We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. Virus Preparaciones y factor de transcripción Combinaciones <ol><li> Preparar soluciones con plásmido de expresión lentiviral pSIN-EF1α que contiene ADN que codifica la proteína para ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 y LMO2 (Tabla 1). </li><li> Medir la concentración y pureza de las preparaciones de plásmido utilizado para la producción de lentiviral mediante el registro de la absorción UV con un espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm, y 280 nm. Nota: preparaciones de ADN demuestran A260 / 280 y A260 / 230 valores superiores a 1,8 se consideran en general de buena calidad. 280 Los valores más bajos A260 / pueden indicar contaminación de proteínas, mientras que los valores más bajos A260 / 230 indican impurezas con sales o algún disolvente tal como fenol. Concentración de plásmido recomendada es de 1 a 3 mg / l. </li><li> Producir lentivirus para transducciones como se describe en los protocolos publicados previamente 11. La inducción de la SE con potencial de pan-mieloide requiere co-expresión de ETV2 y GATA1 o ETV2 y GATA2.La inducción de la SE con potencial de eritro- y megacariocítico requiere GATA2 y TAL1. La adición de LMO2 mejora significativamente el rendimiento de las células-eritro megacariocítica de hPSCs en presencia de GATA2 y TAL1 10. </li></ol> 2. Protocolo Cultura hPSCs <ol><li> Crecer células madre pluripotentes en colonias cerradas con bordes afilados para el 70-80% de confluencia antes de subcultivo. Mark y eliminar espontáneamente diferenciadas colonias antes de pases células. </li><li> Diluir gel de matriz extracelular comercial (véase la Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las placas de capa de 6 pocillos durante la noche a 4 ° C, o durante al menos una hora a 37 ° C antes de su uso. Antes de pases células, aspirar la matriz, añadir 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabla 2) y mantener las placas a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que las células están listas para la siembra. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate medio de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos con hPSCs y añadir 1,5 ml de la solución de pre-calentado dispasa II (2 mg / ml en DMEM / F12, se esteriliza por filtración a través de filtros de 0,22 micras). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la superficie. </li><li> Aspirar solución de dispasa II y cuidadosamente se lavan las colonias dos veces mediante la adición de aspiración y luego 2 ml de medio DMEM / F12 fresco. Luego, utilizando una pipeta de vidrio de 5 ml serológica, se disocian hPSCs con 3 ml de medio de cultivo completo fresco comercial (véase la Tabla 2) pipeteando la suspensión celular arriba y abajo varias veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía 1,5 ml de medio de cultivo completo comercial (véase la Tabla 2). Agite la placa de ida y vuelta y de derecha a izquierda varias veces para asegurar una distribución de células uniforme cuando situar la placa en la incubadora. Mantenga las células a 37 ° C, 5% de CO 2 por 108.24 h. </li><li> El siguiente cambio medio día al medio de cultivo completo comercial fresco (ver Tabla 2) y examinar hPSCs morfología. Resultados pases acertados en pequeñas colonias, así conectados a retención HPSC morfología. hPSCs deben ser alimentados con 2.5-3 ml freshmedium por pocillo sobre una base diaria y se pasaron cada 4-5 días en no más de un 70-80% de confluencia. NOTA: Si se mantuvieron hiPSCs en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), tienen que ser transferidos a condiciones de alimentación libre y pases 2-3 veces antes de transducción para asegurar la diferenciación eficiente. </li></ol></li></ol> 3. Inducción de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (día 0, la transducción de hPSCs) <ol><li> Para preparar medio de reacción se combinan 1,3 ml de medio libre de suero completa comercial (ver Tabla 2), virus, polibreno, y Y27632 inhibidor ROCA (Tabla 1): añadir 1,3 l de inhibidor ROCA 10 mM a 1,3 ml de medio a una concentración final deción de 10 m, y polibreno a una concentración final de 6 mg / ml. <ol><li> Añadir una cantidad apropiada de concentrado viral (s) a una concentración final de 0,5 a 1,0 MOI (multiplicidad de infección) de cada virus por célula. Mantener medio de reacción en hielo oa 4 ° C hasta que la suspensión de una sola célula está listo. NOTA: La misma cantidad de MOI para cada virus en el GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, y mezclas de GATA2 / TAL1 de reacción / LMO2 es óptimo para la inducción de la diferenciación. Culturas Sin embargo, en ETV2 / GATA2 transducidas duplicando MOI para GATA2, en relación con ETV2, aumenta la diferenciación. Se recomienda 2 para MOI de ETV2 y 1 MOI de GATA2 (por ejemplo, si concentrado viral se estima aproximadamente 6,8 x 10 7 partículas / ml, añadir 10 l de ETV2 y 20 l de GATA2 concentrados virales a: Por lo tanto, para estos cultivos, la relación de 1 0.68 x 10 6 células por una de las reacciones ETV2 / GATA2 en un pozo de 35 mm de una placa de 6 pocillos). </li></ol></li><li> Preparar hPSCs en una sola susp celularensión. <ol><li> Crecer hPSCs en condiciones libres de alimentador como se describe en la sección 2. El día 4 a partir del último paso, observar la densidad celular y la morfología bajo un microscopio