が異なる腫瘍タイプにわたって排他CSC形質を持つヒト細胞の別個の集団を特徴づけることが示されました40。これらのマーカーのいずれも選択のCSCの純粋な集団を特徴づけるために表示されませんが、マーカーのより多くの複雑な組み合わせは、細胞のより洗練された集団を精製し、FACSに使用する必要があります。 多くの質問はまだ正確な起源のCSCの役割、進行、および腫瘍の薬剤耐性について残ります。例えば、単一のCSCは、腫瘍を開始する場合、どのように定義するためにクローン進化の問題に対処するための一つの方法は、疾患の異なる段階で患者の試料を分析し、具体的には、治療中および治療後のCSCを数に従うことである可能性があります。これらの質問に答えることによって、我々は、固形腫瘍内のCSCの我々の知識の意味のある進展を行い、最終的には腫瘍の進行や再発を防止するための薬物療法を開発することができます。

膵管腺癌（PDAC）は最も積極的な固形腫瘍の一つです。これは、現在西洋社会における4 番目の最も一般的な癌関連死であると（〜全世界で年間40万人が死亡）、次の10年以内に2 番目の最も多い原因に存在する患者の診断、90％の3 .AT時間を増加すると予測されています5％未満の5年生存率を有する進行性疾患を有します。この生存率はがっかりするほど、ますます集中的な研究活動にもかかわらず、4、過去50年間で変化していません。外科的切除を介して潜在的に「硬化性」病を有する患者の残りの10％のうち、80％は5年以内に再発から死亡します。長年の間、進行した疾患のためのケアの標準は、ゲムシタビン単独療法となっているが、これはわずかしか生存優位5を付与する。添加することによって達成されている短期生存率の小さな改善エルロチニブ6またはカペシタビン7の、しかし生存利益は、全生存期間の中央値はまだ〜6ヶ月に数週間程度です。最近では、より多くの有望な結果は、ゲムシタビン/ NAB -パクリタキセル8とFOLFIRINOXの組み合わせ政権9,10のために浮上しています。これらの治療はそれぞれ控えめ2と4ヶ月の生存期間中央値は改善されますが、非常に毒性と長期生存者はまだまれな例外されています。治療は改善の可能性を提供していますが、これらは多くの患者が応答のみ、全体的な生存率の漸進的な改善を示していないために有毒な制度です。その結果、現在の治療法を補完すると、新規な、最も可能性の高いマルチモーダル治療アプローチを開発することが急務です。 腫瘍の不均一性これは、癌の不均一のみの異なる進化のサブクローンのwithiに限定されないことがますます明らかになってきていますnは各腫瘍11だけでなく、各サブクローン12内の表現型および機能的不均一性および可塑性によって駆動されます。いわゆる癌幹細胞（CSCの）または腫瘍促進細胞はクローン内の異質13-16を担当しています。具体的には、CSCが、彼 ​​らはそれぞれの癌サブクローン17内のすべての分化子孫を生じさせることにより、疾患のルートを表していることを、私たちと他の人が単一のセルに至るまで、決定的な証拠を提供しているために、癌細胞のサブセットを表します。さらに重要なことは、これらの細胞が転移挙動のために不可欠であり、またしても初期の腫瘍退縮（ 例えば、NAB -パクリタキセル）15,18-20を誘導することができる、比較的効果的な薬で、治療後の疾患再発のための重要な供給源を表します。これは、CSCを、必ずしも善意の幹細胞を表すものではありません、また、彼らは多くの場合、組織幹細胞から生じるないことに留意することが重要であるが、むしろ彼らが持っているACQ幹細胞の特定の機能をuired。これらのほとんどは、機能的に定義されている、例えばCSCが無期限の自己再生能力は、従来の化学療法にそれらを耐性作りを装備し、転移活性を促進増加侵襲性を示しています。 機能性がん幹細胞の表現型のCSCの機能的表現型を、それぞれシリアル球形成及びコロニー形成アッセイを用いてインビトロで試験することができる自己再生する能力に基づいています。さらに重要なこと、好ましくは排他的な長期的な腫瘍形成性を示す連続移植の際に、究極の機能読み出しとしてin vivoアッセイ希釈を制限することによってテストすることができ、インビボ腫瘍形成能で自己再生クマが可能なのCSC。また、CSCの区画内の不均一性がないだけで、その転移を生じる排他的な能力を有するのCSCの異なる亜集団であり、インビボ腫瘍形成能での排他の直接の結果。実際、metastastiticのCSCは、原発腫瘍を回避アノイキスを生き残るためには、最終的に移行してセカンダリサイトをシードする能力を獲得します。これらの高度な機能的能力を改変浸潤アッセイを用いてインビトロで試験し、 インビボでの転移アッセイを使用することができます。 癌幹細胞を標的 CSC-ターゲティング戦略21と組み合わせない限り、私たちと他の人は治療があっても、間質ターゲティング剤と組み合わせて、分化したPDAC細胞のバルク腫瘍に焦点を当てていることを説得力のある証拠を提供した、腫瘍の進行およびその後の結果に大きな影響を持っていません、 22。このように、疾患の進行および治療 ​​に対する抵抗のCSCをの重要な機能に基づいて、これらの細胞は、任意の新たな治療法18,20のための必須の成分を意味する必要がありますが、Oはるかに十分な理解が必要になりますのCSCの調節機構F。 CSCおよびそれらのより分化した子孫が遺伝的変化に対して同一の遺伝的基底状態を負担するが、CSCが明確なので、後成的に決定された遺伝子発現は、多能性幹細胞とその共有モジュールをプロファイル示します。生成誘導多能性幹細胞（Nanogの、のOct3 / 4、Klf4の、Sox2の）に関与する遺伝子の大部分は、癌に関連していないが、その発現はほとんどのCSCの区画に制限されています。また、CSCををターゲットにするための遺伝子ツールを使用して、機能喪失実験によるのCSCの機能的関連性は今しっかりと、いくつかの癌タイプ23-25 ​​用CSCの概念を確立しています。これらのアプローチの多くはマウスモデルに基づいて容易にクリニックに譲渡されていないが、それらは、バルク腫瘍細胞との組み合わせでのCSCを標的とする潜在的な臨床的関連のための概念実証を提供しません。 VIにがん幹細胞の研究彼らのアキレス腱を識別するために、TRO のCSCを標的とする新規かつ臨床的に適用可能な方法を識別するために、それらの特徴は、定期的に、インビトロで研究され、球体形成が広く、この文脈で使用されます。