Diese Arbeit wurde von einem National Health &amp; Medical Research Centre (NHMRC) Projektförderung zu RM unterstützt

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren mit der Tierpflege und Ethikkommission der UNSW Australien eingehalten und wurden in Übereinstimmung mit dem National Health und Medical Research Council of Australia Vorschriften für Tierversuche durchgeführt. Alle Verfahren in diesem Protokoll sollte in Übereinstimmung mit den Anforderungen der einschlägigen Tierpflege und Ethik-Kommission durchgeführt werden. 1. Acetylcholinesterase histochemische Färbung <ol><li> Bereiten Sie die Acetylcholinesterase Reaktionsgemisch <ol><li> Add 290 mg Acetylthiocholiniodid zu 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer (PB). Mischen mit einem Magnetrührer bei 900 Umdrehungen pro Minute. </li><li> In 600 mg Glycin unter ständigem Rühren. </li><li> Werden langsam 420 mg Kupfersulfat zu der Reaktionsmischung unter kontinuierlichem Rühren, bis das Produkt vollständig gelöst ist. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Haut an der Tierkörper durch Einschnitte (durch Gewebe-Sharing erhalten)in die Haut eines perfundierten Ratte oder Maus, Greifen der Haut von der Hals-Bereich und ziehen zu ihren Füßen. Sicherzustellen, dass die Faszie bedeckt jeden Muskel wird entweder entfernt oder erheblich perforiert, um eine ausreichende Belichtung der Muskelfasern zu der Reaktionslösung zu gewährleisten. </li><li> Tauchen Sie den ganzen Körper oder Gliedmaßen von Interesse in der Reaktionsmischung und Inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Für 2 min in destilliertem Wasser waschen den Kadaver. Hinweis: In dieser Phase werden die Muskeln zeigen eine Blaufärbung und die motorischen Endplatten (MdEP) als weiße Punkte zu sehen. </li><li> Expose der Karkasse zu einer 10% Ammoniumsulfid-Lösung für 3-5 sec. Hinweis: Die Muskelfasern schnell braun werden und die Abgeordneten werden beobachtbare als schwarze Punkte gesprenkelt sein. Wenn die Reaktion tritt zu schnell, und die Muskelfasern zu dunkel, um zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern unterscheiden befleckt versuchen mit niedrigeren Konzentrationen von Ammoniumsulfid-Lösung (zB 5%) werden. Die Reaktionszeit, um das zu bekommenoptimalen Kontrast zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern variiert von einer Probe zur anderen. Daher ist es schwierig, die genaue Belichtungszeit an das Reagenz zu definieren. Die Reaktion sollte sorgfältig überwacht werden und angehalten, wenn der Kontrast als angemessen. </li><li> Zweimal Waschen der Karkasse unter Rühren in destilliertem Wasser und sanft pat den Kadaver trocken. </li><li> Fotografie sowohl die lateralen und medialen Aspekte der Extremität, sicherzustellen, dass die Mitglieder des Europäischen Parlaments für alle Muskeln von Interesse erfasst. </li></ol> 2. intramuskuläre Injektionen an den motorischen Endplatten <ol><li> Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher (die Verwendung von Mikropipetten mit abgestuften Kolben wird empfohlen). Mit Hilfe eines Binokular, brechen die Spitzen der Mikropipetten mit einer Pinzette, so daß der Innendurchmesser des Lumens des Mikropipette ist etwa 0,5 mm. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumenten verwendet werden frisch autoklaviert und thim OP-Bereich ist steril. </li><li> Füllen Sie die Mikropipetten mit Fluoro-Gold-(5% in destilliertem Wasser). </li><li> Induzieren anaesthetise im Tier in einer Induktionskammer, die mit Isofluoran (4% in O 2). Überprüfen Sie für Aufrichtungsreflexes und Gewährleistung ihrer Abwesenheit, bevor es von der Induktionskammer zu entfernen. Sichern Sie sich einen Nasenkegel über der Schnauze der Ratte und liefern Isofluoran (2% in O 2) zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Klemmen