Der Autor dankt Dr. Jin Gao für PGS-Synthese, Dr. Peter Crapo für aufschlussreiche Diskussion für Bioreaktor-Setup, Drs. Mohamed Ezzelarab und Wei Wu für Explantation Pavian Halsschlagadern. Diese Studie wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R01 HL089658) unterstützt.

1. Tubular Scaffold Fabrication <ol><li> Bereiten Glasrohr (Länge = 70 mm, Außendurchmesser = 9,0 mm, Wandstärke = 1,0 mm; Kleinteile, Miramar, FL) als Form für Gerüst. </li><li> Bereiten 1,0 Gew. / Vol-% Hyaluronsäure (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durch Lösen von 100 mg HA in 10 ml VE-Wasser. Mix mit einem Rotator über Nacht, bis keine Luftblasen in der Lösung sind. </li><li> Gießen Sie 1,0% HA-Lösung in der Spitze der Glasröhren. Lassen Sie es langsam entlang der Innenwand der Form. Flip über den Schlauch, wenn die Lösung erreicht den Boden der Form mit dem Rotator und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Innenwand der Form wird gleichmäßig von der Lösung beschichtet. </li><li> Nach der Beschichtung trocken alle Glas-Schläuche in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h </li><li> Grind und Sieb Salzpartikel (size = 25-32 um) als Porenbildner eingesetzt. </li><li> Bauen Sie ein Glasrohr (beschichtet mit 1,0% HA-Lösung innen), Dorn (Edelstahl umhüllt von PTFE-Schlauch), Schrumpf (HS) Hülse und PTFE-Ring, wie vorher beschrieben 8. </li><li> Mit Salz Teilchen der gewünschten Größe auf die Glasform mit einem Spatel durch die Silikon-Gummi Trichter. Tippen Sie auf die Form vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung von Salz Partikel zu gewährleisten. Abkratzen das überschüssige Salz Partikel am oberen Rand der Form mit der Seite der Spachtel. </li><li> Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator für 30 min vor der Übertragung das Salz verpackt Schimmel. Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator-und Put-Salz-packed Form, in der Hybridisierung Inkubator für Salz Fusion. </li><li> Entfernen Sie die Formen aus der Hybridisierung Inkubator und trocknen Sie sie in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h </li><li> Entfernen Sie das Salz verpackt Formen aus den Vakuum-Trockenschrank und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Edelstahl-Dorn, indem es sich mit dem Halten der PTFE-Ring. Wenn der Dorn ist zu eng, um die Form, die Nadel Zange, ihn herauszuziehen. Entfernen Sie die PTFE-Ring aus dem Boden der Form. </li><li> Legen Sie die Formen in den Ofen bei 120 ° C für 5 min auf HS Ärmel schrumpfen. Prüfen Sie, ob die HS Hülse geschrumpft. Entfernen Sie den HS Hülse aus dem Salz-packed Formen und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Halten Sie die Formen in den Exsikkator, bis sie verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie die PGS-Lösung durch Lösen von 3 g PGS in 15 ml Tetrahydrofuran (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zu einer 20 wt / vol% ig. </li><li> Fügen Sie die PGS Lösung für das Lumen des Salz-packed Formen, indem Sie es mit einem spoid in der Hume Kapuze. Lean die Glasform ca. 45 °-and-Drop die PGS-Lösung in Innenlumen mit rotierendem Werkzeug langsam. Prüfen Sie, ob die PGS-Lösung fließt entlang der Wand von Schimmel. Wenn trockene Stelle beobachtet wird, fügen Sie mehr Lösung. </li><li> Nach dem Hinzufügen der PGS-Lösung, legen Sie die Formen in der Hume Haube für mindestens 30 min für die Verdampfung THF. </li><li> Legen Sie die Formen in den Vakuum-Trockenschrank für vorgegebene Aushärtezeit (ex. 24/36 / 48 h) bei 100 mTorr und 150 ° C für die Aushärtung PGS. </li><li> Nach dem Aushärten nehmen Sie die Formen und platzieren sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Dip jeder Form, in der VE-Wasser mit vertikaler