invertido. hPSCs deben crecer en colonias apretados con bordes afilados sin diferenciación espontánea y llegar a ~ 60-70% de confluencia en el día de la transducción. </li><li> Aspirar medio, añadir 1.5-2 ml de reactivo comercial de disociación celular (Tabla 1) por pocillo e incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 5-7 min. </li><li> Recoger las células en volúmenes iguales de medio completo comercial (ver Tabla 2) con 10 M de inhibidor de ROCK, contar las células y determinar la viabilidad. Precipitar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min y luego se resuspenden las células en medio completo comercial con 10 M de inhibidor de ROCK una concentración de 3.4-5 x 10 6 células por ml. NOTA: La viabilidad celular es fundamental para la transducción viral exitosa y posterior diferenciación.Típicamente, la viabilidad celular antes de la transducción debe exceder de 90%. </li></ol></li><li> Añadir 200 l de la suspensión celular, que contiene 0.68-1 6 células x10, en 1,3 ml del medio de reacción preparada en 3.1. </li><li> Aspirar la solución de la matriz de la placa de 6 pocillos recubiertos noche preparado en 2.2., La transferencia de la mezcla de reacción a un pocillo de una placa de 6 pocillos y distribuir uniformemente las células. Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas. Después de 24 horas a menos 80% de las células debe estar unido a la matriz. </li></ol> 4. Inducción de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (día 1-7) <ol><li> 24 horas después de la transducción, eliminar el medio que contiene virus y lavar las células unidas con medio de cultivo celular incompleta comercial (véase la Tabla 1) y luego añadir 3 ml por pocillo de medio de cultivo celular incompleta comercial que contiene citoquinas hematopoyéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (en adelante como 3F-medio). </li><li> Reemplace medio total, con frescos 3F-medio en los días 2, 3 y 4 días para eliminar las células muertas y los desechos. Después del día 4, cuando están surgiendo células hematopoyéticas flotantes, reemplace la mitad del 3F-medio cada dos días, manteniendo el volumen total de 4 ml. NOTA: pSIN-EF1α plásmidos de expresión lentiviral incorporan gen de resistencia a puromicina permitiendo de este modo para la selección positiva de las células transducidas. El 1 mg / ml de puromicina se puede añadir al medio durante los primeros 1-2 días de diferenciación para eliminar los cualquier hPSCs indiferenciadas residuales. </li><li> Observar la morfología celular en el día 4 bajo un microscopio invertido: racimos apretados de células con morfología típica endotelial comienzan a aparecer (Figuras 2A, 3A). Células de la sangre de la Ronda aparece desde el día 5 al día 7 de diferenciación, mientras que algunas zonas pueden retener hPSCs morfología. Analizar HE y la diferenciación hematopoyética tal como se describe a continuación. NOTA: diferente hematoendothelial Exitosaiation resulta en la producción de células sanguíneas que aparecen células redondas como refráctiles débilmente unido a las células endoteliales planas subyacentes. Estas células proliferan activamente la formación de pequeños agregados, y, finalmente, separar y flotador (Figuras 2A y 3A). Glóbulos en directo se pueden distinguir visualmente de las células muertas y moribundas en función de su capacidad de reflejar la luz y ampliar en las condiciones de cultivo. </li></ol> 5. Análisis de Hemogenic endotelio (HE) etapa de diferenciación. <ol><li> Detectar la formación de HE entre los días 3 y 4 de la diferenciación por la observación microscópica de las células con morfología endotelial. No hay células de la sangre que flotan en el cultivo en esta etapa de diferenciación. La presencia de SE puede confirmarse mediante tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis utilizando anticuerpos VE-cadherina, CD73, CD226 y CD43. <ol><li> Para evaluar la formación de HE by células utilizan el análisis de citometría de flujo en el día 3y 4 días de un experimento. Recoger las células por incubación de las culturas con el reactivo de disociación celular comercial (ver Tabla 1) durante 5-10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego usar hasta 1 x 10 5 células por reacción de tinción (citometría de flujo procedimiento de tinción se describe en 12). NOTA: VE-cadherina + HE células adquieren expresión de principios CD226 marcador hematopoyético, pero carecen de la expresión de CD73 y CD43 6. En contraste, las células no expresan CD73 HE (Figuras 2B, 3B). </li></ol></li><li> La tinción de inmunofluorescencia para derivados de HPSC HE. <ol><li> Lavar la monocapa adjunta de células con tampón fosfato salino (PBS) y luego fijar las células en paraformaldehído al 4% de 30 a 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células de nuevo con PBS y después se permeabilizan utilizando 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células en PBS dos a tres veces y luego se incuban entampón de bloqueo que consiste en PBS con suero bovino fetal al 10% (FBS), por 30 a 120 min. </li><li> Preparar solución de tinción, que contiene ambos anticuerpos primarios (1: 1000 dilución) de ratón anti-CD43 humana y de conejo anti-humanos VE-cadherina en PBS con 5% de FBS, (Tabla 1). </li><li> Aspirar el tampón de bloqueo de las células y añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción con los anticuerpos