This work was supported by the Dr. Werner Jackst&#228;dt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).

Tierversuche wurden mit Genehmigung der Regierung durchgeführt (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 und G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf), basierend auf NIH Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Herstellung von Pumpen miniosmotische <ol><li> In einer sterilen Umgebung (dh., Zellkultur Kapuze), erhalten Sie die Pumpe, Katheter, Strömungsmoderator, Gehirninfusionskanüle und die Distanzscheiben verwendet werden (Abbildung 1). </li><li> Zur Abgabe von Medikamenten direkt in die Herzkammern verwenden eine Abstandsscheibe, so daß nur die Spitze des Kanülennadel in Kontakt mit der Herzkammer. Halten Sie die Kanüle auf den Kopf mit einer Pinzette. Zwei Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff (CA) und die Einführung einer Distanzscheibe. </li><li> Verlassen die Kanüle auf eine flache Oberfläche nach oben weist, so daß der Kleber zwischen der Zwischenscheibe und die Kanüle trocknet. </li><li> Schneiden des Katheters in Abschnitte von etwa 2,5 cm. </li><li> Für each Pumpe, bereiten eine minimale von 300-350 ul der Lösung von Interesse, wie es benötigt wird, um die Pumpe somit alle Luft Extrudieren vollständig zu füllen, in der es um die Bildung von Luftblasen innerhalb des Katheters zu verhindern. Bubbles wird die Strömung von der behindern Lösung in das Gehirn. </li><li> Sorgfältig verbinden den Katheter zur Strömungsmoderator. </li><li> Mit einem 2-ml-Spritze auf die Nadel durch das Gehirn Infusionssatz vorgesehen ist, füllen Sie die Pumpe, bis eine kleine Menge der Lösung entweicht die Pumpe und verhindert Luftblasen im Inneren. </li><li> Den Fluss Moderator sorgfältig auszufüllen und Katheter Aufmerksamkeit auf alle Blasen im Inneren des Katheters restlichen verhindern. </li><li> Führen Sie den Durchfluss Moderator in der Pumpe. </li><li> Im gefüllten Zustand sorgfältig zusammen die Kanüle an dem Ende des Katheters. Wenn beobachtet wird, dass eine Blase gebildet Entfernen der Kanüle und sorgfältig Nachfüllen des Katheters mit Vehikel oder Arzneimittellösung und anschließend wieder einführen Kanüle. </li><li> Setzen Sie den pump in einem Behälter mit steriler Kochsalzlösung und lassen Sie ihn bei 37 ° CO / N. </li><li> Vor der Implantation prüfen für Blasenbildung. Falls erforderlich (dh., Blasen beobachtet werden) entfernen Sie die Kanüle und füllen Sie das Rohr. Schließen Sie die Kanüle. Dieses sollte nur wenige Mikroliter der Lösung erfolgen. </li></ol> 2. Die Implantation von miniosmotische Pumps Anmerkung: Für diese Versuche wurden Tiere mit 1% Isofluran (30% O 2, 70% N 2 O) anästhesiert. Jedoch, wenn diese nicht verfügbar ist, ist auch die Verwendung von intraperitoneale Injektionen von Anästhesie möglich 11. <ol><li> Suchen Sie das Tier in der stereotaktischen Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit einer Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Schneiden Sie das Fell über die erAnzeige entweder mit einer Schere oder einem Schermaschine. Geschnitten, so viel wie möglich, ohne die Haut zu beschädigen. </li><li> Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol und Desinfektionsmittel mit antibakterielle und fungizide Eigenschaften. </li><li> Mit einem Skalpell öffnen Sie eine 1 cm Inzision leicht nach rechts von der Mittellinie und setzen die Schädel. