Die Autoren danken Dr. Greg Martin (Cornell University) und seine Gruppe für die Bereitstellung der DC3000 Stammes-, Tomaten-Samen, und Ratschläge danken. Sie möchte auch danken Dr. Zhonglin für Hilfe bei der DAB-Protokoll und der Proteomics Division bei UF Interdisziplinäres Zentrum für Biotechnologische Forschung für die Unterstützung bei der Methodenentwicklung Mou. Das Protokoll für Protein-Extraktion wurde von Tanaka Hurkman und 16 modifiziert. Das Protokoll über cysTMT Kennzeichnung, die Schritte 4 bis 6 wurde basierend auf dem ursprünglichen Thermo Fisher Scientific Pierce Produkthandbuch 17 angepasst. Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation (MCB 0818051 bis S Chen) gefördert.

1. Wachsende Sämlinge und Vorbereiten von Bakterien <ol><li> Sämlinge werden in Metromix 500 Boden-Gemisch (BWI ​​Gesellschaften) in einer Klimakammer (160 pmol Photonen m -2 s -1 mit einer Photoperiode von 8 Stunden Licht bei 22 ° C gekeimt und 16 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C für 1 Woche. Relative Luftfeuchtigkeit wurde auf 70% gesetzt. Sämlinge mit Leitungswasser bewässert wurden je nach Bedarf, um den Boden vor dem Austrocknen bewahren. </li><li> Zwei Sämlinge von ähnlicher Größe werden dann 4 &quot;Durchmesser Töpfe mit dem Metromix 500 Boden umgepflanzt und für weitere 3 Wochen in den gleichen Bedingungen wie 1.1. </li><li> Pseudomonas syringae (PST) wird zunächst T-streifig auf Kings B Medium (KBM) Platten (pro Liter: 20 g Proteosepepton, 0,1975 g MgSO 4, 1% Glycerin, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) gewachsen und für zwei Tage bei 28 ° C Eine einzelne Kolonie wird gesammelt, in 300μl Flüssigkeit vermischt Kings B Medium (20 g Proteosepepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 ml Glycerin, 10 ml 100x K 2 HPO 4 Lager (1,5 g K 2 HPO 4 in 10 ml H 2 O), und die Ausbreitung auf ein Kings B Medium Platte. Dies wird über Nacht bei 28 ° C kultiviert </li><li> Die Bakterien Inokulum wird durch Abkratzen der kultivierten Bakterien aus dem KBM Platte in 20 ml H 2 O. vorbereitet Eine OD 600 von 0,03 (~ 10 6 KBE / ml) wird in 1 l Impfung Puffer (10 mM MgCl 2 + 400 ul Silwett-70). Inokulationspuffer minus Bakterien wurde für die Kontroll-Lösung vorbereitet. </li></ol> 2. Inokulation von Tomaten mit Pst und H 2 O 2 Histochemische Stain <ol><li> Vier Wochen alten Pflanzen wurden durch Eintauchen in die oben Impflösung für 30 Sekunden inokuliert. Klare Plastiktüten wurden über die Pflanzen unmittelbar nach der Impfung gestellt. </li><li> 3&#39;-3 &#39;Diaminobenzidin (DAB) zu färben 11 hergestellt wurde (1 mg / ml DAB in H 2 O, pH 3,8 (HCl)) drei days vor zu verwenden, um vollständige Solubilisierung zu erreichen. Die Lösung wurde gerockt, um bei Raumtemperatur zu mischen. </li><li> Vierundzwanzig Stunden nach der Behandlung wurde der voll entfalteten Blätter entfernt, in DAB Fleck epidermalen Seite nach oben und Vakuum für 15 min infiltriert. Die Blätter wurden dann im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht gelegt für die Färbung. </li><li> Die Blätter wurden in 95% Ethanol für 10 min gekocht und dann gehalten in 75% Ethanol. </li></ol> 3. Protein Extraction <ol><li> Nach der Ernte wurden Tomatenblättern zu feinem Pulver mit flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel zermahlen. </li><li> Bei 0,5 g Gewebe, 1,25 ml hinzugefügt Tris pH 8,8 gepuffertem Phenol und 1,25 ml / 0,5 g Extraktionspuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M Saccharose), dann weiter Zerkleinerung für eine paar Minuten in Dunstabzug. </li><li> Übertragen Sie das Extrakt zu Oakridge Zentrifugenröhrchen (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) und agitieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifuge bei 5000 xgund 15 ° C für 10 min. Übertragen Sie die Top-Phenol-Phase in ein neues sauberes Röhrchen. </li><li> Zurück zum Extrahieren der wässrigen Phase mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert Puffer; agitieren auf einem Schüttler für 30 min. Zentrifugieren und überweisen Sie den Extrakt auf ein neues Falcon-Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal und überweisen Sie den Extrakt zu neuen Oakridge Rohr. </li><li> Man fällt Phenol extrahiert Proteine ​​durch Zugabe von 5 Volumina 0,1 M Ammoniumacetat in 100% Methanol (bei -20 ° C). Vortex und Inkubation bei -20 ° C zur Übernachtung. </li><li> Sammeln der Protein-Pellet durch Zentrifugation bei 20.000 × g, 4 ° C für 20 min. </li><li> Waschen des Pellets 2 Mal mit dem kalten 0,1 M Ammoniumacetat in Methanol und 2-mal mit 80% kaltem Aceton gewaschen. 