We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. Virüs Hazırlıklar ve Transkripsiyon Faktör Birleşmeleri <ol><li> PSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidi ETV2, gata1, GATA2, TAL1 ve LMO2 (Tablo 1) için protein kodlayıcı DNA&#39;yı içeren çözelti hazırlayın. </li><li> 230 nm, 260 nm ve 280 nm&#39;de bir spektrofotometre UV absorpsiyonu kaydederek lentiviral üretimi için kullanılan plazmid preparasyonlarının konsantrasyon ve saflık ölçün. Not: 1.8 daha fazla DNA preparatları gösteren A260 / 280 ve A260 / 230 değerleri genellikle kaliteli olarak kabul edilir. Alt A260 / 230 değerleri tuzları ya da bazı çözücü gibi fenol ile kirleri işaret ederken alt A260 / 280 değerleri protein kontaminasyonu gösterebilir. Önerilen plazmid konsantrasyonu 1-3 mg / ml olduğunu. </li><li> Daha önce yayınlanmış protokollere 11&#39;de tarif edildiği gibi transdüksiyon için lentivirüsler üretir. Pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüksiyonu ETV2 ve gata1 veya ETV2 ve GATA2 ko-ifadesini gerektirir.Eritro- ve megakaryositik potansiyeli olan HE indüksiyonu GATA2 ve TAL1 gerektirir. LMO2 ilavesi, GATA2 ve TAL1 10 mevcudiyetinde hPSCs gelen eritro-megakaryositik hücrelerin verimini geliştirir. </li></ol> 2. hPSCs Kültür Protokolü <ol><li> Alt kültüre önce% 70-80 confluency keskin kenarlı dar kolonilerde pluripotent kök hücreleri büyütün. Mark ve kaldırmak kendiliğinden hücrelerin Pasajlanması önce koloniler farklılaşmış. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de, üreticinin talimatlarına ve kılıf 6-çukurlu plakalara göre, ticari hücre dışı matris jel (bakınız Tablo 2) ile seyreltilir, veya kullanımdan önce 37 ° C&#39; de en az bir saat karıştırıldı. Hücreleri Pasajlanması önce, matris aspire taze ticari komple culturemedium 2 ml ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 37 plakaları tutmak ° C, hücreler kadar% 5 CO 2 tohumlama için hazırız. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> Aspira(0.22 um filtre içinden süzme ile sterilize edilmiş DMEM / F12 içinde 2 mg / ml), bir konfluent hPSCs ile 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu ve önceden ısıtılmış Dispase II çözeltisi 1.5 mi ilave gelen te ortamı. Kolonilerin kenarları yüzeyinden kaldırılması için başlayana kadar 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 5-7 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Aspire Dispase II çözümü ve dikkatle ekleme ve sonra taze DMEM / F12 orta 2 ml aspire kez koloniler yıkayın. Daha sonra, 5 ml&#39;lik serolojik cam pipet ile, taze ticari tam kültür ortamı içinde 3 ml hPSCs ayrıştırmaları yukarı ve aşağı birkaç kez hücre süspansiyonu pipetleme (bakınız Tablo 2). </li><li> Her bir oyuğa, ticari tam kültür ortamı içinde 1.5 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka hücre süspansiyonu 0,5 ml ilave edilir (bakınız Tablo 2). Kuvöz içine plaka situating zaman homojen hücre dağılımını sağlamak için ileri ve geri ve sağa sola birkaç kez plaka çalkalayın. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 1 için hücreleri tutun8-24 saat. </li><li> Taze ticari komple kültür ortamına ertesi gün değişim ortamı (bakınız Tablo 2) ve hPSCs morfoloji inceleyin. HPSC morfoloji istinat küçük, iyi-ekli kolonilerde Başarılı Pasajlanması sonuçları. hPSCs de günlük olarak 2.5-3 ml freshmedium başı ile beslenen ve 70-80% konfluansa fazla olmayacak şekilde, her 4-5 gün geçişli olması gerekir. Not: hiPSCs fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) muhafaza edildi, bunlar besleyici içermeyen