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen. Legen Sie ihn mit 70% Ethanol und gibt sie über den Schädel. Dies wird veran der Schädel, um zu trocknen. </li><li> Wenn der Schädel hat leichte Blutungen, verwenden Sie ein Ausbrenner, alle Blutungen Punkte zu beseitigen. Blut verhindert, dass die CA ordnungsgemäß Trocknen über den Knochen, wenn die Kanüle implantiert. </li><li> Verwenden Sie die stereotaktische Gerät an eine Markierung auf den Punkt des Schädels, wo die Kanüle wird implantiert werden zu machen. Ventrikuläre Infusionen auf der linken Hemisphäre Koordinaten -0.2 mm kaudal, 0,9 mm lateral zum Bregma (2A). </li><li> Vorsichtig bohren über den Schädel, einen Winkel von 45 °; Dies verhindert, dass der Bohrer versehentlich gehen in die brain. Mehrmals bohren für einige Sekunden und dann prüfen, wie tief das Loch. Stoppen Sie Bohren, sobald der Schädel wurde ausgedünnt, aber immer noch nicht vollständig durchdrungen. </li><li> Brechen Sie die Hirnhäute mit der Spitze einer sterilen Nadel bis zum vollen Zugriff auf das Gehirn erreicht. Do so sanft, so daß das Gehirn nicht beschädigt. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen. </li><li> Einführung einer geraden Pinzette unter der Haut des Tieres in einer von vorn nach kaudal. Verwenden Sie die Pinzette, um den Raum unter die Haut in den Rücken des Tieres, wo die Pumpe implantiert werden zu öffnen. Einführung der Pumpe in den Rücken des Tieres wobei der Katheter und die Kanüle Außenseite (2B). Die Pumpe wird in dieser Position verbleiben, bis sie entfernt und bildet nicht jede Art von Befestigung halten. </li><li> Vorsichtig vier kleinen Tropfen Klebstoff neben der Nadel in die Kanüle. </li><li> Die Nadel durch den Schädel vorsichtig einführen, ohne seitwärts bewegen. Halten Sie es in Position für 15-30 sec until die Kanüle vollständig gebunden (Abbildung 2C.1). Einmal im Ort, wird die Kanüle 2,5 mm in der dorso ventral zu erreichen, wenn eine Distanzscheibe verwendet wurde. Wenn sie richtig angebracht ist, wird die Kanüle in den Knochen befestigt ist, bis zum Ende des Experimentes bleiben. </li><li> Setzen Sie einen Finger auf die Registerkarte abnehmbar und dann mit der anderen Hand, die ihm der Hals mit einer Reihe von Scheren (Abbildung 2C.2) abgeschnitten. </li><li> Schließen Sie die Wunde auf der Haut mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-Jod-Lösung (PVP-I) oben auf der Wunde eine Infektion zu verhindern (2D). </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Operierten Tiere mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, legen. Halten Tiere, die mit der während der Zeit der Verabreichung des Arzneimittels Pumpen allein in ihre Käfige implantiert wurden. </li><li> Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li></ol> 3. Pumpe removal Hinweis: In der Regel das Experiment wird am Ende der Lieferzeit von der Pumpe erlaubt zu beenden, aber es ist möglich, die Pumpe, um Sekundär Experimente zu entfernen als Folgemaßnahme zu der Medikamentenabgabe. Um Trakt Tracer Injektionen tun, ist es daher notwendig, um die Pumpe zu entfernen. <ol><li> Legen Sie das Tier in der seterotactic Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Die Haut vorsichtig öffnen, indem durch den Einschnitt am Tag des Pumpenimplantation durchgeführt. </li><li> Mit einem chirurgischen Klammer Halten Sie die Kanüle und herausziehen. Es sollte leicht aus dem Schädel entfernt werden. Als sanfte Blutungen zu erwarten ist, stoppen, indem Sie ein Wattestäbchen und warten Sie 1-2 min. </li><li> Ziehen Sie die Pumpe durch den Katheter. Erlp es heraus, indem Sie sie, wodurch Druck über die Haut. </li><li> Schließen Sie die Wunde wieder mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-I. </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Nicht mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, setzen Sie operierten Tieren. Tiere, die Operation unterzogen haben können zusammengestellt werden. </li><li> Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li><li> Lassen Sie das Tier 10 Tage lang, bevor Sie mit Trakt Tracer-Injektion zu erholen. </li></ol> 4. Druck Tract Tracer Injection bei 45 ° Winkel auf der rechten Motor Cortex <ol><li> Legen Sie das Tier auf der