Position langsam. Nicht tauchen sie in das Wasser schnell, weil Luftblasen kann dazu führen, reißen das Schafott. </li><li> Übertragen Sie die Formen in das Wasserbad vorsichtig und legen Sie sie in einem Winkel für 1 h mit Silikonschlauch zum HA leicht auflösen. Prüfen Sie, ob HA aus der Form gelöst ist. Wenn keine HA aus der Form gelöst wird, drücken Sie das eine Ende des Gerüsts langsam mit Spachtel, um es von der Form lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt am anderen Ende des Gerüsts und schütteln Sie die Form hin und her langsam im Wasserbad. Prüfen Sie, ob das Gerüst im Inneren der Form bewegt wird. </li><li> Übertragen Sie die Gerüst zu einem anderen Wasserbad mit Rührer sorgfältig. Versuchen Sie nicht das Gerüst fest, die das Gerüst knacken könnte. Legen Sie das Gerüst in das Wasserbad für mindestens 3 Tage mit wechselnden Wasser auslaugen Salzpartikel. </li><li> Nach Auslaugen Salzpartikel, Transfer jedem Gerüst um die 15 ml Zentrifugenröhrchen mit dem VE-Wasser gefüllt und legen Sie sie in der Trockeneis-Box für 1 h zu frieren. Put Zentrifugenröhrchen in die Lyophilisator (alle Rohr Kabinen geöffnet werden muss) und lyophilisieren sie für 2 Tage. </li><li> Legen Sie alle Gerüste in den Exsikkator vor, bis sie verwendet werden. </li></ol> 2. Scaffold Vorbereitung für Cell Seeding <ol><li> Nehmen Sie Gerüsten aus dem Exsikkator und schneiden Sie sie als 25-30mm Länge. </li><li> Bereiten Sie zwei Silikon-Gummistopfen (Durchmesser = 20 mm, Wandstärke = 6,35 mm, mittlerer Durchmesser = 3 mm) und verbinden zwei PTFE-Schläuche (Außendurchmesser = 3,97 mm, Innendurchmesser = 2,38 mm, Wandstärke = 0,79 mm, Länge = 60 mm und 40 mm) durch die Mitte Löcher von jedem Anschlag. </li><li> Schneiden Sie ein HS-Ring als 1,5 mm Länge und setzen Sie es auf ein Ende des Gerüsts. Schieben Sie eine PTFE-Schlauch (Silikon verbunden Gummistopfen) in das eine Ende des Gerüsts als kleine Schnittmenge wie möglich. </li><li> Legen Sie die Gerüst-und PTFE-Schlauch in den Ofen bei 120 ° C für 10 min bis HS Ring schrumpfen. Prüfen Sie, ob HS Ring ist geschrumpft und Gerüste sind PTFE-Schlauch verbunden fest. </li><li> Nehmen Sie die Gerüst-und PTFE-Schläuche und legen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Legen Sie die Gerüst-PTFE-Schlauch-Baugruppe in der Polycarbonat-Rohr (Außendurchmesser = 15,5 mm, Innendurchmesser = 9 mm, Länge = 50 mm) als Bioreaktor Kammer. </li><li> Schließen Sie das andere Ende des PTFE-Schlauch zum Schafott als Schritte 2,3) und 2,4). </li><li> Passen zwei Silikon Gummistopfen an ihren inneren Oberflächen an beiden Enden der Polycarbonat-Rohr befestigen. Befestigen Sie die beiden äußeren Oberflächen aus Silikon Gummistopfen mit zwei Aluminium-Legierung Platten (oben und unten, Breite = 20 mm, Länge = 70 mm, Dicke = 6,35 mm). Legen Sie zwei Gewindestangen in die seitliche Öffnung der Platte und befestigen Sie die Röhrchen aus Polycarbonat (im Lieferumfang enthalten das Gerüst innen) zu den Platten durch Anziehen Flügelmutter Schraube auf der Platte. </li><li> Messen Sie die Länge der einzelnen seedable Gerüst (mit einer Länge zwischen zwei HS Ringe) und berechnen innere Oberfläche (π x Innendurchmesser x seedable Länge) jedes Gerüst für die Zell-Aussaat. </li><li> Wickeln Sie ein Bioreaktor-Kammer-Anlage mit Alufolie und sterilisieren sie durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min. Sterilisieren jedes Teil (mittel-Reservoir, Pumpe-Schlauch-, Gas-Wärmetauscher, Verteiler und Nadelventil) des Bioreaktors durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und montieren sie in der Zellkultur Kapuze. </li><li> Pre-treat und spülen Gerüste mit einer Reihe von Infusionen (70, 50 und 25% Ethanol für 1 