Die Autoren bedanken sich bei Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) für seine technische Unterstützung danken zu Bioreaktoren und den Bioreaktor Inkubator entwickeln.

1. Dezellularisierung der BioVaSc <ol><li> Spülen Sie das Gefäßsystem des Schweine Jejunalsegment via Kanüle arteriellen Zugang und Darmlumen mit PBS -. Wiederholen, bis es ganz sauber ist. </li><li> Bereiten Sie eine 200 mm Durchmesser Glasbehälter mit 4 Adaptern und verbinden sie über Silikonschläuche an den Schlauchpumpe (Ismatec). Die Drucksteuereinheit kann über einen Drucksensor, der in ein steriles Einweghaube (siehe Fig. 1) verbunden ist, überwacht werden. </li><li> Füllen Vorratsflaschen mit Dezellularisierung (DZ) Lösung und überprüfen Sie die Schlauchsystem für mögliche Luftblasen. </li><li> Schließen Sie die Darmlumen mit Kabelbindern an den Glas Anschlüsse für Lumenfluss. Pumpe 500 ml DZ Lösung in die roten arteriellen Zugang (1B) des Gefäßsystems. Unterbrechen Sie den Pumpvorgang alle 15 Minuten kurz manuell drücken Sie die gesamte Darmlumen. </li><li> Während der decellularizati100 mm Hg, nach dem natürlichen Vorbild Blutdruck - auf Verfahren, sollte der Druck der Pufferlösung zwischen 80 sein. </li><li> Waschen Sie die BioVaSc mit PBS - bis es frei ist von Zellreste (&quot;ganz weiß&quot;). </li><li> Füllen Sie den BioVaSc vollständig mit der DZ-Lösung und Inkubation in DZ Lösung tauchen über Nacht bei 4 ° C auf Schüttler. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.6. </li><li> Legen Sie die BioVaSc in DNase-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf Schüttler. </li><li> DNase-Lösung entfernen und spülen mit Waschpuffer. </li><li> γ-Sterilisation mit 25 kGy </li></ol> 2. Die verschiedenen Zelltypen 2.1 Isolation von primären humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (MVECs) und Fibroblasten <ol><li> Schneiden Hautbiopsie (vorzugsweise preputium) in Streifen von 2 - 3 mm Breite mit Skalpell und spülen Sie sie mit PBS 3x - Lösung. </li><li> Decken Sie das Gewebe mit Dispase-Lösung, Inkubation es für 16-18 h bei 4 ° C. </li><li> Separate Epidermis von der Dermis mit 2 Pinzetten und übertragen sowohl getrennt in Petrischalen mit PBS + gefüllt. </li><li> Rinse Dermis Streifen 1x mit Versene. </li><li> 10 ml Trypsin / EDTA-Lösung in die Dermis Streifen und bebrüten es im Brutschrank für 40 min. </li><li> Stoppen Sie die Enzymreaktion sofort mit 1% FCS. </li><li> Übertragen Hautstreifen in eine Petrischale mit VascuLife gefüllt und auskratzen jeden Streifen mit dem Skalpell 8x jeder Seite, mit ein wenig Druck. </li><li> Übertragen des hergestellten Zellsuspension über eine Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen und spülen Zellsieb 3x mit VascuLife. </li><li> Zentrifugieren bei 1.200 xg für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets mit VascuLife. </li><li> Um die Fibroblasten zu isolieren, Streifen hacken Dermis in kleine Stücke mit dem Skalpell. </li><li> 10 ml Kollagenase-Lösung zur Lederstücke. </li><li> Inkubieren Sie es für 45 Minuten in den Inkubator, dann zentrifugiert und es vorsichtig supernatant. </li><li> Waschen Pellet 1x mit DMEM + 10% FCS +% PenStrep, Zentrifuge und es vorsichtig Stand. </li><li> Das Pellet in Kulturmedium und überträgt es auf einer T75 Kulturflasche, damit Zellen aus dem Gewebe zu wachsen. </li></ol> 2.2 Tumorzelllinie S462 Die Tumorzelllinie S462 (freundlicherweise von Dr. Nikola Holtkamp, ​​Charité Universitätsmedizin Berlin zur Verfügung gestellt) wurde aus einer malignen peripheren Nervenscheidentumor eines weiblichen Patienten mit der erblichen Veranlagung Tumor-Syndrom Neurofibromatose Typ 1 9 erzeugt. S462 werden in DMEM mit 10% FCS kultiviert. Medium muss alle 2 geändert werden - 3 Werktagen. Einmal in der Woche müssen die Zellen aufgeteilt werden. 