stereotaktischen Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit einer Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Öffnen Sie die Kopfwunde. </li><li> Clehnen den Schädel mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen. </li><li> Einführung einer 5 &amp; mgr; l-Glasspritze (26S ga) auf der vertikalen Halterung des Gerätes. Sicherstellen, dass das untere Ende der Glashalter ist genau an der Haltestück. Die Spritze nicht zu weit darunter, da dann wird es unmöglich, sie auf 45 ° von der vertikalen Position zu bringen und führen die Injektion. </li><li> Richten Sie die Spritze direkt über Bregma und suchen Sie dann die gewünschten Koordinaten. Für eine Injektion an den motorischen Kortex Koordinaten: Punkt # 1: 0,5 mm rostral und 2,5 mm lateral bezüglich Bregma. Point # 2: 1,34 mm rostral, 2,5 mm lateral bezüglich Bregma. </li><li> Sobald Koordinaten lokalisiert wurden, zeigen ihre Position über den Schädel mit einem Marker mit einer dünnen Spitze. Machen Sie nur ein Punkt im Schädel wie überschüssige Tinte Mitteilung könnte verstecken das richtige Koordinaten. </li><li> Bohren Sie vorsichtig den Schädel hält den Bohrer bei 45 °. Wie in Schritt 2.8, überprüfen Sie die Schädel häufig, so dass es nicht vollständig perfum Schädigung des Gehirns durch den Bohrer zu vermeiden dampft. Verwenden Sie die Spitze einer Spritze, um sicherzustellen, dass alle Knochen entfernt wurde. </li><li> Laden 600 nl der Trakt Tracerverdünnung in die Spritze. </li><li> Einstellen der vertikalen Position um 45 ° in Richtung der rechten Seite des Tieres. Unter dem Mikroskop, legen Sie die Spitze der Spritzennadel direkt vor das Loch. </li><li> Bewegt es in der vertikalen Richtung um 1,5 mm. Lassen Sie die Nadel stabil in dieser Position für 30 Sekunden bis 1 Minute, bevor Sie Druckinjektionen. </li><li> Injizieren 300 nl Tracer Verdünnung in drei Stufen von 100 nl voneinander durch 30 Sekunden getrennt. Nach der letzten Injektion, lassen Sie die Spritze stabil für 30 Sekunden bis 1 Minute, um den Tracer aus dem Gehirn fließen zu vermeiden. </li><li> Ziehen Sie den Spritzen, verlagern sie über das zweite Loch, und wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit den verbleibenden 300 nl, die in der Spritze sind. </li><li> Nach der zweiten Injektion, entfernen Sie die Spritze und füllen Sie die Sie suchen zu schließennd mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-I. </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Nicht mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, setzen Sie operierten Tieren. Tiere, die Operation unterzogen haben können zusammengestellt werden. Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li><li> Damit die Tiere für 10 Tage vor der Tötung erholen. </li></ol> 5. Tract Tracer Beobachtung <ol><li> Betäuben das Tier vollständig pro Institutionsrichtlinien. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Perfusion der Tiere mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7) unter Standard-Protokolle 6. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und senden Sie fix durch O / N Eintauchen in 4% Paraformaldehyd. </li><li> Cryoprotect Gehirne in Saccharose bei 30%, bis die Köpfe sinken. Dann entfernen Sie die Gehirne und frieren sie um 10 Sek immersion in flüssigem Stickstoff. Halten Gehirne bei -80 ° C bis Abschnitten hergestellt werden. </li><li> Produzieren Abschnitte bei 20 &amp; mgr; m für die retrograde Trakt Tracer Analyse und bei 40 &amp; mgr; m für die anterograde Trakt Tracer Analyse durch Schneiden auf einem Kryostaten. </li></ol> Hinweis: FG markierten Neuronen als weiße Zellen unter UV-Lichtanregung beobachtet werden. BDA durch O / N Inkubation mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex und 3,3 Diaminobenzidin mit Zugabe von Nickel von 0,4% ermittelt, um den Kontrast der Fasern 6,7 zu erhöhen.