もともと自己再生および分化能を含む正常な幹細胞生物学を研究するために開発され、このアッセイは後にin vitroでのCSCを研究するために適合され、PDAC 20から単離したCSCを調査するために使用されています。したがって、我々は、彼らが善意の膵臓のCSC 21を含んで示す、一次ヒトPDAC細胞から形成された腫瘍球がのCSCのすべての明確な特徴を負担することを見出しました。したがって、腫瘍球アッセイは、 インビトロでより効果的な治療法をスクリーニングするための強力なツールを表すが、結果は、in vivoアッセイにおいて 、より厳格に評価する必要があります。実際、このin vitroアッセイで生成されたデータは、目として大きな慎重に扱われるべきですEアッセイは、大きな誤差を受けることができます。形成された球体の自動化された計数を含む高度に標準化されたプロトコルは、再現性と予測データを確実にするために確立されるべきです。 この文脈において、我々は最近、初代ヒトのPDACの多様なセットから誘導される膵臓のCSCをスクリーニングするために、このアッセイを使用し、これらの細胞は抗糖尿病化合物のメトホルミンによる代謝再プログラミングに対して非常に脆弱であることを示しました。以前は、メトホルミンがAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）シグナリングおよび還元タンパク質合成および細胞増殖の27が得られたmTOR 26のその後の阻害の間接的な活性化による癌細胞の増殖を阻害することが実証されました。バルク腫瘍集団に対するこれらの効果に加えて、その他はメトホルミンを標的とし、実際、乳癌、食道癌、膠芽細胞腫及び膵臓癌28-31 &lt;として固形腫瘍の数のCSCの亜集団を排除することができることを発見しました/ SUP&gt;。このように、メトホルミンは、現在満たされていない医療ニーズを持ついくつかの癌のための有望な、安全な新しい治療戦略を表しています。また、CSCを濃縮するために方法として、球体の形成を使用して、我々は、膵臓のCSCのメトホルミンの主な効果はAMPK活性化とは無関係に、ほとんど明らかにサブセットに対して致死であった、（複合体Iの阻害を介して）、そのささやかなミトコンドリア毒性に依存していたことを示しましたのCSCだけ。後者のために、我々は、細胞レベルでの薬物の毒性の指標としてそれらの細胞の酸素消費量とミトコンドリアROS産生を評価することができました。続いて、これらのインビトロのデータは、前臨床マウスモデルにおいて検証し、実際に大幅に生存期間の延長31をもたらした可能性があります。本明細書に提示する方法は、CSC代謝に及ぼす影響についての研究を含めたCSCのための薬剤感受性プロファイルの迅速な生成を可能にします。現在、利用コムについて拡張実験の詳細を提供しますin vitroおよびin vivoの手順で plementary。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Counting Chamber/Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td>
			<td>Roche Innovatis</td>
			<td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Ultra-low Attachment Plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml sterile tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton Syringe Co</td>
			<td>81075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metformin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D150959-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200 mM, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Sodium Pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Assay medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100965-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution, 0.05%&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50x&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium/F12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2&#39;,7&#39;-DichlorofluoresceinDiacetate)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (vol/vol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>IsoVet, Braun</td>
			<td>571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sterile Cotton tipped applicator</td>
			<td>&#160;Puritan medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with CO2 input&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying pancreatic cancer stem cell characteristics for developing new treatment strategies