koşullar aktarılır ve etkin farklılaşmasını sağlamak için transdüksiyon önce 2-3 kez geçirilmiştir gerekmektedir. </li></ol></li></ol> HPSCs (gün 0, hPSCs transdüksiyonu) için Hematoendothelial Pprecursors 3. İndüksiyon <ol><li> Reaksiyon ortamı, ticari komple serumsuz ortam içinde 1.3 ml kombine hazırlamak için, virüs, polybrene ve Y27632 ROCK inhibitörü (Tablo 1) (bakınız Tablo 2): nihai konsantrasyonları 1.3 ml ortama 10 mM ROCK inhibitörü 1,3 ula bir nihai konsantrasyonu 6 ng / ml, 10 uM tion ve polibren. <ol><li> Hücre başına her virüsün 0,5-1,0 MOI değerinde bir nihai konsantrasyona (enfeksiyon çokluğu), viral bir konsantre (ler), uygun bir miktarda ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de, reaksiyon ortamı tutun. Not: gata1 / ETV2, GATA2 / TAL1 bölgesindeki her bir virüs için MOI aynı miktarda ve GATA2 / TAL1 / LMO2 reaksiyon karışımları farklılaşmasının indüksiyonu için en uygunudur. ETV2 göre GATA2 için MOI katlama Ancak ETV2 in / GATA2 transduse kültürler, türev geliştirir. Bu nedenle, bu kültürlerin, oran 1: ETV2 MOI&#39;de ve GATA2 1 MOI 2 önerilir (viral konsantre, yaklaşık 6.8 x 10 7 parçacık / ml olduğu tahmin edilmektedir, eğer, ETV2 10 ul ve GATA2 viral konsantreleri 20 ul ekle örn Bir 6-plaka, 35 mm oyuk bir ETV2 / GATA2 reaksiyon başına 0,68 x 10 6 hücre). </li></ol></li><li> Tek bir hücre asmalar içinde hPSCs hazırlayınension. <ol><li> 4. günde bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, en son geçiş aşağıdaki besleyici içermeyen koşullarda hPSCs büyümeye tersine bir mikroskop altında hücre yoğunluğu ve şekil görmekteyiz. hPSCs iletimi gününde ~% 60-70 confluency hiç kendiliğinden farklılaşma ile keskin kenarlı sıkı koloniler halinde büyür ve ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Kültür ortamı basınçla, oyuk başına ticari hücre ayırma reaktifi (Tablo 1) 1,5-2 ml ekleyin ve 5-7 dakika için% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ticari tam orta eşit hacimlerde içine hücreleri toplamak hücrelerin sayısı ve canlılığı belirler, ROCK inhibitörünün 10 uM (bakınız Tablo 2). Santrifüj Pelet hücreleri 5 dakika 200 x g&#39;de ve daha sonra, ml başına 3,4-5 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ROCK inhibitörünün 10 uM ticari tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. NOT: Hücre canlılığı, başarılı bir viral transdüksiyon ve daha sonra farklılaşması için çok önemlidir.Tipik haliyle, transdüksiyon önce hücre yaşayabilirliği% 90 fazla olmalıdır. </li></ol></li><li> 3.1 hazırlanan reaksiyon ortamının 1.3 mi içine 0,68-1 x10 6 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 200 ul ilave edin. </li><li> 2.2 hazırlanan gece boyunca kaplanmış 6-çukurlu plaka matrisi çözeltisi aspire., 6-çukurlu bir levhanın bir oyuğuna, reaksiyon karışımı transferi ve hücreler eşit dağıtırlar. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. 24 saat sonra hücreler en az 80% matrisine bağlı olmalıdır. </li></ol> HPSCs gelen Hematoendothelial Öncülerinin 4. indüksiyonu (Gün 1-7) <ol><li> SCF 100 ng / ml, TPO: 24 saat sonra transdüksiyonu, virüs ihtiva eden orta kaldırmak ve ticari tam olmayan hücre kültür ortamı ile bağlanmış yıkama hücreleri, hematopötik sitokinler (Tablo 1 e bakınız) ve daha sonra ticari bir tam olmayan hücre kültür ortamında oyuk ihtiva başına 3 ml ilave 50 ng / ml bFGF (bundan sonra 3F-ortam olarak adlandırılır), 20 ng / ml. </li><li> Ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için günde 2, 3 ve 4. günde taze 3F-orta toplam orta yerine. Yüzen hematopoietik