3. Tumor-Testsystem: Statische Kulturbedingungen im Vergleich mit Dynamic Kultur Im Bioreaktor-Systeme <ol><li> Schneiden Sie die Rohr SIS-Muc öffnen auf der einen Seite und befestigen Sie es zwischen zwei Metallringe (Zell Kronen, 10 mm Durchmesser, selbst constructed). Decken Sie die SIS-Muc in Zellkulturmedium über Nacht. </li><li> Seed isolierte Zellen in definierten Zellzahlen (siehe unten) auf einer oder beiden Seiten des SIS (mono-oder Co-Kultur-Set-up). <ol><li> Samen 8.000 Zellen / cm 2 Primär MVECs in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l auf der basolateralen Oberfläche der SIS (früher Serosa). 3 Stunden später die gut mit Medium füllen, um eine Kultur eingetaucht zu gewährleisten. </li><li> Ermöglichen Endothelzellen für 3 Tage haften. Klappen Sie den statischen Kultursystem um 180 ° und übertragen sie auf eine 12-Well-Platte. </li><li> Samen eine Mischung von primären Hautfibroblasten (8.000 Zellen / cm 2) und Tumorzellen (15.000 Zellen / cm 2) in einem Gesamtvolumen von 500 &amp;mgr; l auf der apikalen Oberfläche des SIS (die Seite des ehemaligen Lumen). </li><li> Lassen Zellen für 3 Stunden halten und füllen die gut mit Medium (Kultur eingetaucht, mittel: 50% Vasculife + 50% DMEM mit 10% FCS). </li><li> Der Tumor-Testsystem wird unter statischen Bedingungen kultiviert eint 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für weitere 14 Tage. Ändern Kulturmedium alle 2 - 3 Tage. </li></ol></li><li> Für die dynamische Kultur, fixieren Sie die SIS-Muc zwischen zwei Metallringe und Saatgut Primär MVECs wie in 3.2.1 beschrieben. Nach 3 Tagen entfernen Sie die SIS-Muc von den Metallringen und legen Sie die Membran in den Strömungsreaktor (siehe 2C und 2D). Anwenden der primären Hautfibroblasten und Tumorzellen mit einer Spritze und Kanüle auf die Matrix im Bioreaktor und damit die Zellen für 3 h halten vor dem Füllen des Bioreaktorsystems mit Kulturmedium. </li><li> Am folgenden Tag dynamischen Kulturbedingungen mit konstanter Mediumstrom (3,8 ml / min, 37 ° C und 5% CO 2) eingeleitet werden. Die dynamische Kultur wird 14 Tage gehalten wird Kulturmedium nach 7 Tagen gewechselt. </li><li> Der dynamische Test-Setup ist in einer selbstgebauten Inkubator, Medienfluss bietet durch eine Pumpe und die notwendige Temperatur und CO 2 kultiviert </sub&gt; Inhalt. </li></ol> 4. Charakterisierungsmethoden für die Analyse 4.1 Fixierung und Paraffineinbettung der geimpften kollagene Matrix <ol><li> Für (Immun-) histologische Charakterisierungen entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren das Gewebe mit 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie 4% Paraformaldehyd und übertragen Sie die SIS von der Metalleinsatz zu einer Einbettung von Gewebekassette. Gießen Sie das Gewebe verbleibenden Fixiermittel zu entfernen und zu entwässern für Paraffin-Infiltration. </li><li> Vor dem Einbetten in einem Paraffinblock, schneiden Sie die SIS in 2 - 3 Scheiben und legen Sie sie in einem Paraffin-gefüllte Metallsockel Form, so dass die Schnittflächen nach unten zeigen. Fügen Sie die Gewebekassette auf der Form als Unterlage. </li><li> Cut 5 um Scheiben und schweben sie auf einem 40 ° C warmen Wasserbad zum Richten, dann