膵管腺癌（PDAC）は、放射性および化学療法に対する腫瘍の開始、転移および抵抗を駆動することが示されている排他的に腫瘍形成性癌幹細胞（CSCを）のサブセットが含まれています。ここでは、足場非依存性の条件で腫瘍球のような主要なヒト膵臓のCSCを培養するための具体的な方法論を説明します。細胞は、それらのより分化した子孫が生存し、単一の細胞の播種以下の初期段階の間に増殖しないながらのCSCを濃縮するために、無血清、非付着条件下で増殖させます。このアッセイは、腫瘍細胞の集団に存在するのCSCの割合を推定することができます。 （35から250マイクロメートルの範囲とすることができる）サイズと形成された腫瘍球の数の両方が培養された癌細胞または新たに採取し、消化された腫瘍1,2のバルク集団のいずれかに抱いCSC活動を表します。このアッセイを使用して、我々は最近、メトホルミンが選択pancreatを切除することがわかりましたICのCSC;その後、さらに多能性関連遺伝子/表面マーカーの発現が減少を示すことによって裏付けとメトホルミンで処理した細胞の生体内腫瘍形成性に減少した発見。前臨床開発のための最後のステップとして、我々は、メトホルミンとの確立した腫瘍を有するマウスを処置し、大幅に生存期間の延長を発見しました。 PDACを有する患者において、メトホルミンの使用をテストする臨床試験が現在進行中である（ 例えば、NCT01210911、NCT01167738、およびNCT01488552）。機構的に、我々は、メトホルミンは、反応性酸素種（ROS）の産生を増強し、ミトコンドリアの膜電位を低下させることによってのCSCにおける致命的なエネルギー危機を誘発することがわかりました。対照的に、非のCSCは、メトホルミン治療によって排除ではなく、可逆的な細胞周期の停止を受けていませんでした。したがって、我々の研究は、潜在的にCSCを標的とする化合物を同定するためのスクリーニングツールとしてインビトロ球形成の可能性のための成功例として機能しますsが、この技術は、偽発見を排除するために、in vitroおよびin vivoの検証にさらに必要となります。