h-, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; Mediatech, Herndon, VA) für 2 h und SMC Kulturmedium für 24 h mit einer Schlauchpumpe bei 1,0 ml / min in den Fluss-Schaltung. </li></ol> 3. Zellaussaat und Kultur <ol><li> Isolieren primären arteriellen glatten Muskelzellen (SMC) von der Halsschlagadern von jugendlichen männlichen Pavianen (Papio Anubis) und kennzeichnen sie in zweidimensionale (2D) Kultur vor Passagierung und Aussaat, wie vorher beschrieben 9. </li><li> Expand SMCs mit dem MCDB 131 Medium (Mediatech, Herndon, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-Glutamin (Mediatech), 50 pg / ml Ascorbinsäure (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), und eine Antibiotika-Antimykotika-Lösung (10.000 IE / ml Penicillin, 10.000 pg / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B; Mediatech). </li><li> Lösen Sie jeden Bioreaktor Kammer von der Strömung Schaltung in den Bioreaktor. Seed SMCs (Passage 4-6), um das Gerüst mit einer Dichte von 2x10 6 Zellen / cm 2 durch die Injektion Suspension mit 5 ml-Spritze in das Lumen von Gerüsten nach dem Abschneiden beider abluminalen (Einlass) und luminalen (Ausgang) fließt. </li><li> Legen Sie alle Bioreaktor Kammern in die Hybridisierung bei 37 ° C und drehen Sie sie um 2 min für 4 h, damit die Zellen gleichmäßig in das Gerüst verteilt. </li><li> Nehmen Sie Bioreaktor Schränke aus der Hybridisierung Inkubator bringen Sie sie Schaltung des Bioreaktors in der Haube fließen. Übertragen Sie alle Bioreaktor-System in Zellkulturbrutschrank. </li><li> Schließen Sie die Pumpe-Schlauch (Innendurchmesser = 1,6 mm), um den Knorpel der Schlauchpumpe und Last frischem Kulturmedium in das Reservoir. Starten Sie den durch-Wand-Perfusion (luminalen zu abluminalen) bei 1,0 ml / min für 15 min durch luminale Strömung nur gefolgt. </li><li> Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit und Druck allmählich von 1,0 ml / min (luminalen Scherspannung: 1,1 Dyn / cm 2) und 20 mmHg am Tag 1 bis 14,2 ml / min (15,3 Dyn / cm 2) und 120 mmHg am Tag 21, bzw.. Ändern Sie den Pumpenschlauch (Innendurchmesser = 3,2 mm) an Tag 4 und das Medium einmal pro Woche. </li></ol> 4. Tissue Ernte und Probenvorbereitung für die Analyse <ol><li> Nach 21-Tage-Kultur, stoppen Sie die Pumpe und Schläuche Klemme (Einlass und Auslass) des Mediums Reservoir. Lösen Sie den Pumpenschlauch aus dem Knorpel der Schlauchpumpe und Transfer-Bioreaktor-System in der Motorhaube. </li><li> Clamp Ein-und Auslass-Schläuche jeder Bioreaktor Kammer und nehmen Sie ihn aus dem Fluss-Schleife. Öffnen Sie den Zulaufschlauch und bereiten eine Petrischale am Ausgang Schlauch an Kulturmedium in der Polycarbonat-Röhrchens zu sammeln. Öffnen Sie den Ablaufschlauch langsam und entfernen Sie das Medium aus der Kammer. </li><li> Lösen Sie abluminalen Gauge-Nadel und luminalen Silikonschlauch aus der Kammer und lösen Aluminiumplatten durch Loslassen Rändelschrauben. Entfernen Sie die Polycarbonat-Rohr und lösen Sie ein Ende des Gewebes Konstrukt aus dem PTFE-Schlauch. </li><li> Bereiten Sie eine Petrischale mit 10 ml PBS gefüllt und lösen andere Ende des Konstrukts aus dem PTFE-Schlauch. Legen Sie bauen in die PBS und spülen dreimal. </li><li> Schneiden Sie das Konstrukt mit einer Rasierklinge als 5-mm Länge. Frieren sie bei -80 ° C Gefrierschrank für biochemische Assays oder ihn an 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frisches Medium für mechanische Prüfungen oder Snap freeze in den Tissue-Tek optimale Schnittqualität Temperatur Verbindung (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA gefüllt ) für die Histologie / immunofluorescence Färbung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Der röhrenförmige PGS Gerüste wurden unter Verwendung biologisch abbaubarer Elastomer, das durch Salz Fusion-Methode (Abb. 1A). Jeder Bioreaktor Kammer vorgesehen Gerüste mit beiden luminalen und abluminalen fließt und könnte als eine separate Einheit aus einem Hauptstrom-Schleife (Abb. 1B) gelöst werden. Bioreaktor-System wurde für die Kultivierung vier Gerüsten zu einer Zeit, durch die Steuerung und Überwachung von Durchflussmengen sowie Druck (Abb. 1C &amp; D) entwickelt. Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur wurde in Abb.. 2. Nach dem Impfen SMCs wurde jeder Bioreaktor Kammer gedreht bei 37 ° C für 4 h auf Zellen gleichmäßig zu verteilen in das Lumen des Gerüsts. Und dann war pulsatilen Fluss auf Gerüsten bis Tag 14 mit allmählich zunehmender Strömungsgeschwindigkeit (Abb. 2A) und Druck (Abb. 2B) angewendet. Nach Tag 14, gehalten Durchfluss und Druck bis zum Ende der Kultur (Tag 21) konstant. Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass Gerüst hatte konsequente Wandstärken (539 ± 18 um) (Abb. 3A) und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren auf der luminalen Oberfläche (Abb. 3B). Morphometrische Parameter des Gerüsts wurde aus welche unser Tomographie (Mikro-CT) und Imaging-Analyse gemessen. Die durchschnittliche Porengröße beträgt 23,3 ± 3,9 um und Poren Interkonnektivität beträgt 99,4 ± 0,62%, was bedeutet, dass alle Poren vollständig in Gerüst verbunden ist. Porosität von Ethanol Verschiebung gemessen beträgt 75,6 ± 2,7%. Cellular Morphologie der PGS-Konstrukt wurde durch SEM (Abb. 4) untersucht. Mehrschichtige SMCs völlig der luminalen Oberfläche bedeckt und sie waren senkrecht orientierten zur Strömungsrichtung. Diese Ergebnisse zeigen, dass mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor SMC Orientierung unterstützt in dem Schafott. Die Anwesenheit der extrazellulären Matrix (ECM) und elastischen Fasern wurden von H &amp; E-Färbung und Elastin Autofluoreszenz (Abb. 5) untersucht. H &amp; E Färbung zeigte, dass Zellen und ECM Proteine ​​vollständig das Lumen des PGS abgedeckt konstruieren. Elastin Autofluoreszenz zeigten auch, den Umfang organisiert elastischen Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts. Produktion von ECM-Proteinen in PGS-Konstrukte wurden von biochemischen Assays gemessen. Die unlöslichen Elastin und Kollagen Inhalte waren 20,2 ± 9,1 pg / mg Gewebe und 6,3 ± 1,9 pg / mg Gewebe bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Scaffold Herstellung und Bioreaktor-System. (A) Schematische Darstellung des röhrenförmigen Gerüst Fertigung. (B) Bioreaktor Kammer. Gerüste wurden PTFE-Schlauch verbunden, platziert in der Polycarbonat-Rohr eingesetzt und durch Silikon-Gummistopfen und Aluminium-Legierung Platten. Jede Kammer hat zwei Fließwege: luminalen (durch Silikonschlauch) und abluminalen (durch Nadel) fließt. (C) Bioreaktor-System in den Brutschrank gestellt. Es umfasst mittlere Reservoir, Schlauchpumpe Modul-, Gas-Wärmetauscher, Drucksensoren, zwei Verteiler (oben und unten), und Nadelventil. (D) Bioreaktor-System platziert außerhalb des Inkubators. Es umfasst Druck-Monitor, Flow Control Unit, Datenerfassung und-Computer. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur. (A) Kultur-Protokoll. (B) Applied Druckprofile zu jedem Zeitpunkt (Tag 1, 4, 7 und 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst. (A) Querschnitt. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Cellular Morphologie der PGS zu konstruieren. (A) Lumen. (B) Querschnitt von 45 ° schneiden. Arrows in beiden Figuren stellen die Fließrichtung. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Histologie und Elastin Autofluoreszenz der PGS zu konstruieren. (A) H &amp; E Färbung. (B) Entsprechende Elastin Autofluoreszenz. L: Lumen. Vergrößerung: 40x. Maßstab: 50 pm.