<ol>
	<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+protects+against+focal+cerebral+ischemia+via+mechanisms+involving+Usp14-dependent+REST+degradation.">MicroRNA-124 protects against focal cerebral ischemia via mechanisms involving Usp14-dependent REST degradation.</a> Acta Neuropathol. 126, 251-265 (2013).</li><li>Hoyo-Becerra, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Regulation+of+Depression-Associated+Genes+in+a+New+Mouse+Model+Mimicking+Interferon-alpha-Related+Depression+in+Hepatitis+C+Virus+Infection.">Rapid Regulation of Depression-Associated Genes in a New Mouse Model Mimicking Interferon-alpha-Related Depression in Hepatitis C Virus Infection.</a> Mol Neurobiol. , (2014).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, Unit 4.24 (2010).</li><li>Miao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+adiponectin+improves+neurobehavioral+outcomes+after+focal+cerebral+ischemia+in+aged+mice.">Overexpression of adiponectin improves neurobehavioral outcomes after focal cerebral ischemia in aged mice.</a> CNS Neurosci Ther. 19, 969-977 (2013).</li><li>Pellegrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+of+a+combined+strategy+using+erythropoietin+and+endothelial+progenitor+cells+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Therapeutic benefit of a combined strategy using erythropoietin and endothelial progenitor cells after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Neurol Res. 35, 937-947 (2013).</li><li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-acute+delivery+of+erythropoietin+induces+stroke+recovery+by+promoting+perilesional+tissue+remodelling+and+contralesional+pyramidal+tract+plasticity.">Post-acute delivery of erythropoietin induces stroke recovery by promoting perilesional tissue remodelling and contralesional pyramidal tract plasticity.</a> Brain. 134, 84-99 (2011).</li><li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+contralesional+corticobulbar+plasticity+and+functional+neurological+recovery+in+the+ischemic+brain.">Vascular endothelial growth factor induces contralesional corticobulbar plasticity and functional neurological recovery in the ischemic brain.</a> Acta Neuropathol. 123, 273-284 (2012).</li><li>Hermann, D. M., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+brain+remodelling+and+plasticity+for+stroke+recovery:+therapeutic+promise+and+potential+pitfalls+of+clinical+translation.">Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery: therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation.</a> Lancet Neurol. 11, 369-380 (2012).</li><li>Overman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ephrin-A5+in+axonal+sprouting,+recovery,+and+activity-dependent+plasticity+after+stroke.">A role for ephrin-A5 in axonal sprouting, recovery, and activity-dependent plasticity after stroke.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E2230-E2239 (2012).</li><li>Wolf, W. A., Martin, J. L., Kartje, G. L., Farrer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Fibroblast+Growth+Factor-2+as+a+Mediator+of+Amphetamine-Enhanced+Motor+Improvement+following+Stroke.">Evidence for Fibroblast Growth Factor-2 as a Mediator of Amphetamine-Enhanced Motor Improvement following Stroke.</a> PLoS One. 9, e108031 (2014).</li><li>Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intraperitoneal+injection+anesthesia+in+mice:+drugs,+dosages,+adverse+effects,+and+anesthesia+depth.">Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth.</a> Comp Med. 51, 443-456 (2001).</li></ol>

Produktion und Open-Access-Publikationsgebühren von DURECT Corporation, die die miniosmotische Pumpen in diesem Artikel verwendete produziert bereitgestellt.