Sie das Tier Zehen und sanft berühren Auge des Tieres, um sicherzustellen, dass sowohl die Pedal Rückzug und die Hornhautreflexe sind nicht vorhanden. Anmerkung: Eine Mischung aus Ketamin und xylazil können ebenfalls verwendet werden (80 und 10 mg / kg, intraperitoneal geliefert). Ketamin ist ein Schedule 8 (&quot;Controlled&quot;) Arzneimittel und notwendigen Protokolle mit dem Kauf, Verwendung, Lagerung und Entsorgung der Droge verbunden müssen eingehalten werden. </li><li> Gelten Auge Schmiermittel Trocknung der Augen bei dem während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die targeted Gliedmaßen und die Verwendung Gaze, um die rasierte Fläche mit drei Wechsel scheuert von Chlorhexidin und 70% Alkoholtupfer. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich. </li><li> Legen Sie das Tier auf eine saubere Unterlage und positionieren Sie sie angemessen auf eine gute Anbindung an die gezielte Muskel (n) zu gewährleisten. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut über den gezielten Muskel weg von der zugrunde liegenden Muskulatur anzuheben und einen Einschnitt in der Haut mit chirurgische Scheren. Sicherzustellen, dass der Einschnitt ist groß genug, um den Muskel (n) von Interesse vollständig freizulegen. Stellen Sie sicher, dass es eine minimale Unterbrechung der Faszie. </li><li> Verwenden Sie die MEP Fotografien geistig transponieren die Position und Form des Bereichs MEP auf den Muskel (n). Hinweis: Eine feine Filzschreiber könnte helfen, die MEP-Region aus der Fotografie auf den Muskel (n) von Interesse zu reproduzieren. </li><li> Vielfache Injektionen entlang der vollen Länge des Bereichs MEP (für Fluor-Gold, 3 bis 4 Injektionen von 1-2 &amp; mgr; l jedes should ausreichen). Wischen Sie den Muskel (n), um Eindringen zu entfernen. </li><li> Bringen Sie die beiden Enden des eingeschnittenen Haut eng mit stumpfen Pinzette und schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern. Infiltrieren 0,1 ml Bupivacain (0,5% in Wasser) (oder andere Lokalanästhetika) entlang der gesamten Spanne der Wunde. </li><li> Drehen Sie den Narkosegerät aus und überwachen die Tier bis es vollständig aus der Narkose erholt. </li><li> Warten für 14 Tage zwischen der Verabreichung intramuskuläre Injektionen und die Perfusion der Tiere. </li></ol> 3. Perfusionen <ol><li> Verabreichung einer letalen Dosis von Pentobarbitonnatrium Lösung (zB Lethabarb; 150 mg / kg) dem Tier durch intraperitoneale Injektion. <ol><li> Das Tier genau zu überwachen, bis eine tiefe Ebene der Narkose erreicht ist, wie durch die Abwesenheit des Pedals Rückzug und den Corneareflexe bestätigt. </li></ol></li><li> Positionieren Sie das Tier auf dem Rücken auf einem Brett über einem Seziertisch gelegt perfusion Waschbecken. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut für die Basis des Brustbeins zu heben. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt mit einem Paar starken chirurgische Schere unmittelbar unter dem Brustbein und verwenden Sie dann die Zange zu greifen den Schwertfortsatz Knorpel des Brustbeins. Beim Halten des xiphoid Knorpel vergrössern Einschnitt auf beiden Seiten der Brusthöhle, vom Brustbein zu den Achseln. </li><li> Schneiden Sie die Blende, um das Herz freizulegen. <ol><li> Injizieren 0.ml Heparin direkt in die Spitze des Herzens, um die Koagulation des Blutes zu verhindern. </li><li> Schneiden die Spitze, um das Einführen einer Kanüle in die linke Herzkammer zu ermöglichen, und dann schnell zu klemmen die Kanüle an Ort und Stelle mit Hilfe eines Hämostatikums. </li><li> Einen Einschnitt in den rechten Vorhof mit einem Paar von einer feinen Schere und sofort beginnen die peristaltische Pumpe. Perfusion mit 0,1 M PB, bis die aus dem Atrium strömenden Flüssigkeit ist nahezu frei von Blut und die Farbe der Leber wird