Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Medien Vorbereitung ANMERKUNG: Das Protokoll beruht auf der Verwendung einer Mischung aus zwei getrennten Medien: DMEM / F12 mit modifizierten N2 Ergänzung und Neurobasalmedium mit B27 Ergänzung ergänzt ergänzt, typischerweise in einem 1: 1 Verhältnis. <ol><li> Bereiten Sie die modifizierte N2 Ergänzung durch Vermischen der Komponenten in einem 15-ml-Tube. Nicht vortexen oder filtern diese; mischen durch Umdrehen des Röhrchens, bis die Lösung klar ist. <ol><li> Starten Sie durch Pipettieren von 7,2 ml DMEM / F12, dann fügen Sie 1 ml 25 mg / ml Insulin (in 0,01 M HCl hergestellt) und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Es dauert ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist. </li><li> 1 ml 100 mg / ml Apo-Transferrin (in Wasser), 33 ul 0,6 mg / ml progesternone (in Ethanol bildete), 100 ul 160 mg / ml (1 M) Putrescin (in Wasser bildete ), 10 ul 3 mM Natriumselenit (in Wasser) und 666 &amp; mgr; l 7,5% Rinderserumalbumin und mischen das Felgenbett. Aliquot in 2,5 ml und bei -20 °C für bis zu 2 Monate. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Medien. <ol><li> Zu 250 ml DMEM / F12 hinzufügen 2,5 ml N2. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter. </li><li> Zu 250 ml Neurobasal Medien 5 ml B27 Ergänzung. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter. </li><li> Mischen Sie die Medien aus den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 in einem Verhältnis 1: 1. In einigen Fällen ist eine 1: 3-Mix erforderlich sein (ergänzt als 1: 1-Mischung in Schritt 1.2.4). </li><li> Zu der Mischung hinzufügen 0,5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 0,2 mM) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 0,1 mM) und gut mischen ohne Schütteln. Lagern Sie das Material bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und vermeiden, um Licht. Diese Endmischung wird als N2B27. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Gelatine-Lösung. <ol><li> Eine 1% ige Gelatinelösung in Reinstwasser und Autoklaven bei 121 ° C, 15 psi, 15 Min. Es ist wichtig, daß die Flasche für diese verwendet wird, ist vollständig frei von Reinigungsmittel oder Desinfektionsmittel, so empfiehlt es sich, dass eine neue Flasche istdafür verwendet und wird immer nur in Reinstwasser zwischen Gebrauch gespült. Aliquot der 1% igen Lösung in 50 ml-Teilmengen und halten bei 4 ° C für Monate. </li><li> Erwärmen ein Aliquot von 1% Gelatine in einem 37 ° C warmen Wasserbad gelöst und in den 500 ml warmem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Gut mischen und pipettieren genug, um den Boden jeder Vertiefung oder Platte abzudecken. Ermöglichen die Gelatine, die Oberfläche für mindestens 30 min. </li></ol></li></ol> 2. Ausplattieren der Zellen Hinweis: Dieses Protokoll gilt auch für die Maus ESC in 10% Serum mit Leukämie (LIF), Serum-Ersatz mit LIF oder Serum-freien Medien mit LIF und bone morphogenetic protein 4 (BMP4) oder MEK und GSK3-Inhibitoren (2i Medien) gewachsen mit oder ohne LIF. Jedoch kann die Zeitsteuerung und die Effizienz der Differenzierung in Abhängigkeit von den Medien und Zellen (siehe Diskussion) variieren. Bei den hier gezeigten Experimenten verwendeten wir den 46C Maus ESC Linie (das hat eine EGFP Reporter klopfte in one der endogenen SOX1 Allele), in GMEM mit 10% Serum und LIF gewachsen. Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, dass die Zellen dissoziiert und im N2B27 Medien erneut plattiert; einfaches Ändern von Medien aus GMEM / Serum / LIF zu N2B27 führt immer zu einem reduzierten Differenzierung Effizienz im Vergleich zu Neubelegung der Zellen. <ol><li> Wachsen die Zellen in GMEM mit 10% Serum, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten / ml LIF 13. Um einen subkonfluenten Kultur der Maus ESC, Platte erhalten Sie 1 x 10 6 Zellen in einen T25-Kulturflasche, die stattfinden wird 2 - 3 Werktagen. </li><li> Beachten Zellen unter Hellfeld-Mikroskop. Wenn die Zellen subkonfluenten und bereit, Durchgang sind, spülen Sie sie zweimal in PBS. 1 ml der Zellabtrennungs Reagenz und zurück in den Inkubator für 2-5 min. Obwohl Trypsin und andere Enzyme können für Zelldissoziation verwendet werden, können sie eine negative Wirkung auf die Zellhaftung aufweisen, so dass die Beschichtungsdichten müssen sein adjusted. </li><li> Sobald die Zellen beginnen, von der Platte zu heben, tippen Sie auf das Schiff, um sie in eine Einzelzellsuspension zu entfernen. Sammle die Zellen in eine Gesamtmenge von 10 ml Medium und Zelldissoziation Reagenz und Pipette in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Dreh die Zellen bei 300 g für 3 min bei RT. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren und das Pellet in 10 ml vorgewärmtes N2B27 durch Auf- und Abpipettieren 3-5 mal. Beim Pipettieren der Suspension ab, Pipette gegen die Seite des Rohrs zu vermeiden, Blasen zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen, die mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer und Erfassung der Konzentration. </li><li> Bereiten Sie eine Zellsuspension, die die gewünschte Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit zu je Vertiefung in vorgewärmten N2B27 plattiert werden. Eine Dichte von 10.500 Zellen pro cm 2 in einer 6-Well-Platte (das heißt, 1 x 10 5 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte) ist optimal. Siehe Tabelle 1 für die vorgeschlagene Anzahl von Zellen pro cm 2 und plaTing Medienvolumina für eine Vielzahl von Zellkulturgefäßen. </li><li> Saugen Sie das Gelatine aus dem Kulturgefäß und Platte der Zellsuspension nach dem vorgeschlagenen Dichte und Volumen in der Tabelle 1. Wirbeln Sie nicht die Platten, da dies die Zellen an der Mitte zu konzentrieren. Zeigen die Kulturen in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie alle Medien 1 - 2 Tage durch Ersetzen alle Medien mit frischen N2B27. Pipette vorsichtig wie Spülen der Zellen könnte Dichte beeinflussen und verringern Differenzierung Effizienz in den folgenden Tagen. Wo anfänglichen Lebensfähigkeit nach der Beschichtung schlecht ist, die Platte der Zellen in einem 1: 3-Mix der N2 und B27-Medien ergänzt und geändert werden, um diese N2B27 nach den ersten beiden Tagen. Zellen beginnen zu differenzieren und sollte SOX1 Ausdruck innerhalb von 4 (durch grüne Fluoreszenz des Reporters in der 46C-Zelllinie verwendet werden, hier nicht sichtbar) zeigen - 6 Tage. </li></ol> 3. Immunfluoreszenzfärbung NEINTE: Das Protokoll kann auf jeden Schiffstyp angewandt werden. Das Volumen von jedem Reagenz pro Vertiefung von 6-Loch-Platte beschrieben und kann auf jede Oberfläche skaliert. Replattierung wird nicht aufgrund der geringen Rentabilität danach empfohlen. <ol><li> Entfernen Differenzierungsmedium und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd, lassen für 15 Minuten. </li><li> Waschen und Permeabilisierung der Zellen mit 2 ml PBS-T (phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,5% (v / v) Tween-20) zweimal. Zellen in PBS-T für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li><li> Ersetzen PBS-T mit 1 ml PBS-T mit 10% (v / v) Serum (von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper). Inkubiere 1 Stunde auf der Platte Wippe bei RT keine unspezifische Bindung zu blockieren. </li><li> Nach 1 Stunde, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS-T, und Inkubation in 500 ul Maus-IgG gegen βIII-Tubulin (verdünnt 1: 1000 in PBS-T mit 10% Serum). Setzen Sie auf dem Teller Wippe, und lassen Sie O / N bei 4 ° C. </li><li> Von diesem Schritt immer schützen das Gefäßvon Licht. Mit PBS-T wasche die Zellen zweimal, dann fügen 500 ul fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (2 &amp; mgr; g / ml in PBS-T mit 10% Serum, verdünnt). Legen Sie es auf dem Teller Wippe für 1 h bei RT. </li><li> Mit PBS-T Spülen Sie die Zellen zweimal, dann fügen Sie 500 ul DAPI (0,5 ug / ml verdünnt in PBS-T) und lassen Sie für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen erneut und halten sie in PBS-T. Zellen bereit sind, fotografiert zu werden und kann für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beachten Sie, dass GFP-Signal verblasst im Laufe der Zeit, so ist es unangemessen, GFP Intensität der festen und lebende Zellen oder von Zellen zu unterschiedlichen Zeiten fixiert zu vergleichen. </li></ol>

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	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. 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A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt 6 gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis. <p class="jove_conten...

Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues 1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs) in serumhaltigem Medium mit dem Morphogen Retinsäure 2-4 ergänzt. Seitdem wurde eine Vielzahl von Protokollen entwickelt, die neuronale Differenzierung 5 ermöglichen. Viele noch zu nutzen Aggregation, andere Co-Kultur mit Zelltypen induzieren und mehrere beinhalten die Verwendung von Serum-freien Medien. Alle Protokolle haben Vorteile einnd Nachteile und die genaue Art der neuronalen oder neuronalen Zellen produziert auch variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Protokoll. Die ideale Protokoll wäre robust, skalierbar und nutzen vollständig definierten Medien und Substrate, sei zugänglich nicht-invasive Überwachung des Differenzierungsprozesses und führen zu der Erzeugung von reinen Populationen von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage, durch externe Signale und zur Differenzierung strukturiert werden in allen neuronalen und glialen Subtypen mit hoher Effizienz und Ausbeute in einer relativ kurzen Zeit. In den letzten zehn Jahren haben wir mit Hilfe wurde ein Verfahren zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen und Neuronen aus Maus ESC in einer niedrigen Dichte, Serum-freien anhaftenden Monolayer-Kultur 6-10. Dieses Protokoll erfüllt viele der oben genannten Kriterien: in unseren Händen die Effizienz der Differenzierung hat ganz konsequent über viele Jahre und eine Vielzahl von Zelllinien wurde, kann nach oben oder unten skaliert werden (wir erfolgreich Schiffe aus Platten mit 96 Vertiefungen zu 15 cm Durchmesser dishes) und die verwendeten Medien sind gut definiert. Das Verfahren ist offen für Zeitraffermikroskopie zur Überwachung der Differenzierung und einer Vielzahl von Strukturierungs Signale hinzugefügt werden, um die Erzeugung von verschiedenen Typen von neuronalen Subtypen (zB Shh und Fgf8 für dopaminerge Neuronen 6) zu induzieren. Dennoch gibt es einige Probleme bezüglich der erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls. Einer der wichtigsten Aspekte ist eine sorgfältige Vorbereitung der Medien. Wir bereiten immer die Medien im Haus trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Alternativen. Eine der verwendeten Ergänzungsmittel (N2; siehe Protocol) hat Änderungen gegenüber dem handelsüblichen Fassungen. Schließlich ist einer der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens die optimale Zelldichte bei der Galvanisierung. Dies liegt hauptsächlich daran, während der autokrinen Natur eines der Induktion Signale (FGF4 11) erfordert, dass genügend Zellen vorhanden, um eine optimale viabil ermöglichen, sindkeit und Differenzierung, bei zu hohen Dichten Differenzierung (aufgrund autokrine Produktion von LIF 12 ggf. teilweise) beeinträchtigt. Es ist daher wichtig, dass die beiden Medienherstellung und Zell Plattierung sorgfältig durchgeführt und konstant, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstitute with sterile 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstitute with ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Bovine albumin fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukaemia inhibitory factor</td><td>prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &amp;beta;III tubulin IgG antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.

In diesem Experiment verwendeten wir den 46C-Zellinie 14, embryonalen Stammzellen der Maus mit einer endogenen SOX1-GFP-Reporter, um neuronale Differenzierung zu verfolgen. Durch die Nutzung dieser Zelllinie Expression von SOX1, ein Marker für neurale Vorläufer, kann durch grüne Fluoreszenz detektiert werden. Plattierungsdichte ist ein kritischer Faktor, um die neuronale Differenzierung zu erreichen. Embryonale Stammzellen der Maus wurden in 6-Well-Platte bei unterschiedlicher Dichte reicht von 10.500 bis ...

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K Aufrufe.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serie: Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologie

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neurowissenschaften

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures

Source: Wongpaiboonwattana, W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52823">Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture.</a> J. Vis. Exp.(2015)
The video demonstrates a protocol that uses serum-free media to generate neural progenitors from mouse embryonic stem cells. The desired concentration of embryonic stem cells, suspended in serum-free media, is plated on gelatin-coated coverslips. At an optimal cell density, cells produce autocrine signaling factors, which, along with the neural differentiation-inducing factors in the serum-free media, trigger the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.

Generierung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen in serumfreien Monolayer-Kulturen

1. Media Preparation
NOTE: The protocol relies on using a mix of two separate media: DMEM/F12 supplemented with modified N2 supplement and Neurobasal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://app.jove.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generierung kortikaler Interneuronen-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen der Maus

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...