Seit vielen Jahren hat die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Verletzungen auf die Entwicklung von neuroprotektiven Therapien, die das Überleben von Neuronen in der akuten Schlaganfallphase zu fördern Ziel konzentriert. Die große Mehrheit der Drogen-Therapien, die gefunden wurden, um wirksam in Nagetiermodellen gescheitert, wenn in die Klinik übersetzten. Gründe für diese Therapieversagen umfassen, sind jedoch nicht auf das Ausbleiben einer nachhaltigen Arzneimittelwirkungen, was zu persistierende funktionelle neurologische Erholung beschränkt. Es ist daher wichtig, Strategien zu fördern Gehirn Umbau auf längere Sicht zu entwickeln. Denn die Förderung der neuronalen Überlebens allein nicht ausreicht, um erfolgreich Schlaganfall Erholung zu ermöglichen, wie durch die große Anzahl von erfolglosen Neuroprotektion Studien vorgeschlagen, die Stimulation der neuronalen Plastizität sich jüngst großes Interesse auf dem Gebiet. Bedeutet für die Arzneimittelabgabe sind intraperitoneale Injektion, Schwanz intravaskuläre injection, Oberschenkel Injektion einzigen stereotaktische Injektion der Vektoren in das Gehirn und weiterhin konstante Lieferung von miniosmotische Pumpen. Letzteres kann eine systemische Verabreichung umfassen, wenn die Pumpe nicht über eine Kanüle oder die Orgel gerichtet werden können, wie wir für die Lieferung in das Gehirn gezeigt. Mit Ausnahme miniosmotische Pumpen und die Verwendung von viralen Vektoren, werden alle anderen Strategien schwankArzneimittelKonzentrationen induzieren. Für Langzeitexperimente somit wird es notwendig, um das Tier zum Druck des Empfangs häufige Injektionen vor. Die BBB erlegt erhebliches Hindernis für die Aufnahme in das Gehirn von Proteinen oder Medikamenten aus dem Blut, was zu der Notwendigkeit von großen Protein oder Medikamentendosierungen, um therapeutische Konzentrationen im Gehirn zu erreichen. Beispiels Pellegrini et al. (2013) geliefert rhEpo durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis entsprechend 75 IU / Tag für ein Tier von 30 g (750 IU / Tag für einen 300 g Ratte) 5. Zum Vergleich: Die gezielte Abgabe von RHEPo an das Gehirn es uns ermöglicht, eine viel geringere Dosis von 10 IE / Tag in unserer Studie für eine erfolgreiche Wiederherstellung nach Schlaganfall, die es uns ermöglicht, Rückgewinnung über einen großen Zeitskala zu einem festen Zinssatz von 0,25 &amp; mgr; l / h zu erzielen. In dieser Arbeit haben wir das Verfahren der Implantation von Minipumpen mit einer Kanüle an dem Schädel, um die Plastizität fördernde Protein rhEpo direkt in den Ventrikel zu liefern, so dass unter Umgehung der BBB verbunden ist. Durch dieses Verfahren gefördert rhEpo neurologische Erholung in einer Anzahl von Wegen, einschließlich der Verringerung der Infarktgröße, Verringerung des glialen Narbenbildung und die Induktion von Angiogenese. rhEpo gefördert neuronale Überleben und erhöhte Projektionen aus dem kontraläsionalen motorischen Kortex in Richtung der denervierten roten Kern und Gesichts Kernen. Der Austrieb der Fasern wurde durch Injektion der anterograde Trakt Tracer BDA in den motorischen Cortex (4A und 5A), offenbart. Eine funktionelle Entsprechung zu dem Sprießen der Fasern prdurch die Verbesserung der motorischen Fähigkeiten (5B) ovided. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der gleiche Ansatz für Trakt Tracerinjektion angewendet werden, um thalamo-kortikalen Verbindungen durch Injektion des retrograden Tracers FG-Darm-Trakt (6B) zu enthüllen werden. Bei der Herstellung des miniosmotische Pumpe ist es wichtig, den Zielpunkt und die Verwendung von Abstandhaltern zu betrachten. Wir verwenden ein Abstandhalter, um die Länge der Nadel um 0,5 mm, wie auf diese Weise die Spitze der Nadel in Kontakt mit der Herzkammer auf den angegebenen Koordinaten (-0,2 mm caudal zu reduzieren, 0,9 mm lateral 2,5 mm dorso ventral mit bezüglich Bregma). Jedoch, wenn tiefere Strukturen sind das