hücreler ortaya çıkıyor zaman 4 ml toplam hacim korurken 4 gün sonra, her gün 3F-orta yarısı değiştirin. Not: pSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidleri, böylece kalıt aktarımlı hücrelerin pozitif seçimi için izin puromisin direnç geni içermektedir. Puromycin 1 ug / ml herhangi bir kalıntı farklılaşmamış hPSCs ortadan kaldırmak için farklılaşma ilk 1-2 gün boyunca ortama ilave edilebilir. </li><li> Tersine bir mikroskop altında, 4. günde hücre morfolojisi dikkate alınmalıdır: tipik bir endotel morfolojisi olan hücrelerin yoğun kümeleri ortaya çıkmaya başlar (Şekil 2A, 3A). Bazı alanlarda hPSCs morfoloji tutabilir ise Yuvarlak kan hücreleri, farklılaşma günde 7 günden 5 anlaşılmaktadır. Aşağıda tarif edildiği gibi HE ve hematopoetik farklılaşma analiz edin. NOT: Başarılı hematoendothelial farklıiation gevşek yatan düz bir endotel hücrelerine bağlı olarak refraktil Yuvarlak hücreleri görünür kan hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır. Bu hücreler, aktif ayırmak ve şamandıra (Şekil 2A ve 3A) sonunda küçük agregalar oluşturan çoğalırlar ve. Canlı kan hücreleri ışığı yansıtır ve kültür koşullarında genişletmek için kendi yeteneklerine göre ölü ve ölmekte olan hücrelerden görsel ayırt edilebilir. </li></ol> 5. Farklılaşma Hemogenic Endotel (HE) Sahne Analizi. <ol><li> Endotel morfolojisi hücrelerin mikroskobik gözlem yoluyla günde 3 ve farklılaşma 4 arasında HE oluşumunu algılar. Farklılaşma, bu aşamada kültürde yüzen kan hücreleri bulunmaktadır. HE varlığı immunofluorescent boyama ile doğrulandı ve VE-kaderin, CD73, CD226 ve CD43 antikorları kullanarak flow sitometri yöntemi olabilir. <ol><li> 3. günde akım sitometri analizi kullanımı hücreleri tarafından HE oluşumunu değerlendirmek içintek deneyden ve gün 4. Ticari hücre ayrışma reaktifi ile kültürlerin inkübe hücreleri toplamak, 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle (Tablo 1 e bakınız), daha sonra% 5 CO2 ve boyama reaksiyon başına 1 x 10 5 hücre kullanabilir (anlatılan boyama işlemi akış sitometrisi 12). NOT:-kaderin VE + HE hücrelerin erken hematopoetik işaretleyici CD226 ifadesini elde, ama CD73 ve CD43 6 ifadesini yoksundur. Tersine, HE-hücreleri CD73 (Şekil 2B, 3B) ifade etmektedir. </li></ol></li><li> HPSC türetilmiş HE için immünofloresan boyama. <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin bağlanmış tek tabaka yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika ila 60 den% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. </li><li> Yıkama Hücreler tekrar PBS ile ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 kullanarak Permeabilize. </li><li> Üç kez PBS, iki hücrelerin yıkayın ve daha sonra inkübe30 ila 120 dakika süre ile,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile PBS oluşan blokaj tamponu. </li><li> Birincil antikorlar hem de içeren, boyama çözeltisi hazırlayın (1: 1000 seyrelti) fare anti-insan CD43 ve tavşan anti-insan% 5 FBS içeren PBS içinde (Tablo 1)-kaderin. A.Ş. </li><li> Hücrelerinden engelleme tampon aspire ve ilave primer antikorlar ile lekeleme tampon maddesi içinde oyuk başına 1 ml ekleyin; Oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. </li><li> % 5 FBS içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreler üç kez yıkayın. </li><li> 1 de sekonder antikorlar ihtiva eden, ikinci bir boyama tamponu hazırlayın: 5% FBS içeren PBS içinde 500 seyreltme: eşek, yeşil floresan boya ve kırmızı bir floresan boya (Tablo 1) ile konjuge edilmiş anti-fare ile konjüge edilmiş anti-tavşan. İkincil lekeleme tampon maddesi, oyuk başına 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Serum olmaksızın PBS ile üç kez yıkanır. 