montieren Dias auf Glasobjektträger geeignet. Unbeschichtete Objektträger sind für H &amp; E Flecken verwendet, Polylysin-beschichtete Objektträger für immunhistologische Färbung, um die Befestigung zu verbessern.Lassen Scheiben gründlich trocknen. </li><li> Melt Paraffin, entfernen Sie sie mit Xylol und deinen Durst Scheiben für folgende Färbung. </li></ol> 4.2 Färbung <ol><li> Die rehydriert Scheiben mit Hämatoxylin / Eosin als standardisierte Übersichtsfärbung gefärbt werden. </li><li> Für immunhistologische Färbung der fixierten und in Paraffin-Gewebeschnitten infiltriert muss eine Antigen-Retrieval, damit Antikörper zu erkennen und auf ihre spezifischen Epitope binden zu unterziehen. Daher entparaffiniert und rehydratisiert Träger werden in einem Dampfkochtopf mit beheizten Citratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten platziert. </li><li> Objektträger Waschpuffer (0,5 M TBS-Puffer + 0,5% Tween) und Kreisscheiben mit einem PAP Stift um das erforderliche Volumen für Färbelösungen minimieren. </li><li> Legen Sie die Folie in einer Feuchtekammer. Um einen bestimmten Meerrettich-Peroxidase vermittelten Visualisierung der Antigen-Antikörper-Bindung zu garantieren, muss die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid gesättigt ist. </li><li> Primäre antibOdy Verdünnungen werden auf die Scheiben aufgetragen, 1 h bei RT inkubiert und mit Waschpuffer sorgfältig abgewaschen. </li><li> Zum Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung der Ultra Vision Absicherung Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) wird entsprechend der empfohlenen Protokoll verwendet. </li><li> Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin für 1 min gegengefärbt. </li><li> Objektträger werden mit einem wässrigen Medium angeordnet, getrocknet und aufgenommen mit einer inversen Mikroskop. </li></ol>

<ol>
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Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Beim Vergleich von 2D-und 3D-Kultursysteme in der Tumorforschung, 3D-Systemen, obwohl die teurer Ansatz, haben sich die Bedingungen in den biologischen Mikroumgebungen besser zu imitieren. Es konnte gezeigt werden, dass einige Tumorzellen wachsen in einem 3D-Kultur sehr viel langsamer als in einem gemeinsamen 2D-Kultur 12, die in Übereinstimmung mit der Situation in einer realen Tumor ist. Bissell und Mitarbeiter zeigten in ihrer Arbeit, dass das Verhalten von krebserregenden Brustzellen spiegelt die Situation in vivo, einschließlich der Zellmorphologie und-Meldung, genauer, wenn ein 3D-Kultur in einer Matrix bietet Zell-ECM-Interaktionen. Außerdem wies sie die Bedeutung der extrazellulären Umgebung in 3D durch den Nachweis, dass Änderungen in den Umweltwechsel führte zur Reversion der malignen Zellen mit einem normalen Phänotyp. Außerdem und vor allem sind diese Ergebnisse auch in in vivo Tiermodellen 10,11 bestätigt werden. NHALT &quot;&gt; Der direkte Vergleich der in vivo-Tierversuchen und in vitro Gewebemodellen zeigt Vor-und Nachteile beider Systeme. Ein Vorteil der in-vitro-Modellen ist die Erlaubnis von einem viel besseren Echtzeit-oder Fest Bildgebung durch Mikroskopie. Eine Einschränkung ist, dass sie imitieren statische oder Kurzzeit-Bedingungen, während in vivo-Systemen oft die Fortschritte. Der derzeitige Mangel an Gefäßsystem und normalen Transport von kleinen Molekülen, Host-Immunantworten und andere Zell-Zell-Interaktionen sind weitere Nachteile der In-vitro-Modelle 12. Daher 3D In-vitro-Systeme, wie in dieser