Ziel der Forschung, dann werden keine Abstandshalter erforderlich. Ebenso, wenn eine externe Abgabestelle gewünscht (dh., Dem Kortex), dann mehrere Distanzscheiben erforderlich. Der Katheter muss lang genug sein, damit die Pumpe nicht zu nah an den Kopf, als sie Bewegungen des mou behindernse, aber auch nicht zu lange im implantierten Überlänge kann bewirken, dass der Katheter zu biegen, so dass die Gefahr der Kanüle Entfernung durch die natürliche Bewegung der Maus. Ein Abschnitt von 2 cm des Katheters liefert sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Beweglichkeit und Stabilität des Implantats (1 und 2). Inkubation der Pumpe bei 37 ° CO / N kann die Pumpe sofort zu starten Pumpen des Arzneimittels in das Gehirn im Augenblick der Implantation. Im miniosmotische Pumpenimplantation ist es entscheidend, sicherzustellen, daß der Schädel ist, bevor die Implantation der Kanüle getrocknet. Normalerweise Reinigung mit 70% Ethanol wird der Knochen, um zu trocknen zu induzieren, aber wenn kontinuierliche Blutungen gefunden wird, berührt den Schädel vorsichtig mit einem Ausbrenner vollständig trocknen. Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die Einführung der Nadel als vertikale und langsam wie möglich. Einmal in Position, und während der Klebstoff trocknet, indem die Finger auf der Oberseite der Kanüle verhindert, dass sie sich seitwärts bewegt over den Schädel. Besondere Sorgfalt sollte auf die Wunde und die Platzierung der Kanüle gegeben. Wichtig ist, daß der Schnitt nicht genau über der Mittellinie des Schädels, aber leicht zur rechten Seite durchgeführt. Beim Schließen der Wunde, wenn der Einschnitt an der Mittellinie gemacht, die Haut wird überdehnt werden, wodurch das Risiko von Wundöffnung zunimmt. Dem Schnitt leicht zu einer Seite ermöglicht die Nahtstellen, um weg von dem höchsten Teil der Kanüle ist. Als Folge wird es weniger Spannung auf die Nahtstellen und die Wunde wird richtig zu heilen. Die Tiere sollten nur in Käfigen gehalten werden und überprüft jeden Tag, besonders während der ersten 10-15 Tage nach der Implantation. Im Falle Wunddehiszenz haben Wunden so schnell wie möglich geschlossen werden. Wenn die Kanüle entfernt wird, oder das Tier stellt eine Infektion wurde das Experiment beendet. Reimplantation der Kanüle wird nicht empfohlen. Es ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Implantation ausreichende Mengen an Gewebe ad verwendenKLEBEND (nicht zu viel!), wie es verschlechtert die Knochen und erhöht das Risiko der Kanüle entfernen. Jedoch mit zu wenig Klebstoff wird auch die Kanüle bis auf die Knochen befestigt nicht halten. Die miniosmotische Pumpen können in einer breiten Vielfalt von Stoffen gelöste Arzneimittel tragen, wobei die einzige Einschränkung dieser daß das Lösungsmittel biokompatibel. Zusätzlich, da das Volumen klein ist (200 ul) bestimmt werden, ob die für das Experiment benötigte Konzentration ist geeignet und wird nicht Ausfällung innerhalb der Pumpe führen. Tract Verfolgung entweder mit anterograden oder retrograde Tracer ist eine sehr gut etablierte Technik zum Gehirn-Konnektivität und Plastizität zu untersuchen. Sorgfalt muss für die Verwendung der stereotaktischen Rahmen bei der Injektion, um die Genauigkeit über die Ausrichtung der Gehirnbereich zu studieren wünscht, einen Nutzen zieht (das heißt zur Injektion auf dem Balken zu verhindern, wenn das Einspritzen des Cortex). Für alle chirurgischen Eingriffe und um Schmerzen zu reduzieren undEntzündungen, sollten die Tiere mit 0,1 mg / kg Buprenorphin 4 mg / kg einmal täglich für drei Tage nach der Operation behandelt werden vor dem Eingriff und Caprofen. Abschließend bietet dieser Ansatz eine richtige Werkzeug für die Untersuchung Wirkung von Proteinen oder pharmakologische Verbindungen im verletzten Gehirn, die eine Methode, die gut für Studien über die Plastizität des Gehirns geeignet ist.

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7. 