300 nM DAPI dH çözüm çalışma ile Leke hücreleri10-15 dakika süreyle 2 O. </li><li> PBS ile hücreler iki kez yıkayın ve içine de lekeli hücreleri ile PBS 2-3 ml ekleyin. Yeşil, kırmızı ve mavi mikroskop filtreleri ile floresan gözlemleyin. </li></ol></li></ol> Kaynaklı Hematopoetik Öncülerinin 6. Analizi <ol><li> 3.1 açıklandığı gibi yüzen hücreleri 3F-orta yarısını değiştirerek, 10-14 güne kadar, önemli ölçüde genişletmek kadar her iki günde bir, farklılaşma kültürleri korumak. </li><li> Ayrıştırmaları ticari bir hücre ayrışma reaktifi ile muamele etmek suretiyle hücrelerin hücrelerin tek tabakalarını ayırt toplamak 37 ° 5-10 dakika için (Tablo 1 e bakınız) ° C,% 5 CO2. </li><li> Kültürler 12 hematopoezisi değerlendirmek için anti-VE-kaderin, CD43 ve CD45 antikorları kullanarak flow sitometri gerçekleştirin. Kadar ETV2 ve GATA2 kalıt aktarımlı hücrelerin% 40 hücrelerinin büyük bir kısmı, eş-ifade eder VE-cad olduğu ve CD43 edin. Aşağıdaki antikorlar e, aşağıdaki spesifik hücre soyları tespit etmek için kullanılabilirXpansion veya indüklenmiş kan progenitörlerinin farklılaşması: CD235a (eritroid hücreleri), CD41a (megakaryositik), CD32 (miyeloid hücrelerin her türlü), CD66b (nötrofiller) ve CD163 (makrofajlar) vardır. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari klonojenik ortamı (Tablo 1) kullanarak CFC tahlil gerçekleştirin. <ol><li> Ticari klonojenik ortamının 3 ml 2/1 x 10 4 hücreleri aktarın koloni oluşturan hücreler ve hematopoietik koloni tiplerinin sayısını belirlemek için (bakınız Tablo 3). Optimal tohum yoğunluğu birbirinden ayrı büyür ve üst üste gelmez tek koloniler tanımlanması ve izole edilmesi için izin verir. Tohum yoğunluğu farklılaşma verimliliğine bağlı olarak deneyler arasında değişebilir, ancak ticari klonojenik ortamının 1 ml&#39;si başına 1 x 10 4 hücrelerini geçmemelidir. </li><li> Yumuşak bir girdaplamadan ticari klonojenik hücrelerin ortam içinde karıştırın ve iki adet 35 mm&#39;lik çok düşük bağlanma yemekler süspansiyonun 3 ml aktarmakCFC tahlilinde, her bir çanak süspansiyonun 1.5 ml için. Eşit orta dağıtın ve 14 gün süreyle 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yemekler rahatsız etmemek; Gün 7 ve analiz gününe 10 koloni oluşumunu görmekteyiz. </li><li> 14. günde kendi morfolojilerine göre hematopoetik koloniler tespit ve sayım. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium:+origins,+regulation,+and+implications+for+vascular+biology.">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li><li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+history+of+hemogenic+endothelium.">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol &amp; Dis. 51, 206-212 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties.">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li><li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li><li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukosialin+(CD43)+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures.">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy.">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li><li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li><li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators.">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372 (2014).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li></ol>

IS Cynata için kurucu ortağı ve danışmanlık yapmaktadır.