1,5 ml kaltem 70% Ethanol zum Pellet-und aussetzen. Transfer zu einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen (USA Scientific) und Zentrifuge bei 14.000 rpm, 4 ° C für 20 min. Ethanol entfernen. </li><li> Trocknen Sie kurz das Pellet in einem SpeedVac Konzentrator und lösen sich in einem Protein extrMaßnahmen Puffer, zB ReadyPrep Protein Extraction Kit Reagenz 3 (8 M Harnstoff, 4% CHAPS, 40 mM Tris-Base, 2 M Thioharnstoff) (Bio-Rad). Zentrifuge bei 14.000 rpm und 20 ° C für 30 min, um ein Pellet zu bilden. Die überstehende Flüssigkeit. </li><li> Messen Sie die Protein-Konzentration mit Hilfe eines CB-X-Protein-Assay nach Angaben des Herstellers manuell (Geno-Technologie). </li></ol> 4. Probenvorbereitung und Peptidmarkierung mit cysTMTs <ol><li> Planen Proteinprobe in einer Konzentration von 2-5 g / ul. Hier verwenden wir 100 yg Protein für jedes Masse-Tag, 20 ul-50 ul-Proben. Für dieses Experiment wurden alle 6-Tags verwendet wurden. </li><li> In gleichen Volumen Alkylierung Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM Iodacetamid) an das Protein Probe, um die freie Thiolgruppe zu blockieren. Buffer sollte frisch zubereitet werden. Alkylierung bei 37 ° C für 1 Stunde durchgeführt. </li><li> Man fällt das Protein durch Zugabe von 1 ml kaltem 80% Aceton bei -20 ° C über Nacht. Pellet das Protein durch Zentrifugieren bei 14.000rpm, 4 ° C für 20 min. Waschen des Pellets 3 mal mit 80% Aceton Vortexen jeder Zeit. Entfernen Sie den Überstand und trocknen lassen, während auf Eis zu lüften. </li><li> Das Pellet in 50 ul Lysepuffer (6 M Harnstoff, 50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA). 0,5 ul 100 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) wird dann zugegeben, um die Disulfidbindungen durch Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur zu reduzieren. </li><li> Bereiten Tags durch Zugabe von 20 ul von Acetonitril an die Reagenzgläser, um die Tags zu lösen. Vortex und Spin nach unten. </li><li> Waschen Sie den zusätzlichen TCEP mit einem Microcon 3 kD liegen Zentrifugalfilter Gerät (Millipore). Dann werden 50 ul Probe auf Microcon 3 kD liegen Spalte und 50 ul Lysispuffer auf die Säule. Zentrifuge für 15 min bei 10.000 xg und 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt dreimal. Entfernen Sie die Spalte und schwenken in ein sauberes Röhrchen. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 1.000 xg und 4 ° C. </li><li> Prüfen Sie den pH-Wert. Falls erforderlich, den pH-Wert auf 7,0 bis 8,0 mit 1 M HCl. </li><li> Fügen Sie 5 ul der cysTMT-Reagenz zu jeder Probe (Der cysTMT Reagenzien-Kit bietet 20 uL Tags für bis zu 500 ug Protein. Diese Methode verwendet 100 ug Protein, deshalb verwenden wir ein Fünftel des Tags.). Um die Reaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. </li><li> Die Proben wurden mit Laemmli Probenpuffer (Bio-Rad) in einem Verhältnis von 1:1 kombiniert. </li></ol> 5. Entfernung von nicht reagierten Tag Probenfraktionierung <ol><li> Die Proben wurden 5 min gekocht und auf einem vorgefertigten 12% Polyacrylamidgel (Bio-Rad). Das Gel wurde dreimal in Intervallen von 5 Minuten mit gefilterter H 2 O gespült und mit Coomassie-Blue (Bio-Rad) für 1 Stunde. Das Gel wurde de-gefärbten über Nacht mit H 2 O. </li><li> Zwölf Fraktionen wurden von jeder Gelspur gesammelt. Die Fraktionen wurden durch Protein-Bande-Konzentrationen bestimmt. Die Fraktionen wurden in 1 mm Stücke