Studie vorge bieten eine vielversprechende Ergänzung zu Tierversuchen. Sie bieten eine bessere Vergleichbarkeit für den menschlichen Organismus und somit die Minimierung der experimentellen Fehlinterpretationen. Biomimetic in vivo Modellsystemen wird damit an Relevanz zu untersuchen, wie Krebs und Metastasierung ist abhängig auf Mikroumgebungsbedingungen, die tumorig regulierenenesis 11. Unsere Studie zeigt, dass die 3D-Umgebung durch die SIS-Muc vorgesehen führt zu einer tumorartigen Gewebebildung von Zellen, die nicht in den gängigen 2D-Zellkultur zu beobachten ist (siehe Abbildung 3A). Darüber hinaus ist die Verwendung von primären Zellen aus Tumorbiopsien abgeleitet ein sehr wichtiger Schritt in Richtung personalisierte Medizin, einer Disziplin, die bei der Ermittlung der besten Behandlung je nach individuellen Bedürfnissen des Patienten zum Ziel hat. Die Einbeziehung primären Patienten-spezifischen Tumorzellen aus Biopsiematerial isoliert werden In-vitro-Prüfung von Therapiestrategien zu ermöglichen. Solche Testsysteme machen es möglich, verschiedene Medikamente und Kombinationen davon, in einer Zeit-und kostensparende Hochdurchsatz-Screening zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Integration von Tumor-assoziierten Stromazellen wie in dieser Studie gezeigt, wichtig für den personalisierten Ansatz, da Einflüsse Mikroumgebung eines Tumors Tumorprogression 13 und könnte als geei beweisenle therapeutisches Ziel. Alternativ zu einer personalisierten Ansatz können unsere Tumor-Modell geändert werden, um als eine verallgemeinerte Tumortestsystem durch den Einbau von etablierten Zelllinien tumorigen zu dienen. Dies ist eine vielversprechende Anpassung der Grundlagenforschung Zwecke. Sowohl für Drogentests nähert sich das Vorhandensein einer Gefäßstruktur ist erforderlich, um die Verteilung und Aufnahme von therapeutischen Substanzen testen. Das SIS-Muc-Matrix ermöglicht die basolateralen Impfen mit primären MVEC für barriereAufnahmeStudien wird die Nachsaat der erhaltenen Gefäßstrukturen des BioVaSc weiteren Verbesserung der Untersuchung von Drug Delivery. Um Gewebemodelle zu erstellen, kann ein 3D-biologisch abbaubare Matrix als Rahmen für eine Co-Kultur von verschiedenen Zelltypen, 14 verwendet werden. Die Verwendung eines solchen 3D-Matrices wird oft durch das Fehlen eines funktionellen Gefäß beschränkt. Dieses Problem kann durch die Verwendung des BioVaSc, die erhaltenen Blutgefäß str bietet gelöst werdenuctures, die mit Endothelzellen reseeded werden kann. Weiterhin stellt die BioVaSc extrazellulären Komponenten, die die Adhäsion der Zellen zu gewährleisten und die Gewebedifferenzierung. Es ermöglicht auch die Langzeit-Gewebe-spezifische Funktion der 3D-Gewebe bioartifizielles 7,8,15. Voraussetzung für das Engineering von funktionellen Gefäßersatz ist die Nachahmung der menschlichen physiologischen und biomechanischen Bedingungen. Daher Bioreaktorsysteme, die diese Anforderungen in vitro umsetzen können, sind von großem Interesse für die Erstellung der biologischen Tumormodellen. Die Kombination der BioVaSc ist die Bioreaktortechnologie und Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen eine sehr vielversprechende Methode zur vaskularisierten Tumor-Gewebe, das für die Untersuchung der Tumorprogression wie Angiogenese und Metastasierung relevante Mechanismen erlauben erzeugen. Wir sehen, wie Tumormodellen als vielversprechender Ansatz zur Ergänzung von Tierstudien, die eine gleichwertigedas menschliche Tumorphysiologie.