TFs aşırı ifadesi ile hPSCs hematopoietik farklılaşması için yukarıda tarif edilen yöntem olup, HESC ve böylece en fazla 30 milyon kan hücrelerinin üretimini gelen izin iPSCs gelen HE ve miyeloid ve eritropent-magakaryocytic öncüller için hızlı ve etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir Bir milyon pluripotent kök hücreleri 10. Bu yöntem, çok sayıda HESC ve iPSCs hatları 10 tutarlı farklılık sergiledi. ETV2 ve GATA2 tarafından farklılaşma sırasında gata1 faktörleri ...

Kendini yenilemek ve kanda olmak üzere üç germ, hücre içine ayırt etmek, hematopoetik gelişim mekanik çalışmalar için onlara değerli bir araç yapmak, kan hastalıkları modellenmesi, ilaç taraması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) benzersiz yeteneği, toksisite çalışmaları ve hücresel tedavilerin geliştirilmesi. Endotel hematopoetik geçiş 1,2 ile (HE) hemogenic endotel embriyo hasılatı kan oluşumu, kültürlerde HE nesil hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartnameye endotelyal düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için gerekli olacaktır çünkü. HE çalışmaları için geçerli yöntem hematopoez destekleyici stromal hücreler 6,7 ya da hücre dışı olan iki boyutlu kültürlerde hPSCs hematopoietik sitokinlerin 3-5 ilavesi ile agrega (EBS) &#39;de hematoendothelial farklılaşmanın başlaması ve birlikte-kültür dayanmaktadır matrisler ve c8,9 ytokines. Bu, klasik yöntemler farklılaşma, hücre yüzeyinde hareket eden ve en sonunda hematoendothelial gelişimi yol transkripsiyonel program aktivasyonuna yol molekül yolların kaskadlar başlatılması harici sinyaller giriş dayanmaktadır. Bu nedenle, bu sistemlerde hPSCs farklılaşmalar etkinliği bu sinyallere etkili bir indüksiyonu, çekirdeğe sinyal iletimi, spesifik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan elde edilen aktive edilmesine dayanır. Buna ek olarak, geleneksel bir farklılaşma kültürlerde HE çalışma hücre sıralama kullanarak HE hücrelerin izole edilmesi ek aşamasını gerektirmektedir. Burada, hematopoetik transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile HE ve kanın doğrudan indüksiyon için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, bir hantal hücre sıralama işlemi kullanılarak HE ayırmaya gerek olmadan, bir çanak ve hematopoietik geçiş endotelyal doğrudan gözlem HE etkin aşılanmasını da olanaklı kılar. Insan pluripotent kök hücrelerden HE oluşumu ve kan verimli bir kaç transkripsiyon faktörlerini (TF) aşırı eksprese eden indüklenebilir. HPSCs gelen sağlam pan-miyeloid hematopoeze indükleyebilen TFs optimal kombinasyonu ETV2 ve gata1 veya GATA2 içerir. Bunun aksine, GATA2 ve TAL1 kombinasyonu erythromegakaryocytopoiesis 10 neden olur. CD73 - - yavaş yavaş, erken hematopoietik markör CD43 7 ekspresyonu ile tanımlanan hematopoietik fenotipi edinebilir HE hücreleri bu faktörlerin aşırı ekspresyonu yoluyla hPSCs Programlama şirketinden The için hPSCs VE-cad + CD43 ayırır. İnsan pluripotent kök hücreleri, bir yöntem doğrudan programlanması için bu lentiviral bazlı yöntem mekanik çalışmalar, hematopoietik geçiş endotelyal çalışmaları ve hematopoietik gelişimi ve tarifnamenin transkripsiyonel düzenleme için olan HE ve kan hücrelerinin üretimi için de geçerlidir. C rağmeneçerli protokolü benzer sonuçlar modifiye mRNA 10 kullanılarak elde edilebilir transgenlerin bünyesel anlatımı ile, kan üretimini açıklar.

