Dieses Protokoll bietet reproduzierbare, immunkompetente PDAC-In-vivo-Modelle, die für Genotyp-, Phänotyp- und Arzneimittelreaktionsstudien geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Tumorprogression mit einer syngenen biologischen Tumormikroumgebung untersuchen kann, während die Reproduzierbarkeit des Experiments erhalten bleibt. Stefanie Barthel und Chiara Falcomata, beide aus unserem Labor, führen das Verfahren vor.
Beginnen Sie mit der Präparation der Tumorzellen, indem Sie das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse oder die PDAC-Zellen, die in einem T75-Kulturkolben gezüchtet wurden, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS waschen. Dann 0,5 Milliliter Trypsin für fünf bis 10 Minuten hinzufügen, um sich aus dem Kolben zu lösen. Die abgelösten Zellen werden in 10 Millilitern DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 0,1 % Penicillin-Streptomycin resuspendiert, bevor die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen übertragen wird.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 200 G und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie das Zellpellet in DMEM ohne Zusatzstoffe, basierend auf der erforderlichen Endkonzentration der Zellen für die Injektion. Zählen Sie die Zellen in 10 Mikrolitern Zellsuspension mit der Neubauer-Kammer und berechnen Sie die Anzahl der verfügbaren Zellen.
Übertragen Sie einen Milliliter der verdünnten Suspension entsprechend der erforderlichen Endkonzentration in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie den Schlauch bis zur Implantation auf einen Rotator, um eine Zellaggregation zu verhindern. Für die orthotope Implantation von PDAC-Zellen tragen Sie Augencreme auf die analgosedierte Maus auf, während die Maus schläft.
Überprüfen Sie die ausreichende Analgosedierung, bevor Sie die linke seitliche Bauchflanke der analgosedierten Maus rasieren. Legen Sie die Maus auf der rechten Seite liegend auf eine sterile Heizmatte und kleben Sie die Beine mit Klebeband auf die Oberfläche. Tragen Sie neue Handschuhe und desinfizieren Sie sie.
Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere etwa einen Zentimeter der Haut und des Unterhautfettgewebes in Längsrichtung an der linken Flanke ab, wo die Milz projiziert wird. Trennen Sie die Haut mit Schere und Pinzette vom Bauchfell, um einen leichteren Zugang zum Bauchfell zu erhalten. Wechseln Sie die Schere, bevor Sie das Bauchfell an der Stelle der Milz mit einem Längsschnitt von einem Zentimeter öffnen.
Achten Sie bei der Mobilisierung der Milz und der angesetzten Bauchspeicheldrüse mit einer stumpfen Pinzette mit feiner Spitze darauf, dass die Organe nicht mit anderem Gewebe verbunden sind. Achten Sie auch auf die zuführenden Blutgefäße, um eine Verletzung der Gefäße oder des umliegenden Gewebes beim Umgang mit der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden. Ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig aus dem Schnitt, um einen leichteren Zugang zum Schwanz des Organs zu ermöglichen, und beobachten Sie die Milz, die der Bauchspeicheldrüse folgt.
Stellen Sie sicher, dass das Organ während der Injektion nicht gefaltet wird und die Organkapsel an der Nadeleindringstelle unter Spannung gehalten wird, um ein Verschütten zu vermeiden. Zielen Sie auf ein Stück Bauchspeicheldrüsengewebe zwischen den sichtbaren Blutgefäßen, um das Risiko einer Punktion oder Injektion des Gefäßes zu minimieren. Mit der dominanten Hand wird die Kapsel des Organs mit einer Kanüle von 27 Gauge und einer 50-Mikroliter-Spritze vorsichtig entlang der Längsachse des Organs durchdrungen.
Nach der Injektion der 20 Mikroliter Suspension mit 2.500 Zellen in den Schwanzbereich der Bauchspeicheldrüse halten Sie die Bauchspeicheldrüse und die eingeführte Spritze etwa eine Minute lang still, um ein Verschütten der Tumorzellen zu vermeiden. Entfernen Sie dann die Nadel von der Injektionsstelle. Ordnen Sie als Nächstes die Organe im Bauchraum vorsichtig neu an, ohne das Gewebe zu verletzen, um ein Verschütten der Zellen zu vermeiden.
Vermeiden Sie Organverklebungen, indem Sie einen Milliliter 0,9%iges Natriumchlorid auf die Organe gießen. Nach dem Nähen des Bauchfells mit der einfachen unterbrochenen Nahttechnik verschließen Sie die Haut mit zwei bis drei neun Millimeter dicken Wundklammern aus Edelstahl. Antagonisieren Sie dann die Analgosedierung mit Midazolam, Medetomadin und Fentanyl oder MMF mit einer subkutanen Injektion von AFN entsprechend dem Körpergewicht der Maus.
Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Maus in eine bei 37 Grad Celsius beheizte Kammer, bis sie wach und vollständig aktiv ist. Setzen Sie die aktive Maus wieder in ihren ursprünglichen Käfig und überwachen Sie den Gesundheitszustand der Maus, indem Sie das Fell, die Hautfarbe und die Aktivität überprüfen, und wiederholen Sie dies drei bis vier Stunden nach der Operation. In der MRT der implantierten Maus wurde das Transplantat von PDAC-Zellen frühestens etwa sieben Tage nach der Operation abdominal palpiert, abhängig von der injizierten Zellzahl und den Aggressivitäts- und Wachstumseigenschaften der inokulierten Zelllinie.
Das Überleben der implantierten Mäuse variierte in Abhängigkeit von den Tumorzell-intrinsischen Merkmalen der Zelllinien. Erfolgreiche intrapankreatische Injektionen führten zu ausgewachsenen Tumoren in der Bauchspeicheldrüse der Maus. Im Gegensatz dazu führten erfolglose Implantationen zum Fehlen von Bauchspeicheldrüsentumoren aufgrund der Injektion nicht lebensfähiger Zellen, der Abstoßung der implantierten Zellen oder der Injektion einer unzureichenden Anzahl von Zellen.
Denken Sie daran, darauf zu achten, dass während der Injektionen keine Zellen verschüttet werden und kein umliegendes Gewebe verletzt wird, um zu verhindern, dass sich Zellen im Bauchraum ausbreiten. Im Anschluss an dieses Verfahren können In-vivo-Studien, wie präklinische Studien zum Ansprechen auf Medikamente, an immunkompetenten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von z. B. Fakten, Sequenzierung oder histologischer Analyse, um Tumor-Wirt-Interaktionen zu untersuchen.