Neue Arzneimittel müssen in Bezug auf ihre Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit vor der Zulassung überprüft werden. Bis heute sind Tierversuche die Standardmethode für Drogentests und Validierung. Jedoch aufgrund speziesspezifische Unterschiede, Tierversuche häufig nicht umfassend Bewertung der Wirkung der Verbindungen bei Menschen 1. Aus diesem Grund ist es wichtig, die menschliche Gewebemodelle, die für die in-vitro-Tests von neuen Arzneimitteln und Substanzen verwendet werden können, zu erzeugen. Einer der Schwerpunkte unserer Gruppe ist die Schaffung von in-vitro-Testmodellen mit unseren biologischen vaskularisierten Gerüst (BioVaSc) 2,3. Die BioVaSc können als statische oder dynamische 3D-Matrixsystem verwendet werden. Für statische Kultur, ist die Schweine dezellularisiertes Jejunalsegment (Dünndarmsubmukosa SIS-Muc) in einem Metalleinsatz für die Zell Nachsaat platziert. Verschiedene Zellen, wie Krebszellen und Endothelzellen auf dem Gerüst gezüchtet werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Für dynamische Kultur, die BioVaSc einen Bioreaktor-System, das Fluss durch das Gefäßsystem oder über die Oberfläche des Gerüsts gilt angebracht. Strom Bioreaktoren implementieren biologische, mechanische oder elektrische Stimuli, die auf der Differenzierung oder Proliferation von Zellen 4 handeln. Für Bioreaktoren im Bereich des Tissue Engineering, ist das Grundkonzept, um die Bedingungen im menschlichen Körper simuliert. Wobei werden Zellen bereitgestellt eine natürliche Umgebung, in der sie miteinander und mit den sie umgebenden extrazellulären Matrix interagieren können. Zur Herstellung von in vitro-Testsystemen oder Transplantate, ist die Fähigkeit, die natürliche Umgebung der Zellen mit einem geeigneten Trägerstruktur und Bioreaktorsystem nachahmen kritisch 5. Daher müssen immer komplexer und technisch anspruchsvoller Geräte, um diese Aufgaben zu erfüllen, 6 entwickelt werden. Weiterhin ist es möglich, unsere Gerüst für die establ verwendenAuffüllung eines vaskularisierten Modell aufgrund der erhaltenen röhrenförmige Strukturen, die die zuführende Arterie, Vene, und das Verbindungs ​​Kapillarbett enthalten. Alle Schweine-Zellen benötigen, um durch chemische, mechanische und enzymatische Dezellularisierung entfernt werden, und das Gerüst gamma-sterilisiert. Die wiederhergestellten Rohr vaskulären Strukturen können anschließend mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter Verwendung eines Rückführ Perfusionsbioreaktorsystem 7, welche die biomechanischen und / oder biochemische Parameter, wie pH-Wert, Temperatur, Druck, Nährstoffversorgung und Entsorgung 6 nachahmt impft werden. Die Reendothelialisierung der rohrförmigen Strukturen schafft eine menschliche Blutgefäßäquivalent im kollagenen Gerüst 3,7. In dem folgenden Schritt, kann die Oberfläche der früheren Lumen (Mucosa) mit primären humanen Zellen besiedelt werden, um Co-Kulturen 3,7,8 herzustellen. In dieser Studie wurde ein 3D-Tumortestsystem wird durch Co-Kultivieren einer Tumorzelllinie mit primären st eingestelltRomals Zellen unter statischen und dynamischen Bedingungen auf der SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Krebs ist eine der führenden Todesursachen weltweit. Aktuelle Therapiestrategien werden überwiegend in 2D-Kultur-Systeme, die physiologischen Bedingungen in vivo unzureichend widerspiegeln entwickelt. Biologische Zellen 3D-Matrices bieten ein Umfeld, in dem die Zellen können sich selbst organisieren, so dass die Untersuchung der Gewebeorganisation und der Zelldifferenzierung. Solche Gerüste können mit einem Gemisch aus verschiedenen Zelltypen, direkte 3D-Zell-Zell-Interaktionen zu studieren ausgesät werden. Um das 3D-Komplexität von Krebstumoren zu imitieren, hat unsere Gruppe ein 3D in vitro Tumortestsystem entwickelt. Unsere 3D-Gewebetestsystem-Modelle der in vivo Situation von malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs), die wir mit unseren dezellularisiertes Schweine Jejunalsegment abgeleiteten biologischen vaskularisierten Gerüst (BioVaSc) gegründet. In unserem Modell reseeded wir eine modifizierte BioVaSc Matrix mit primären Fibroblasten, mikrovaskulären Endothelzellen (MVECs) und die S462-Tumorzelllinie. Für statische Kultur, wird die Gefäßstruktur des BioVaSc entfernt und die verbleibende Gerüst auf einer Seite offen (Dünndarmsubmukosa SIS-Muc) geschnitten. Die resultierende Matrix wird dann zwischen zwei Metallringen (Zell Kronen) befestigt. Eine weitere Option ist es, die Zellkultur ausgesät SIS-Muc in einem Strömungsbioreaktorsystem, das die Zellen Scherbelastung aussetzt. Hier wird der Bioreaktor eine peristaltische Pumpe in einem selbstgebauten Inkubator verbunden. Ein Computer steuert die arterielle Sauerstoff-und Nährstoffzufuhr über Parameter wie Blutdruck, Temperatur und Volumenstrom. Dieser Aufbau ermöglicht eine dynamische Kultur entweder mit druckregulierten pulsierende oder Konstantstrom. In dieser Studie konnten wir erfolgreich sowohl eine statische als auch dynamische 3D-Kultursystem für MPNSTs herzustellen. Die Fähigkeit, Krebstumore in einer natürlicheren 3D-Umgebung zu modellieren wird die Entdeckung, Erprobung und Validierung zu ermöglichenZukunft Pharmazeutika in einem Menschen-ähnliches Modell.

Wie in Fig. 1B gezeigt ist, wir die dezellularisierte Schweine Jejunalsegment (ca. 2 m Länge und 20 mm Durchmesser) mit erhaltenen röhrenförmigen Strukturen des kapillaren Netzwerk. Nach der chemischen, enzymatischen und mechanischen Dezellularisierung, erhalten wir eine Kollagen I / III-Gerüst, die für 3D-Zellkultur verwendet werden können. Ein Feulgen-Test wurde durchgeführt, um die Reinheit (keine DNA-Resten) der Matrix (Daten nicht gezeigt) zeigen. 2A und 2B zeigen die statische Kultur der SIS-Muc von den Zell Kronen gesichert. Wir setzten die SIS-Muc in einer in-house entwickelt Bioreaktor (2C) für die dynamische Kultur. 2D stellt die simulierten dynamischen Strom durch die Kammer des Bioreaktors. Der Bioreaktor wird in einem selbstgebauten Inkubator System angeordnet und mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist. Dieser Aufbau ermöglicht eine dynamische Kultur entweder mit druckregulierten pulsierenden Fluss oder c<html> onstant Fluss. Figur 3 gibt einen Überblick über den statisch kultivierten S462 Tumorzelllinie in der 2D-Mono (3A) und in 3D Cokultur (3B-3D). 3B zeigt die dreifache Kultur von Tumorzellen und Fibroblasten S462 auf der apikalen Seite des SIS -Muc (ehemaliger Innenlumen Seite) und MVEC auf der basolateralen Seite (ehemaliger Serosaseite). Die Identifizierung der verschiedenen Zelltypen ist durch Färbung Zelltyp-spezifischen Markern, wie z. B. von Willebrand-Faktor zu MVEC (3C) Beschriftung möglich. Die p53-positiven Zellen S462 aus den p53-negativen primären Fibroblasten (Fig. 3D) und die 3D-Verteilung der Zellen können analysiert werden unterschieden werden. 4 zeigt Färbungen entspricht Fig. 3 der dynamisch kultivierten Triple Kultur. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Dezellularisierung Set-up. (A) Bioreaktor und Pumpen Set-up für die Dezellularisieren BioVaSc von einem PC überwacht. (B) Dezellularisierte BioVaSc in Glasbehälter. Das Lumen und die arterielle Einlass sind an den Adapter angeschlossen ist. . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> 2. In Hinblick auf die verschiedenen Kultur-Set-ups. (A) CAD-Schnittansicht der statischen Kultursystem in Mikrotiter-Well-Platte, (B) Metalleinsätze für statische Kultur, (C) mittlere Strömungssimulation (Geschwindigkeitsfeld [m / s]) für die dynamische Kultur der obere Deckel des Strömungs Bioreaktor , (D) Durchfluss Bioreaktor für die dynamische Kultur in die Schlauchpumpe verbunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Fig. 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> 3. Übersicht über die immunhistologische Charakterisierung der statischen 3D-Tumormodell. (A) Hämatoxylin-Färbung der statisch kultivierten 2D-Monokultur S462 Zellen auf einem Permanox Rutsche, (B) H &amp; E-Färbung der statisch kultivierten 3D-Dreifach-Kultur, markieren Pfeile Endothelzellen, (C) immunhistologische Färbung für von-Willebrand-Faktor, (D ) immunhistologischen Färbung für p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 4. Übersicht über die immunhistologische Charakterisierung der dynamischen 3D-Tumormodell. (A) H &amp; E-Färbung der dynamisch kultivierten 3D-Dreifach-Kultur, Pfeile markieren Endothelzellen, (B) immunhistologische Färbung für von-Willebrand-Faktor, (C) immunhistologischen Färbung für p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a>

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.2K Aufrufe.  University Hospital Würzburg.  Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren. 

Serie: Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

System mit vertikal V-Kurven zu zwingen: eine 3D In-vitro- Bewertung der elastisch und starr rechteckigen Bögen

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...