geschnitten und gesammelt in ein 1,5 ml Tube. </li><li> Die Gelstücke wurden de-gefärbten unter Verwendung von 50% Acetonitril und 0,1 M Ammoniumbicarbonat in H 2 </sub&gt; O. Dieser Schritt zu wiederholen, bis blaue Farbe Gelstücke (~ 3-4 mal, 15 min jeweils) entfernt wird. </li><li> De-gefärbten Gel Stücke wurden getrocknet unter Verwendung von 100% Acetonitril (Cover Gelstücke) für 15 min, Überstand entfernt, und die Stücke getrocknet unter Verwendung einer SpeedVac. </li><li> Man löst Trypsin (Promega) in 1:10 (Trypsin: Protein-Verhältnis) im gleichen Volumen (als gepoolte markierte Probe) von 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat. Zum Beispiel muss 600 ug Protein-Probe mit einem Volumen von 500 ul 60 ug Trypsin in 500 ul 25 mM Ammoniumbicarbonat aufgelöst. </li><li> Fügen Sie die Trypsin-Lösung für die Gel-Stücke und setzen auf Eis zu rehydrieren. Wenn die Stücke nicht abgedeckt werden mit 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer. Nach Rehydratisierung bei 37 ° C für 12-16 h inkubiert. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit Proteinextrakt aus den inkubierten Proben. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion, und entfernen Sie alle verbleibenden Proteinverdaus durch Abdecken Gelstückchen mit 5% Ameisensäure, 50% Acetonitril .. Schütteln Gelstücke für 20 min bei Raumtemperatur temperatur. Den Überstand in den extrahierten Protein Probenröhrchen von 5,7. Diese Extraktion zweimal. Trocknen Sie die extrahierten Peptide mit der SpeedVac. </li></ol> 6. Probenanreicherung von cysTMT markierter Peptide <ol><li> Fügen Sie ein Gefälle von Anti-TMT Harz bis 0,5 ml Röhrchen für eine 50% Gülle. (Gradient wurde von Band-Konzentration im Gel Fraktionierung bestimmt. Wenn ein Bruchteil Kollektion besteht aus einem dunklen Band, mehr Harz benötigt wird. Fraktionen mit schwächere Banden benötigen weniger Harz, da es weniger Protein.) </li><li> Das Harz wird dann dreimal mit einem Säulenvolumen 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Fügen Sie 200 ul 1xTBS zu jeder Probe. Die Proben werden dann auf Anti-TMT Harz (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) zugegeben und gerührt bei Raumtemperatur für 2 Stunden durch Schwenken über Nacht bei 4 ° C, gefolgt </li><li> Probe in Spalte (dieRMO Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Waschen Sie jede Spalte dreimal mit 1x 200 ul TBS. Diese wird dann mit dreimaligem Waschen mit 0,05% CHAPS (gelöst in 1 × TBS) gefolgt. </li><li> Die Säule wird dann dreimal mit 4 M Harnstoff in 1x TBS gewaschen. Zweihundert Mikroliter H 2 O wird dann verwendet, um die Säule dreimal waschen. </li><li> Jede Probe wird dreimal mit 200 ul 50% Elutionspuffer (50% Acetonitril, 0,4% TFA) eluiert. </li><li> Die Proben werden dann in einem Vakuum-Konzentrator getrocknet. </li></ol> 7. Massenspektrometrie-Analyse <ol><li> Resuspendieren Sie die Proben in 12 ul von 3% Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure und injizieren 5 ul direkt auf ein Eksigent NanoLC-1D Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie-Säule (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptide wird auf der Proteopep II C18-Säule 75 um ID getrennt werden x 20 cm (New Ziel, USA) unter Verwendung eines 4-60% Gradienten (A: 3% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure, B: 97% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure Säure)bei 3 ul / min über 60 min. </li><li> Ein Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL-Massenspektrometer wurde verwendet, um Peptide mit Hilfe eines Top-2 zu erfassen x 3 Experiment, bestehend aus einstufige MS gefolgt von Erwerb von 3 MS / MS-Spektren mit einer höheren Energie-C-Trap-Dissoziation (HCD) Fragmentierung von 3 MS gefolgt / MS mit Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) für Protein-Identifizierung. Die Parameter in diesem Modus waren: Isolierung Breite: 3,0 m / z; Collision Energie: 50% (10% mit zwei Stufen). Nur doppelt-und dreifach geladene Peptide wurden