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Alzet miniosmotic pump. Model 2004.</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">000298</td>
			<td style="width:183px;">Drug container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Brain infusion kit 3 1-3mm</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">0008851</td>
			<td>Drug brain delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">Loctite&#160; 454 Prism gel&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Loctite</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td style="width:183px;">Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">75N glass syringe&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">87900/00</td>
			<td>Injection of tract tracers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Biotin Dextran Amine (10000 MW)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;">N-7167</td>
			<td>Anterograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Fluorogold</td>
			<td style="width:115px;">Fluorochrome, LLC.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Retrograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
			<td style="width:115px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">53311</td>
			<td style="width:183px;">Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of miniosmotic pumps and delivery of tract tracers to study brain reorganization in pathophysiological conditions

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

Wir während 30 Tagen, beginnend 3 Tage nach der eingereichten Tieren bis 30 min der mittleren Hirnarterie durch den intraluminalen Fadenmethode Induktion einer Läsion in das linke Striatum und dann geliefert rhEpo direkt in das Gehirn durch miniosmotische Pumpen (Abbildung 1, Abbildung 3) Takt 6. 4 zeigt eine schematische Darstellung des cortico Spinaltraktes die nach CB und BDA Einspritzung und dem Bereich, wo Tracer injiziert verfolgt wurde. Wir zeigten eine Verbesserung der Greifkraft und Motorleistung (Abbildung 5) nach 14 und 42 Tagen nach der Lieferung bzw. rhEpo. Lieferung von BDA in die rechte Motorkortex von Tieren, die einen Anschlag auf der linken Striatum empfangen, zeigten einen Anstieg der motorischen Fasern Überqueren der Mittellinie auf dem Niveau des roten und Facialiskern (Figur 5), was zeigt, erfolgreich Anfärbung Sprießen Fasern eine Folge der pharmakologischen Behandlung mit miniosmotic-Pumpen. rhEpo Behandlung erhöhte auch das neuronale Überleben, verzögerte diffuse Astrozytose, verringert glialen Narbenbildung und eine erhöhte Angiogenese in der untersuchten Periode 6. Durch Verwendung dieser gleichen Technik für Trakt Tracerinjektion können wir erfolgreich Thalamuskernen die zum Cortex durch Injektion des retrograden Trakt Tracer FG (Figur 6) verbunden sind, zu detektieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figur 1. Bestandteile der miniosmotische Pumpe in diesem Protokoll verwendet. Die Distanzscheibe, Kanüle und entfernbaren Streifen, Katheter, Flußmoderator und miniosmotische Pumpe beobachtet werden. Der Aspekt der komplett montierten Pumpe kann in 2A gesehen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ithin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zusammenfassung der Pumpenimplantation wichtigsten Punkte. (A) Die Maus ist gezeigt, wie auf der stereotaktischen Vorrichtung mit dem vollständig aufgebauten miniosmotische Pumpe daneben angeordnet. Der Pfeil zeigt die zur Implantation ausgewählten Koordinaten. (B) Die Pumpe wurde an der Rückseite des Tieres eingeführt wurde und nur die Kanüle an der Außenseite bleibt. Der Schädel wurde bereits gebohrt. (C) Seiten des Kopfes nach der Implantation. (C.1) Die Kanüle ist auf Position aber die Registerkarte abnehmbare nicht geschnitten worden. (C.2) Die entfernbaren Streifen geschnitten wurde und das Nähen von Die Wunde kann nun beginnen. (D) Der Stern zeigt eine kürzlich implantierte Tier im Vergleich zu einem Tier 30 Tage nach der Implantation (#). Wenn es richtig untergebracht ist, sollte die Wunde geschlossen, bis zum Ende des Verfahrens bleiben, wie auf dem Bild gezeigt.