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Die Herstellungstechnik mit einem biologisch abbaubaren Elastomer hier beschriebenen hat mehrere Funktionen. (1) Wir verwendeten Hyaluronsäure (HA) als Trennmittel. Da HA ist wasserlöslich, war Gerüst leicht von der Glasform nach Einweichen in Wasser gelöst. In diesem Bericht verwendeten wir 1,0 Gew. / Vol% der HA-Lösung, weil niedrige Konzentration (&lt;0,5 wt / vol%) der Lösung ist nicht zähflüssig und fließt so schnell, als wir es in Strömen auf der Glasröhren. Zur Beschichtung HA-Lösung gleichmäßig, klappte die wir in den Glasröhren, wenn die Lösung flog der Unterseite der Schläuche und wiederholt diesen Schritt. Diese HA-Beschichtung ist eine kritische, um unsere Fertigung Verfahren zur Freigabe letzten Gerüste. (2) Wir verwendeten Schrumpfschlauch (HS) Hülse für die Beibehaltung Salze in den Glasröhren. Da Salze wurden dicht in den Raum zwischen der Innenwand der Glasröhren und die HS Ärmel gepackt, behielt HS Ärmel Salze nach dem Entfernen Dorn und PTFE-Ring in den Boden des Schlauchs. Wir konnten HS Ärmel leicht entfernen, indem man die Form in einem Ofen bei 120 ° C für 5 min, und dann bekommen röhrenförmigen Salz-Vorlagen. (3) Wir benutzten das Salz Fusion-Methode. Es ist bekannt, dass Salz Fusion-Methode kann Pore Interkonnektivität und die mechanischen Eigenschaften durch Variation fusion Zeit 10 zu verbessern. Darüber hinaus, da wir PGS verwendet wurden Makro-Poren, die durch das Salz Partikel während der Laugung Verfahren hergestellt, während die Mikroporen wurden wahrscheinlich durch Glycerin erzeugte Dampf gebildet während PGS Aushärtung wie wir vorher 11 beschrieben. So hat diese Methode das Potenzial, porösen röhrenförmigen Gerüsten mit verschiedenen Makro-und Mikro-Strukturen herzustellen durch Variation Salzpartikel sowie PGS Aushärtung Zustand. Die mechanische Konditionierung aus dem Bioreaktor hat pulsatilen Fluss Perfusion zur Verfügung gestellt (maximale mittlere Durchfluss = 14 ml / min, maximale Schubspannung = 15,3 dyn / cm 2, Frequenz = 0,5 bis 1,7 Hz) und physiologisch relevanten Druck mit dem PGS Gerüst, das dazu geführt, SMC Wachstum und Orientierung (Abb. 4). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien berichten, dass zyklische Dehnung bei dieser Frequenz und Schubspannung erhöht SMC-Proliferation 12 und ECM Proteinproduktion 13,14. Zusätzlich zu SMC Wachstum und Orientierung, PGS ECM Protein-Produktion unterstützt zu konstruieren, insbesondere den Umfang elastischen Fasern (Abb. 5) innerhalb von 3-Wochen-Kultur im Bioreaktor organisiert. Einige Studien unter Verwendung eines elastomeren Gerüst als kleinem Durchmesser arteriellen konstruieren, mechanische Festigkeit und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 15, und eine schnelle Integration in SMC-konform Gerüste mit Spinnerflasche 16,17 gezeigt, während keine elastischen Fasern in diesen Konstrukten gefunden wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass zyklische radiale Ausdehnung aus dem Bioreaktor verbesserte mechanische Signalübertragung effizienter zu SMCs in PGS Gerüst, was wahrscheinlich dazu beigetragen, Synthese und Organisation Elastin. Da vaskuläre SMCs waren die einzigen Zellen, die ECM-Proteine ​​in unserem Ansatz, Ruhestrom Endothel produziert und Verbesserung der mechanischen Festigkeit sind notwendig, um eine klinisch erfolgreiche kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte zu entwickeln. Wir haben berichtet, dass Endothelzellen mit SMCs erwirtschaftete einen Monolayer und unterstützt Phänotyp-Protein-Expression unter unseren Kulturbedingungen und mechanischen Konditionierung 9 Co-kultiviert. Deshalb, basierend auf unserem Ansatz hier beschriebenen Modifikation der Co-Kultur Versuchsbedingungen wäre ein nächster Schritt, um die Funktionen der daraus resultierenden Konstrukte zu verbessern und zu generieren nonthrombogenic, robust sein und konform arteriellen Konstrukt ähnlich nativen Arterien.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Hyaluronsäure-Natriumsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 100-CV </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 005-CV </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum-Lösung </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 004-CI </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek optimale Schnittqualität Temperatur Verbindung, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomeric pgs scaffolds in arterial tissue engineering