hellbraun. Dann Perfusion mit Lösungention von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB), bis der gesamte Körper des Tieres wird starr. </li></ol></li></ol> 4. Halsmark Dissection und Vorbereitung für die Histologie <ol><li> Legen Sie das Tierkörper auf seiner Unterleib. </li><li> Schneiden Sie die Haut auf die Körpermittellinie mit einem Skalpell und beziehen sie aus der Basis des Schädels, um das Niveau des Darmbein. </li><li> Messer durch und spiegeln die paravertebralen Muskeln, um die dorsalen Aspekt der Wirbelsäule freizulegen. </li><li> Identifizieren Sie die knöchernen Dornfortsatz des Atlas, der zweiten Halssegment (dh, C2), und entfernen Sie sie mit einem Paar von chirurgischen Knochenzangen oder Pinzetten, um den entsprechenden Basiswert Algan finden. <ol><li> Identifizieren Sie den rechten C2 root durch Färben mit einem permanenten Filzstift. </li><li> Nehmen Sie die nächste Wirbel einer nach dem anderen und markieren Sie die rechten dorsalen Wurzeln mit wechselnder Farbe (also C2, C4, C6 und C8 können in grün und C3 eingefärbt werden, C5, C7, T1 kann col seinODER-Verknüpfung in blau). </li></ol></li><li> Mit einem kleinen chirurgischen Nadel (beispielsweise 30 G Nadel) vorsichtig durchstechen die Dura, die die untere Ende des Rückenmarks. Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, heben Sie die Dura von der Schnur während der Bewegung der Nadel rostral um einen Längsschlitz zu machen. <ol><li> Spiegeln die Dura. </li></ol></li><li> Schneiden Sie das Rückenmark quer in Ein- oder Zweisegmentblöcken mit einem neuen Skalpellklinge. <ol><li> Lassen Sie die Rückenmarksegmente in situ und für jeden Block, sorgfältig einen kleinen Bezugsmarke auf der linken Seite jedes Blocks mit der Skalpellklinge in der Mitte zwischen zwei benachbarten Wurzeln. Sicherzustellen, dass die Bezugsmarkierung ist tief genug, durch das Gewebe, um von der ventralen Seite der Blöcke sichtbar. Machen Sie den Bezugsmarke in einem Winkel von etwa 45 ° und deutete entweder anterior oder posterior in Bezug auf Tieranatomie, um in der Orientierung der Gewebesegment folgende Dissektion unterstützen. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die einzelnen Blöcke in kleine, klar gekennzeichnet Flaschen, die eine Lösung von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB) und lassen bei RT O / N. </li><li> Übertragen Sie die Bausteine ​​in sauberen, deutlich etikettierten Flaschen, die eine Lösung von Saccharose (30% in 0,1 M PB) und halten bei 4 ° C für mindestens zwei Tage. </li><li> Legen Sie die Segmente in Kryo-Formen und bedeckte sie mit Gewebe Einfriermedium. Für Längs histologischen Präparat, orientieren Sie die Blöcke mit der dorsalen Seite nach oben und verwenden Sie die Bezugsmarke, um den Block in der Kryo-Formen zu orientieren. </li><li> Frieren Sie die Kryo-Formen bei -20 ° C und schneiden mit einem Kryostat in 50 &amp; mgr; m dicke Schnitte. Anmerkung: Die Abschnitte können direkt auf die Adhäsion von Objektträgern montiert werden und trocknen gelassen O / N. Alternativ können die Abschnitte in 48-Well-Platten mit 0,1 M PB gefüllt flotiert werden und anschließend mit Hilfe der Bezugsmarkierung, um die Gewebeschnitten auf den Objektträgern befestigt zu orientieren. </li></ol> 5. Lendenwirbelsäule Cord Dissection und Vorbereitung für die Histologie <ol><li> Legen Sie das Tierkörper auf dem Rücken. </li><li> Führen Sie ein Mittellinienschnitt entlang der Bauch des Tieres und entfernen Sie die Eingeweide. Sezieren die Muskeln der hinteren Bauchwand, den ventralen Seite der Wirbelsäule freizulegen. </li><li> Suchen Sie den Kurzschwanz-Rippe und die meisten der angrenzenden Wirbelkörper T13 T13, wo der ventralen Wurzel verlässt den Knochen. <ol><li> Nacheinander zu entfernen einen nach dem anderen der zwei oder drei Wirbel rostral T13 (dh, T12, T11 und, falls erforderlich, T10) mit feinen chirurgischen Knochenzangen, um die T13 ventralen Wurzel bis zu seiner Eintrittspunkt in der ventralen Aspekt der ventralen Kabel zu folgen und markieren Sie es mit einem permanenten Filzstift. </li><li> Von diesem Punkt an, wiederholen Sie den Vorgang, um den Ort der ventralen Wurzel Einstiegspunkte für L1, L2, L3, L4, L5, L6 und S1 zu identifizieren, mit wechselnder Farbe und färben sie. </li></ol></li><li> Gehen Sie genauso vor, wie in Abschnitt 4,5 bis 4,10 für lum beschriebenBar Rückenmark Dissektion. </li></ol>

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P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. 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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Intramuskulär Targeting und anschließende Rückübertragung von therapeutischen Transgenen zu den entsprechenden α-Motoneuronen zur experimentellen Behandlung von neuromuskulären Zustand ist keine neue Strategie. Zum Beispiel hat dieses Liefermethode wurde verwendet, um die neuromuskuläre Degeneration in verschiedenen Stadien des ALS Progression SOD1 Mäusen und Ratten 1,9-12 sowie in Mäusen mit SMA 13 verzögern. Obwohl vielversprechend, die Wirksamkeit dieser Gentherapie Szenarien begrenzt ...

Der Verlust der Kontrolle über willkürliche Bewegung, die von neurologischen Erkrankungen wie Motoneuronerkrankung führt und Spinal- als auch Duchenne Muskelatrophie ist eine schwächende Krankheit, die hohe und lang anhaltende Auswirkungen auf den Alltag der Betroffenen hat. Während des letzten Jahrzehnts, Forschungsanstrengungen zu stoppen oder zumindest zu verzögern die schädlichen Auswirkungen dieser neuromuskulären Erkrankungen ist eine Priorität für viele Ärzte und Wissenschaftler auf der ganzen Welt. In dieser Hinsicht ist die neueste Generation von Tiermodellen, die diese neuromuskulärer Krankheiten nachahmen war maßgeblich bei der Erlangung grundlegende Einsichten in die physiologischen Mechanismen, die der Entwicklung und Progression von diesen Bedingungen 1-13 Basiswert. Behandlung dieser neuromuskuläre Erkrankung ist ein direkter Zugriff auf das Rückenmark und durch Rückenmarks Injektionen 14,15 erreicht werden. Jüngste Fortschritte in der Gentherapie wurden ins Visier der quergestreiften Muskulatur des oberen undunteren Gliedmaßen Shuttle therapeutische Gene in die entsprechenden α-Motoneuronen, die innerhalb des Vorderhorns des Rückenmarks 1,9-13 befinden. Allerdings hat diese einst vielversprechende Strategie versäumt, den Ausgang dieser neurologischen Erkrankungen zu verbessern. Während es ist fair zu schließen, dass diese schlechte Ergebnisse könnte, zumindest teilweise auf die geringe Wirksamkeit dieser Schutz Gene sein, kann man die geringe Wirksamkeit dieser Gentransferverfahren nicht aus. Motor Endplatten (MEPs) sind spezialisierte Regionen der Skelett Muskelfasern, die von den Axonterminalen großer peripheren motorischen Fasern aus α-Motoneuronen Ursprung eingerückt sind. Zusammen bilden die peripheren Nervenfaserenden und die Abgeordneten bilden die neuromuskulären Synapse, dh der Ort, an dem synaptischen Impulse werden von der anterograde Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin ausgelöst. Wichtig ist, daß die Beziehung zwischen peripheren Nervenfasern und der MEPs bi-direclen, obwohl verschiedene Motoren sind für den Transport von Molekülen und Organellen in Richtung als auch weg von dem Neuron verantwortlich somata 16-18. Angesichts dieser anatomischen Erwägungen erscheinen die Abgeordneten, um die Ziele der Wahl für die Lieferung und anschließender retrograden Transport von genetischem Material in die entsprechenden motorischen Neuronen sein. In diesem Zusammenhang ist es nicht überraschend, dass der Erfolg der Motoneuronen Transduktion hängt stark von dem Abstand zwischen der intramuskulären Injektion von viralen Vektoren und MEPs 19-20 des Muskels. Überraschenderweise ist jedoch die genaue Lage der MEP Zonen an den Muskelfasern des Labor Ratte und Maus, die beiden Arten der Wahl, um neuromuskuläre Erkrankungen modellieren, die bis vor kurzem nicht möglich. Wir haben umfassende Karten der Region MEP für mehrere Vorderbein Muskeln bei der Ratte und der Maus 21-22 produziert. Vor kurzem haben wir die Einzelheiten der Organisation des MEP r gezeigtegion für mehrere Muskeln der Maus Hinterlauf 23 und wir sind derzeit die Analyse der Merkmale der Abgeordneten an der Ratte Hinterlauf. In unseren Händen hielt intramuskuläre Injektionen von retrograder Tracer auf die gesamten MEP Zonen in diesen Muskeln gerichtet zu mehr markierte Motoneuronen, die mehr Rückenmarksegmente spannt sind als bisher angenommen. Hier stellen wir das Protokoll, das in den letzten Jahren entwickelt worden ist, um den Standort der MEPs auf der äußeren Oberfläche als auch über die Tiefe der Hintergliedmaßen und Vorderbein Muskeln zeigen sowohl in der Maus und der Ratte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Krankheiten, die die Integrität des Rückenmarks Motoneuronen gehören zu den schwächenden neurologischen Erkrankungen. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Entwicklung der verschiedenen Tiermodellen dieser neuromuskulären Erkrankungen die wissenschaftliche Gemeinschaft mit anderen therapeutischen Szenarien bei Verzögerung oder Umkehren des Fortschreitens dieser Bedingungen ausgerichtet ist. Durch Ausnutzung des Rück Maschinen von Neuronen, wobei einer dieser Ansätze hat, um die Skelettmuskulatur um Shuttle therapeutische Gene in entsprechende Rückenmarksmotoneuronen zu zielen. Obwohl einmal vielversprechend, wurde der Erfolg einer solchen Gentransfer Ansatz der suboptimalen Anzahl der transduzierten Motoneuronen es bisher gezeigt, ergeben behindert. Motor Endplatten (MEP) sind hochspezialisierte Bereiche auf der Skelettmuskulatur, die in direktem Kontakt mit dem synaptischen Rückenmarks α Motoneuronen sind. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu beachten, dass, so weit die Bemühungen, retrogradTransfer von Genen in Motoneuronen wurden ohne Bezug auf die Lage der Region MEP in die gezielten Muskeln. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll 1), um die genaue Lage der Abgeordneten auf der Oberfläche der Skelettmuskulatur zu offenbaren und 2), diese Informationen zu verwenden, um die intramuskuläre Lieferung und anschließende optimale retrograden Transport von retrograde Tracer in Motoneuronen zu führen. Wir hoffen, dass die Ergebnisse aus diesen Experimenten Tracing in weiteren Studien zu untersuchen retrograden Transport von therapeutischen Genen, um Rückenmark Motoneuronen durch die Ausrichtung der Europaabgeordneten zu nutzen.

Acetylcholinesterase histochemische Färbung zeigt den Standort der motorischen Endplatten über die Breite der Muskeln. 1 zeigt die Ergebnisse einer solchen Färbung auf einem ganzen Rattenvorderbein durchgeführt. Es wird vorgeschlagen, um die Konzentration des Ammoniumsulfidlösung zu optimieren (z. B. 5-7% anstelle von 10%), wenn die nicht-spezifische Hintergrundfärbung auf die Muskelfasern zu sowie der Zeit wird die Probe in die Lösung eingetaucht trieben. 2 veranschauli...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Aufrufe.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Serie: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Endoskopische Endonasal Trans-sphenoidal Ansatz: Minimal-Invasive Chirurgie für Hypophysen Adenome

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Nicht-invasive Modulation und Robotik-Mapping von Motor Cortex im sich entwickelnden Gehirn

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...