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Abbildung 3 Nissl-Färbung, die die Stelle der Implantation auf dem Kortex. Ein kleiner Schnitt auf Teil des linken Cortex (Pfeil) beobachtet werden. Die Breite des durchdrungenen Bereich ist etwa 50 um. Die keine offensichtlichen schweren Gewebeveränderungen anhand von Nissl-Färbung im Vergleich zu der entsprechenden Gegenfläche (*). R: rechte Hemisphäre. L: Linke Hemisphäre. Maßstabsbalken = 300 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Abbildung 4. TractTracer-Einspritzstrategie wie zuvor durch Reitmeier et al. 6,7 publiziert. (A) Schematische anzeigt Injektionsstellen für die Darm-Trakt Tracer BDA an der kontralateralen motorischen Kortex der Erwägung, dass CB wurde in der motorischen Kortex des Infarkt Hemisphäre injiziert. Fasern wurden auf dem roten Nucleus (nicht gezeigt) und Facialiskern (siehe Abbildung 5). (B) Die Injektionsstelle der anterograde Trakt Tracer BDA neben der motorischen Kortex gezeigt folgt. Beachten Sie den roten Pfeil, der die Nadelbahn der Erwägung, dass der schwarze Pfeil zeigt einige Rindenzellen mit dem BDA beschriftet. Cx: Cortex. CC: Corpus callosum. V: Ventrikels. FN: Gesichts Kern. Maßstabsleiste in B = 200 &amp; mgr; m. 4A wird mit freundlicher Genehmigung 6 wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt = &quot;5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Wiederherstellung eines Infarkt Gehirn nach Lieferung rhEpo. (A) BDA injiziert im kontraläsionalen motorischen Kortex wird dann in kortikobulbären Fasern auf der Ebene des Facialiskern (Bregma -5,8 mm bis -6,3 mm) festgestellt. Schnittlinien auf jeder Hemisphäre wurden parallel zur Mittellinie und Fasern überquert jede Zeile in Richtung zur ipsilesional und kontraläsionalen Halbkugel gezogen wurden gezählt und als Prozentsatz des gesamten markierten Fasern in der Pyramidenbahn ausgedrückt. Erythropoietin erhöhten Faserkreuzungen in Richtung zu den kontraläsionelle Facialiskern Daten sind Mittelwerte + - SD. Die Daten wurden durch Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von mindestens signifikanten Unterschiede Tests §P &lt;0,05 im Vergleich zu Vehikel-behandelten nicht-ischämischen Mäusen. (B) Motor Verhalten zeigten eine Verbesserung der Handkraft und Koordination in der rota Stange Test. Die Daten sind Mittel valun + - SD. Daten wurden durch Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen analysiert, gefolgt von Einweg-ANOVA / am wenigsten signifikanten Unterschiede Tests für jede Zeitpunkt. §P &lt;0,05 im Vergleich mit vorher ischämischen Grundlinie; * P &lt;0,05 im Vergleich zu Vehikel-behandelten ischämischen Mäusen. 5A und B sind mit freundlicher Genehmigung 6 wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figur 6. Zielstrukturen nach Injektion Fluorogold (FG) erreicht ist. (A) an der Injektionsstelle von FG neben dem Motorkortex, wie in 1 angezeigt. Beachten Sie den roten Pfeil, der die Nadelbahn und der weiße Pfeil zeigt einige markierte Zellen in die Rinde. (B) FG injiziert in der Nähe des MotorsCortex ist in der VPL erkannt. Fi: Fimbria. IC: Interne Kapsel. RT: Nucleus reticularis. VPL: Thalamus ventralen posterolateralen Kern. Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions at JoVE.com

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

implantation-miniosmotic-pumps-delivery-tract-tracers-to-study-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Aufrufe.  University of Duisburg-Essen. In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Serie: Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential for recovery based on clinical assessments alone. The functional integrity of the corticospinal tract is an important prognostic biomarker for recovery of UL function, particularly for those with severe initial UL impairment. This article presents a protocol for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. This protocol can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve UL motor recovery and outcomes after stroke. The protocol also forms part of the PREP2 algorithm, which predicts UL function for individual patients 3 months poststroke. The algorithm sequentially combines a UL strength assessment, age, transcranial magnetic stimulation, and stroke severity, within a few days of the stroke. The benefits of using PREP2 in clinical practice are described elsewhere. This article focuses on the use of a UL strength assessment and transcranial magnetic stimulation to evaluate corticospinal tract function.

This protocol is for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. It can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve upper limb motor recovery and outcomes and in clinical practice for predicting upper limb functional outcomes 3 months after stroke.

Bestimmung des Funktionellen Status des Corticospinal Tract innerhalb einer Woche nach dem Schlaganfall

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...