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind eine der führenden Todesursachen in den USA und vor allem, erhöht koronarer Herzkrankheit mit einer alternden Bevölkerung und der steigenden Fettleibigkeit 1. Derzeit Bypass-Operation unter Verwendung von autologen Gefäßen, Allografts und synthetische Transplantate werden als gemeinhin für arterielle Ersatzstoffe verwendet 2 bekannt. Allerdings haben diese Transplantate begrenzte Anwendungen bei einem inneren Durchmesser von Arterien weniger als 6 mm aufgrund der geringen Verfügbarkeit, thrombotischen Komplikationen, Compliance mismatch, und am späten Intimahyperplasie 3,4 ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat das Tissue Engineering erfolgreich als eine vielversprechende Alternative zu kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte, die nonthrombogenic, robust und konform sind zu entwickeln angewendet. Mehrere frühere Studien haben kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit Tri-Lamellenstruktur, ausgezeichnete mechanische Eigenschaften und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 5,6 entwickelt. Während eine hohe Zugfestigkeit und Berstdruck durch die Erhöhung die Produktion von Kollagen aus einem starren Material oder Zellrasen Gerüst, diese Konstrukte immer noch niedrigen Elastin Produktions-und Compliance, die ein großes Problem für Transplantatversagen nach der Implantation zu verursachen. Angesichts dieser Probleme stellten wir die Hypothese, dass eine elastomere Biomaterial mit mechanischer Klimaanlage kombiniert würden Elastizität bieten und führen mechanische Signale effizienter zu vaskulären Zellen, die extrazelluläre Matrix Produktion zu erhöhen und die Unterstützung zelluläre Orientierung. Das Ziel dieses Berichts ist es, eine Herstellungstechnik von porösen röhrenförmigen Gerüsten und einer dynamisch-mechanischen Konditionierung ihrer Anwendung auf arterielle Tissue Engineering vorstellen. Wir haben ein biologisch abbaubares Elastomer, Poly (Glycerin sebacat) (PGS) 7 zur Herstellung von porösen röhrenförmigen Gerüsten aus dem Salz Fusion-Methode. Adult primäre Pavian glatten Muskelzellen (SMC) wurden auf das Lumen von Gerüsten, die in unserem konzipiert pulsatilen Fluss Bioreaktor für 3 Wochen kultiviert ausgesät. PGS Gerüste hatte konstante Dicke und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren. Mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor unterstützt SMC Orientierung und verbesserte ECM-Produktion in Gerüsten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass elastomere Gerüste und mechanische Aufbereitung der Bioreaktor Kultur kann eine Erfolg versprechende Methode für die arterielle Tissue Engineering werden.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Elastomer-PGS Gerüste mit vaskulären glatten Muskelzellen in einem pulsatilen Fluss Bioreaktor kultiviert kann, um vielversprechende kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit nativen ECM-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum Kultur führen.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

elastomeric-pgs-scaffolds-in-arterial-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Elastomer-PGS Gerüste mit vaskulären glatten Muskelzellen in einem pulsatilen Fluss Bioreaktor kultiviert kann, um vielversprechende kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit nativen ECM-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum Kultur führen.

Serie: Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Forschung

Biotechnik

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

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Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering