Menschliche embryonale Stammzellen können induziert werden, um sich in neuronale Vorläuferzellen und anschließend in Neuronenastrozyten und Oligodendrozyten zu differenzieren. Die Typkulturmethode für menschliche embryonale Stammzellen und ihre Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen sind jedoch sehr ineffizient und offen in vivo Kokultursystem Hier präsentieren wir ein verbessertes und robustes Kultursystem, das mit einer hochdichten Einzelzellkultur mit menschlichen embryonalen Stammzellen leicht skalierbar ist. Die Einzelzelltypkultur menschlicher embryonaler Stammzellen bietet ein schnelles und effizientes System zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die mehrstufige Differenzierung entlang verschiedener und unterschiedlicher differenzierter Linien regulieren, einschließlich neuronaler Vorläuferzellen und ihrer anschließenden Differenzierung in zusätzliche neuronale Linien.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung menschlicher embryonaler Stammzellen qualifizierter Kellermembranmatrix-Beschichtete Platten. Die Kellermembranmatrixlösung bei vier Grad Celsius mindestens zwei bis drei Stunden oder über Nacht langsam auftauen. Beim Auftauen die Matrix in kaltem DMEM/F-12 bis 2% gut mischen und jeden Brunnen einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter der verdünnten Lösung beschichten.
Die beschichteten Platten bei Raumtemperatur mindestens drei Stunden oder bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Um die feederfreien Kulturen der Kolonie Typ H9 menschliche embryonale Stammzellen auf Kellermembranmatrix wachsen, aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen und waschen einmal mit einem Milliliter DPBS. Fügen Sie einen Milliliter Dispase-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.
Entfernen Sie die Dispase und waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Milliliter DMEM/F-12. Nach dem Waschen das Medium entfernen und jeweils zwei Milliliter DMEM/F-12 zu jedem Brunnen hinzufügen. Lösen Sie die Kolonien vorsichtig, indem Sie auf und ab pfeifen und in ein 15-Milliliter-Rohr übertragen.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für zwei Minuten. Aspirieren Sie das Medium. Dann dissoziieren Sie die Zellpellets in einzelne Zellen, indem Sie zwei Milliliter Zellablösung hinzufügen und sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren.
Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie die Ablösungslösung. Setzen Sie die Zellen in mTeSR-1 menschliches ESC-Medium durch sanftes Pipettieren nach oben und unten aus. Um die kolonientypisierten menschlichen embryonalen Stammzellen an eine einzelne Zelltypkultur anzupassen, platten etwa 1,5 bis zwei Millionen Zellen in jeden Brunnen der Kellermembranmatrix-beschichteten Platte in zwei Milliliter mTeSR-1 mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.
Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden ohne ROCK-Hemmer durch frischen mTeSR-1. Lassen Sie die Zellen drei Tage lang als Einzelzellentyp wachsen und das Medium täglich ändern. Am vierten Tag die Zellen in Ablösungslösung dissoziieren und wie zuvor beschrieben neu plattieren.
Nach dem Aufsetzen und Inkubieren der Zellen gemäß den Manuskriptanweisungen, übertragen Sie die kleinen embryonalen Körper auf ein 15-Milliliter-Rohr, lassen Sie sie sich auf den Boden setzen und entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette. Übertragen Sie sie in EB Medium und lassen Sie sie in Low Attachment Geschirr für sieben Tage zu erweitern. Um eine neuronale Vorläuferzelle oder NPC-Differenzierung zu induzieren, dissoziieren Sie die einzelnen zelligen menschlichen embryonalen Stammzellen mit einem Milliliter Ablösungslösung und inkubieren sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Zentrifugieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 370 mal g. Entfernen Sie den Ablösungslösungsüberstand. Setzen Sie dann die Zellen in DMEM/F-12 wieder aus.
Die Zellen auf einer Kellermembranmatrix mit einer Dichte von zwei mal 10 bis fünf Zellen pro Brunnen in zwei Milliliterm mTeSR-1 mit 10 mikromolarem ROCK-Inhibitor beschichtet. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Kulturmedium durch ein neuronales Induktionsmedium, ergänzt durch ein Mikromolar Dorsomorphin und fünf Mikromolar SB431542. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag während der ersten vier Tage der neuronalen Induktion, dann jeden Tag, bis der Zusammenfluss an Tag sieben erreicht ist.
Nach sieben Tagen neuronaler Induktion dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter Ablösungslösung hinzufügen und sie 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 370 mal g und entfernen Sie die Ablösungslösung Überstand. Fügen Sie einen Milliliter NPC-Erweiterungsmedium hinzu und pipetten Sie die Zellen vorsichtig nach oben und unten, um sie wieder aufzuhängen.
Dann Platte ein mal 10 bis die fünften Zellen pro Brunnen in zwei Milliliter NPC-Ausdehnungsmedium auf der Kellermembran Matrix beschichtet sechs-Well-Platten. Durchfluss der Zellen bei Bedarf, wenn Kulturen 90% Konfluenz erreichen, die 10 mikromolareN ROCK-Inhibitoren während der ersten drei bis vier Passagen hinzufügen. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag während der Erweiterung.
Zur Herstellung von PLO-Laminin-beschichteten Platten die PLO-Lagerlösung in PBS oder Wasser auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen, gut mischen und dann jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einem Milliliter der Lösung beschichten. Die Teller mindestens zwei Stunden bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen mit PBS und sofort nach dem Beschichten jeden Brunnen mit einem Milliliter Laminin-Lösung nach den Manuskriptrichtungen vorbereitet.
Bewahren Sie die Teller bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius auf. Um NPCs in dopaminerge Neuronen zu differenzieren, die Zellen in PLO-Laminin-beschichteten Schalen in NPC-Erweiterungsmedium mit einer Dichte von ca. 50% nach 24 Stunden zu verschichten, das Medium auf DA1 zu ändern und das Medium danach jeden zweiten Tag zu ändern. Um Kulturen zu durchdringen, wenn sie die Koninfluenza erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Ablösungslösung und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Zentrifugieren Sie sie dann bei 370 mal g und entfernen Sie die Ablösungslösung Überstand. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter DA1-Medium und Platte ein mal 10 bis fünf In zwei Milliliter Medium auf den PLO-Laminin-beschichteten Sechs-Brunnen-Platten aus. Um die NPCs in Astrozyten zu differenzieren, die Zellen auf den PLO-Lamininplatten und dem NPC-Ausdehnungsmedium mit einer Dichte von 50 % zu verplatten, verändern Sie das Medium zu das Astrozytenmedium nach 24 Stunden und durchgehen die Zellen wie zuvor beschrieben.
Als die menschlichen embryonalen Stammzellen des Kolonietyps an die Einzelzelltypkultur angepasst wurden, wurde festgestellt, dass die Zellen mit hoher Dichte gehalten und dann leicht und effizient subkultiviert werden konnten, wenn die Konfluenz erreicht wurde. Diese Zellen behielten die Zellzykluseigenschaften bei, die typisch für menschliche embryonale Stammzellen vom Kolonietyp sind, wie z. B. eine kurze G1-Phase und ein hoher Zellanteil in der S-Phase. Quantitative PCR-Analysen bestätigten auch, dass sie ESC-Marker in Konzentrationen ausdrücken, die mit denen von Kolonie-Typ-Zellen vergleichbar sind.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einzelne menschliche embryonale Stammzellen embryonale Körper bilden konnten, die Zellen aus allen drei Keimschichten enthalten: Endoderm, Mesoderm und Ektoderm. Es wurde dann gezeigt, dass einzelne zelllige menschliche embryonale Stammzellen effizient in NPCs differenziert wurden, wie durch den Verlust der typischen menschlichen embryonalen Stammzellmorphologie und das Auftreten der NPC-Morphologie angezeigt. Die Differenzierung wurde durch die erhöhte Expression von Signatur-NPC-Markern unterstützt und durch Immunfärbung und FACS-Analyse bestätigt.
Die gleiche Analyse zeigte auch, dass mehr als 90% der Zellen positiv für SOX1, PAX6 und NCAM-Proteine gefärbt wurden. Darüber hinaus konnten sich die abgeleiteten NPCs in dopaminerge Neuronen und Astrozyten differenzieren, wie durch das Auftreten charakteristischer Morphologien und die Expression von linienspezifischen Markern angezeigt. Bei diesem Versuch ist es wichtig, die menschlichen embryonalen Stammzellen mit hoher Dichte zu plattieren, um eine gesunde, undifferenzierte menschliche embryonale Stammzellkultur zu erhalten.
Dieses Protokoll bietet eine Plattform für die einfache, robuste und skalierbare Produktion von Vorläufer und differenzierter Zelle, die für grundlegende Studien, Arzneimittel-Screen und Anwendung in der neurodegenerativen Medizin skalierbar sein wird.