zur Fragmentierung ausgewählt. Dynamische Ausschluss Parameter wurden eingestellt: Wiederholen count = 1; Wiederholen Dauer = 60; Ausschlussliste size = 500; Ausschluss Dauer = 28. Zielwerte sind wie folgt: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Ion Transferzeiten wurden auf 500 und 300 für FTMS für MS / MS (HCD) eingestellt. Zwei microscans wurden für HCD-Spektren erforderlich. </li></ol> 8. Datenbank-Suche und Quantifizierung <ol><li> Die erworbenen CID und HCD Daten waren einnalyzed mit Thermo Scientific Proteome Discoverer-Software 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) durch ein verzweigtes Workflow, der eine Reporter-Ionen-Quantizer (20 ppm Masse Toleranz von Fragmentionen) implementiert, um das Verhältnis zu quantifizieren. Ein eigenes Segment verarbeitet die MS 2-Spektren durch das Spektrum Selector, Spectrum Normalizer und Spectrum Grouper Knoten. </li><li> Die Daten wurden dann gegen die SEQUEST Suchmaschine durchsucht. Ein 20 ppm Masse Toleranz verwendet wurde. Statische Änderungen wurden an der cysTMT Reagenziensatz (304,18 Da) und dynamische Änderungen enthalten Phosphorylierung und Methioninoxidation (15,99 Da). Eine benutzerdefinierte Datenbank für Solanum lycopersicum komponiert wurde unter Verwendung von RNA-Daten (mit über 350.000 Einträgen aus Harvard University) 13 wurde in beiden Fällen verwendet. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Ein repräsentatives Bild einer Kontrolle Tomatenpflanze Blatt und einer Pseudomonas-infizierten Blatt istin 1 gezeigt. Ein Unterschied zwischen Kontrolle behandelt und Pseudomonas behandelten Blätter zu beobachten ist. Nachdem die Blätter entfernt werden und gefärbt mit DAB, die de-Färbung erlaubt die histochemische Färbung auf Anzeichen von ROS im Blattgewebe (Abbildung 2) zeigen. 2A ist repräsentativ für eine Kontrolle Blatt ohne Färbung. 2B ist repräsentativ eines Blattes mit Pseudomonas und positive Färbung für H 2 O 2-Produktion behandelt. Ein Beispiel für Proteome Entdecken Datenausgang einer differentiell Redox regulierte Protein wird in 3 gezeigt. Dieses Protein ist ein Protein bekannten Redox-regulierten Ferredoxin-1-14 und ist gezeigt worden, um eine Rolle in der Verteidigung gegen Pseudomonas syringae pv tomato 15 zu spielen. Peak-Intensität zwischen Steuerung und inokuliert Proben wird zur relativen Quantifizierung, die wesentliche Änderungen in ferredox aufwies, zu erhaltenin-1-Redox-Regulation (p &lt;0,05). Hochdruck-Peaks zeigen, dass dieses Protein in Reaktion auf das Pathogenbehandlung oxidiert wird. 4 ist ein Beispiel für Proteome Entdecken Datenausgang eines Proteins, das ähnliche Redoxregulation eines Proteins zwischen einem Steuerelement und inokulierte Probe aufweist. Peaks von ähnlicher Intensität auf das Vorliegen von Disulfidbindungen nicht durch eine Änderung in der Behandlung reguliert. Die Methode wird revolutionieren, wie Wissenschaftler Redox-Reaktion Cysteine ​​und Disulfide 10 zu erfassen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein repräsentatives Bild der inokulierten Tomatenblättern mit Control-Lösung (A) und Pseudomonas (B). &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein repräsentatives Bild der DAB-Färbung der beimpften Tomatenblättern mit Control-Lösung (A) und Pseudomonas (B). Blätter wurden unter Verwendung 3&#39;-3 &#39;Diaminobenzidin. Chlorophyll wurde aus Blättern durch Kochen in 95% Ethanol entfernt. Dunkle Färbung zeigt die Anwesenheit von H 2 O 2. Nur verlässt geimpft mit Bakterien Kultur zeigte dunkle Färbung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> 3. Ein Beispiel Proteome Entdecken Datenausgabe von Ferredoxin-1, differentiell Redox regulierte Protein 14. Peak-Intensität über jedem Peak wird zur absoluten Quantifizierung verwendet. Peak-Intensität zwischen Kontrolle und inokulierten Proben verwendet wird,um eine relative Quantifizierung durchführen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> 4. Ein Beispiel Proteome Entdecken Datenausgang eines