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61061</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61063</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61064</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">A11105-01</td>
			<td rowspan="2">Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 Custom formulation&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>MCF</td>
			<td><a name="RANGE!D12">Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>Research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-cad) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560411</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>338305</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560199</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5795A</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555485</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Live/Dead assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Cell fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML&#160;</td>
			<td>Permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD43</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551457</td>
			<td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td>
			<td>BenderMedSystem</td>
			<td>BMS158</td>
			<td>Primary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-486-152</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-516-150&#160;</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nucleic acid stain</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>D1306&#160;</td>
			<td>Live/Dead assay (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td>CFC-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Stain solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32857</td>
			<td>Staining cytospins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table 2. hPSCs culture.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td>
			<td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 media&#160;&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>M500&#160;</td>
			<td>Serum-free&#160; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences/ Corning&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder&#160;</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>12500-062</td>
			<td>Basal Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s PBS powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dSH30013.04</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dispase II, powder</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">17105-041</td>
			<td rowspan="2">Neutral protease, Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer&#39;s Name</td>
			<td>Forward (Fwd)&#160; 5&#8217; --&#62;3&#8217;</td>
			<td>Reverse (Rev) 5&#8217;--&#62;3&#8217;</td>
			<td>Discription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN EF1a Fwd</td>
			<td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td>
			<td>--</td>
			<td>EF1a promoter sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETV2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&#160;</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

Gelişimi sırasında, hematopoietik hücreler endotel hücrelerinin özel bir alt grubundan elde edilen ortaya çıkan hemogenic endotel (HE). In vitro Modelleme HE geliştirme endotel-hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartname mekanik çalışmalar için gereklidir. Burada, transkripsiyon faktörlerinin farklı setleri aşırı ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için HE etkin indüksiyonu için bir yöntem tarif eder. GATA2 ve TAL1 transkripsiyon faktörlerinin bir arada eritroid ve megakaryositik potansiyeli olan HE üretimine olanak sağlar ise ETV2 ve gata1 ya GATA2 TFs kombinasyonu, pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüklemek için kullanılır. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu LMO2 ilavesinin farklılaşmasını hızlandırır ve eritroid ve megakaryositik hücre üretimini arttırır. Bu yöntem, hPSCs gelen HE endüksiyon etkili ve hızlı bir yol sağlar ve endotelial-hematopoieti gözlem sağlarbir kültür kabı c geçişi. Protokol hPSCs transdüksiyon usul ve HE sonrası transdüksiyon analizi ve kan atalarıdır içerir.

Bir GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasyonu esas olarak eritro-megakaryositik hematopoez indükler HE ve transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile hPSCs kan indüksiyon şematik diyagramıdır, pan-miyeloid hematopoez indükler gata1 ya GATA2 kombinasyonu ile Şekil 1 ETV2 gösterilmiştir. Hem TF kombinasyonları doğrudan sonradan hematopoetik farklılaşma farklı bir spektrumu ile kan atalarıdır dönüştürülmüştür HE hücrelerini kaynaklı. Kana pluripotent devletten hPSCs Farklılaşma H...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 