メトホルミンは、選択的に膵臓のCSCを対象 我々は最初のCSC の in vitroでの自己再生能力にメトホルミン治療の機能的効果を調べました。この目的のために、我々は、手術中に切除PDAC組織から単離された初代ヒト膵臓癌細胞を使用して球体形成アッセイを行いました。我々は、メトホルミンが強く形成された球体（ 図1A）の大きさを減少させたことを観察しました。これは、彼らだけのCSCのために濃縮されているように、まだ球で見つかった細胞の大部分を表すCSCの子孫の拡大を阻害することにより、最も可能性が高いとしました。実際、長い球になりますより分化子孫のより広範な展開を継代することなく培養されます。したがって、我々は、Cの自己再生能力の強力な阻害を示唆して用量依存的に発生する、かなり実際にそれらのサイズにかかわらず、形成された球の数を減少させるメト​​ホルミンを発見しましたのSC（データは示さず）。私たちは3 mmにメトホルミンを大幅に（ 図1B）が形成された球体の数を減少させたことがわかりました。より厳しくのCSCの自己再生能力にメトホルミンの長期的影響を研究するために、我々は、その後、第二級および第三級球状に形成された一次球を継代しました。唯一の主要な球体がメトホルミンで処理したが、第二および第三の通路内の球の形成を大幅にますますメトホルミン治療が実際に不可逆的のCSC（ 図1C）の大部分を除去した関与、減少しました。したがって、我々のデータは、一次膵臓のCSCの自己再生能力にメトホルミンのための有意な治療効果を示し、したがって、さらに機械的なだけでなく、in vivoでの研究を行うために私たちを奨励しました。 メトホルミンは、ミトコンドリア酸素消費量を抑制し、ROSの産生を誘導します metformiので、nは、部分的に複合体Iの活性を阻害することによってミトコンドリア毒として作用することが示された、我々は次の球由来細胞における細胞の酸素消費に対するメトホルミンの急性の効果を調べました。この目的のために、我々は2つ​​の代表的な一次PDAC腫瘍に由来する細胞を選択し、3 mMのメトホルミン（3回の注射）及び1μMのロテノン（一回の注射）の連続注入後の時間の経過とともに酸素消費量を測定しました。 図2Aに示すように、メトホルミンの注入は、異なる腫瘍の間でかなり変化し、酸素消費量の迅速かつ用量依存的な減少を誘発しました。我々は完全にミトコンドリアの酸素消費量を抑制することが可能であるロテノン、私は強力な阻害剤複合体を、注入することによって、メトホルミン治療の際に残存ミトコンドリア活性を算出しました。 POPUの平均値のずれとして定義ROSの産生を誘導する能力と相関して、ミトコンドリア酸素消費の観点からメトホルミンに対する感受性簡単に（ 図2B、右パネル）を定量することができるメトホルミン治療（ 図2B、左パネル）、後レーション。予想されるように、酸素消費の阻害に最も感受性であった初代細胞はまた、メトホルミン治療時ROS産生の最も強力な増加を示しました。したがって、これらの代謝のin vitro実験は、その後のミトコンドリアROS産生の増加およびアポトーシスの誘導、最終的にその結果、ミトコンドリア機能への依存を阻害することにより、そのメトホルミンターゲットのCSCを示しています。 インビボでのメトホルミン屋台PDACの進行 我々は最終的にPDACと異なる患者由来の組織の異種移植片を用いてインビボでのメトホルミンの効果を検討しました。我々は、対照群と比較して、メトホルミン処置マウスについての腫瘍進行の有意な減少が観察されたが、腫瘍は決して完全にDISAppeared（ 図3）。続いて、長期的なフォローアップ時にすべての腫瘍は、最終的には、治療の初期段階を生存細胞のメトホルミン性を示唆して再発しました。それにもかかわらず、メトホルミン治療は、単剤として適用した場合であっても、大幅にすべてのマウスの生存を延長しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> 図1.メトホルミンを選択のCSCをターゲットとします。（A）メトホルミンは、球の大きさを減少させました。球体の代表的な画像は、7日（右パネル）のためのメトホルミンの示された用量での治療後に得られました。球の大きさの定量化（n≥6）（左パネル）は、横軸で表示された数字は、個々の腫瘍を表​​します。 （B）7日（n≥6）のためのメトホルミンの存在下または非存在下で球形成能力、横軸で表示された数字軸は、個々の腫瘍を表​​します。 （C）一次膵臓癌細胞の第二級および第三級球におけるCSCの自己再生能力の代表的なグラフ。球はわずか7日間の合計のための第一世代の球形成の間に処理した（n = 6）である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> 図2.メトホルミン治療阻害の酸素消費量と誘導するROS生産。（A）メトホルミンの添加は、球由来細胞の酸素消費量（OCR）を阻害します。二つの異なるPDAC二球はメトホルミンで処理し、OCRの変化は、細胞外フラックス分析により測定しました。ロテノン注射は総ミトコンドリアOCRの消費のための対照として使用しました。X軸は、各ウェル中のタンパク質含有量によって正規化された酸素/ hrのピコモルでの酸素消費速度を表します。 Aに用いられる（B）PDAC球はメトホルミンで8時間処理し、ROSの産生がカルボキシDCFDAを用いたフローサイトメトリーによって評価しました。左、プロット代表的なフローサイトメトリー。右、3つの独立した実験からのデータの要約。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> 図3. インビボでのメトホルミン屋台PDAC進行が。二つの異なるPDAC異種移植組織を免疫不全マウスに移植した、初期の腫瘍テイクを確認した後に処理を割り当てられました。マウスは、メトホルミン（メット）で処理した飲料水に添加した（150mgの/ kg体重ウェイGHT;一日あたりの水消費量の5ミリリットルに基づく）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K ビュー.  Spanish National Cancer Research Center. Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

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Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

医学

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

肺炎のための有用な補助的ツールとしてのオステオパシー整体

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...