Proteins, das ähnliche Peak-Intensität zwischen einer Steuerung und inokulierte Probe aufweist. Peaks von ähnlicher Intensität auf das Vorliegen von Disulfidbindungen nicht durch eine Änderung in der Behandlung reguliert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll gibt Auskunft über die Durchführung DAB-Färbung sowie cysTMT beschriftet Redox-Cystein-Quantifizierung. Diese Verfahren sind nützlich bei der Prüfung der Produktion von ROS sowie die Wirkung auf die Protein-Regulation bei Solanum lycopersicum mit Pseudomonas syringae wird geimpft. Die Methoden in diesem Protokoll vorgestellt bieten eine Möglichkeit, ROS in ganzen Blättern Proben untersuchen in einer Weise, die den geringsten Schaden an Blattgewebe verursacht. Das Markierungsverfahren bietet eine Möglichkeit, potentiell Redox regulierte Proteine ​​unter Verwendung eines Cystein Markierungsverfahren untersuchen. Dies ist vorteilhaft, wenn die Prüfung eines frühen Stadium der Stressreaktion. Verfahren wie Isotop-codierte Affinitäts-Tag (ICAT) und cysTMT in Prüfung potenzieller Redox regulierte Proteine ​​in biologischen Proben verwendet werden. ICAT ermöglicht die Kennzeichnung und Vergleich von zwei Proben 12. Beide Methoden kennzeichnen freie Cysteine ​​und kann für Protein quantific verwendet werdenation 10,12. Allerdings erlaubt die cysTMT Methode für einen Rückgang der experimentellen Variation sowie 10 Multiplexen. Die Anzahl der Tags zur Verfügung ermöglicht es den Forschern repliziert oder mehrere Proben in ihrem experimentellen Design gehören. Mit mehr Samples bietet das Potenzial für eine höhere Anzahl von Proteinen identifiziert. Ein großer Nachteil des cysTMT Technik ist, dass es die allgemeine Qualität von Protein-Identifizierung aufgrund der selektiven Anreicherung Schritte für cysTMT-markierten Peptiden (6,5-6,6) beeinträchtigt. Die Anzahl von Peptiden für die Identifizierung von Proteinen hängt weitgehend von der Anzahl der Cysteinreste in der Proteinsequenz. Dieses Problem kann erfolgen, indem ein Teil des tryptischen Probe vor der Anreicherung für die Massenspektrometrie Proteinidentifizierung überwunden werden. Aufgrund der Natur des experimentellen Designs als auch die Markierung Mechanismus, dass der cysTMT Verfahren verwendet, bestimmte Schritte kritisch. Bei der Durchführung von Prä-Proteinpitation und Pellet Waschungen (3.9) ist es wichtig, auf Eis gekühlt, um Protein-Abbau zu reduzieren halten. Während cysTMT Kennzeichnung, ist die Entfernung des Reduktionsmittels (4,6) wichtig, weil Proben Reverse Kennzeichnung unterziehen können. Umgekehrt Kennzeichnung ist möglich, wenn Reduktionsmittel in der Probe zurückbleibt. Wenn die Proben nach der Markierung reduziert werden, kann die cysTMT-Tag entfernt werden. Wenn die Etiketten auf die Proben hinzugefügt, so muss der pH-Wert geprüft (4.7), um eine optimale Kennzeichnung Wirksamkeit besitzen. Darüber hinaus ist die Datenanalyse abhängig, was von dem Forscher und dem ultimativen Ziel im Umgang mit dem Protokoll erforderlich. Es ist auch abhängig von der verwendeten Software, da jede Software unterschiedliche Algorithmen. Dieses Experiment verwendet Pathogen als Auslöser für eine verstärkte Produktion von reaktiven oxidativen Spezies in Tomaten, aber auch andere Redox geregelten Reaktionen kann entsprechend gemessen werden. Das experimentelle Design ist anpassbar an anderen pflanzlichen und tierischen Systemen. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> BWI Firmen </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep sequentielle Extraktion Kit Reagenz 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X-Protein-Assay </td><td> Geno-Technologie </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT Reagenzien </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli-Probenpuffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Coomassie (G-250-Färbung) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3 kD liegen Spalte </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobilisierte anti-TMT-Harz </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Zentrifugationssäule </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18-Säule </td><td> Neues Ziel </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1.2 Software </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge Zentrifugenröhrchen </td><td> Thermo Scientific Nalgene Unternehmen </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäß (2ml) </td><td> USA Scientific </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Fertigteil-Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom der Form </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT Bereicherung Kit </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Tomaten Stamm DC3000 verursacht nicht nur bakteriellen Krankheit in ipad Solanum lycopersicum sondern auch auf Brassica-Arten, ebenso wie von Arabidopsis thaliana, ein genetisch handhabbar Wirtspflanze 1,2. Die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Kotyledonen mit DC3000 inokulierten deutet auf eine Rolle von ROS bei der Modulation der nekrotischen Zelltod während bakterielle Erkrankung der Speck Tomate 3. Wasserstoffperoxid, eine Komponente von ROS, wird nach der Inokulation von Tomatenpflanzen mit Pseudomonas 3 hergestellt. Wasserstoffperoxid kann unter Verwendung eines histochemische Färbung 3&#39;-3 &#39;Diaminobenzidin (DAB) 4 werden. DAB-Färbung mit Wasserstoffperoxid reagiert, um einen braunen Flecken auf der Blattgewebe 4 zu erzeugen. ROS hat eine regulatorische Rolle des zellulären Redox-Milieu, das den Redox-Status bestimmter Proteine ​​5 ändern können. Cystein ist eine wichtige Aminosäure, empfindlich gegenüberRedox-Änderungen. Unter milden Oxidation, dient reversible Oxidation von Cystein-Sulfhydrylgruppen als Redox-Sensoren und Signalgeber, die eine Vielzahl von physiologischen Prozessen 6,7 regulieren. Tandem-Massen-Tag (TMT) Reagenzien ermöglichen gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen Multiplex in verschiedenen Proben mittels Tandem-Massenspektrometrie 8,9. Die Cystein-reaktiven TMT (cysTMT) Reagenzien ermöglichen selektive Markierung und relative Quantifizierung von Cystein enthaltenden Peptiden von bis zu sechs biologischen Proben. Jede isobare cysTMT-Tag weist die gleiche nominale übergeordneten Masse und aus einem Sulfhydryl-reaktiven Gruppe, einem MS-neutralen Abstandhalterarm und einen MS / MS-Reporter 10 zusammengesetzt. Nach der Markierung wurden die Proben unter Proteaseverdau. Die Cystein-markierten Peptiden angereichert mit einem Harz, das Anti-TMT-Antikörper ist. Während MS / MS-Analyse, eine Reihe von Reporter-Ionen (dh, 126-131 Da) im Bereich geringer Masse ergeben, die Informationen über die relative Quantifizierung.Der Workflow ist wirksam zur Reduzierung der Komplexität Probe, die Verbesserung der Dynamik und dem Studium Cystein-Modifikationen. Hier haben wir Redox-Proteomanalyse der Pst DC3000 behandelt Tomaten präsentieren (Rio Grande) verlässt mit cysTMT Technologie. Diese High-Throughput-Verfahren hat das Potenzial, zu studieren andere Redox-regulierten physiologischen Prozesse angewendet werden.

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Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Reaktive Sauerstoffspezies Niveau angehoben wird, wenn Zellen begegnen Stressbedingungen. Hier zeigen wir das Beispiel von 3&#39;-3 &#39;Diaminobenzidin-Färbung sowie cysTMT Kennzeichnung und Massenspektrometrie, um die Redox-Proteom im Profil<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Behandelt Tomatenblättern.

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Aufrufe.  University of Florida. Reaktive Sauerstoffspezies Niveau angehoben wird, wenn Zellen begegnen Stressbedingungen. Hier zeigen wir das Beispiel von 3'-3 'Diaminobenzidin-Färbung sowie cysTMT Kennzeichnung und Massenspektrometrie, um die Redox-Proteom im Profil Pseudomonas syringae Behandelt Tomatenblättern.

Serie: Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...