primarios añadidos; incubar 3 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Se lavan las células tres veces mediante la adición de 2 ml de PBS con 5% de FBS. </li><li> Preparar un segundo tampón de tinción, que contiene anticuerpos secundarios en dilución 1: 500 en PBS con 5% de FBS: burro anti-conejo conjugado con colorante fluorescente verde, y anti-ratón conjugado con colorante fluorescente rojo (Tabla 1). Añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción secundaria y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar tres veces con PBS sin suero. Las células se tiñen con 300 nM DAPI solución de trabajo en DH2 O durante 10-15 min. </li><li> Lavar las células con PBS dos veces y añadir 2.3 ml de PBS en bien con células teñidas. Observar con filtros de fluorescencia de microscopio verde, rojo y azul. </li></ol></li></ol> 6. Análisis de Inducidos hematopoyéticas Precursores <ol><li> Mantener culturas de diferenciación hasta que las células flotantes se expanden significativamente, hasta 10-14 días, cambiando el medio de 3F-medio, como se describe en 3.1, cada dos días. </li><li> Se disocian y recoger la diferenciación de monocapas de células mediante el tratamiento de las células con un reactivo de disociación celular comercial (véase la Tabla 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Realizar citometría de flujo utilizando anti-VE-cadherina, anticuerpos CD43 y CD45 para evaluar la hematopoyesis en las culturas 12. Tenga en cuenta que una gran parte de las células, hasta el 40% de las células ETV2 y GATA2 transducidas, co-expresa VE-cad y CD43. Los siguientes anticuerpos pueden utilizarse para detectar linajes celulares específicos siguientes eXpansion o la diferenciación de células progenitoras de sangre inducidos: CD235a (células eritroides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos los tipos de células mieloides), CD66b (neutrófilos) y CD163 (macrófagos). </li><li> Realizar CFC-ensayo utilizando un medio clonogénico comercial (Tabla 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Traslado 1-2 x 10 4 células en 3 ml de medio clonogénica comercial (ver Tabla 3) para evaluar el número de células y tipos de colonias hematopoyéticas formadoras de colonias. Densidad óptima de siembra permite la identificación y el aislamiento de colonias individuales que crecen por separado unos de otros y no se solapan. Densidad de siembra puede variar entre los experimentos en función de la eficiencia de la diferenciación, pero no debe exceder de 1 x 10 4 células por 1 ml de medio clonogénico comercial. </li><li> Mezclar células en medio clonogénica comercial por agitación suave, y la transferencia de 3 ml de suspensión de dos 35 mm platos ultra-bajas de fijaciónpara el ensayo de CFC, 1,5 ml de la suspensión a cada plato. Distribuir uniformemente medio y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 14 días. Evite molestar a los platos; observar la formación de colonias en el día 7 y el día 10 del ensayo. </li><li> Identificar y contar colonias hematopoyéticas según sus morfologías en el día 14. </li></ol></li></ol>

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IS es accionista fundador y consultor de Cynata.

El método anteriormente descrito para la diferenciación hematopoyética de hPSCs por la sobreexpresión de TFS, representa un enfoque rápido y eficiente para la generación de HE y mieloides y erytho magakaryocytic progenitores de hESCs y CMPI, permitiendo así la producción de hasta 30 millones de células de sangre de un millón de células madre pluripotentes 10. Este método exhibió diferenciación consistente en múltiples células madre y iPSCs líneas 10. Durante la diferenciación por ...

La capacidad única de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales, incluyendo sangre, que sean una herramienta valiosa para los estudios sobre el mecanismo de desarrollo hematopoyético, el modelado de enfermedades de la sangre, la detección de drogas, Los estudios de toxicidad y el desarrollo de terapias celulares. Debido a la formación de la sangre en los embriones producto de endotelio hemogenic (HE) a través de una transición hematopoyético endotelial 1,2, la generación de la ES en culturas sería esencial para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la endotelial a la transición hematopoyético y especificación hematopoyético. Los métodos actuales para estudios de HE se basan en la inducción de la diferenciación hematoendothelial en los agregados (EBS) con la adición de citoquinas hematopoyéticas 3-5, y de cocultivo con células estromales hPSCs-hematopoyesis de apoyo 6,7 o en cultivos de dos dimensiones con extracelular matrices y moldes cytokines 8,9. Estos métodos de diferenciación clásicos se basan en la introducción de señales externas que actúan en la superficie celular y que inician cascadas de vías moleculares que eventualmente conducen a la activación de programa transcripcional guiar el desarrollo hematoendothelial. Por lo tanto, la eficiencia de hPSCs diferenciaciones en estos sistemas se basa en una inducción efectiva de esas señales, la transducción de señales al núcleo, y la activación resultante de reguladores transcripcionales específicos. Además, el estudio de HE en cultivos de diferenciación convencionales requiere la etapa adicional de aislamiento de células HE usando la clasificación de células. Aquí se describe un protocolo sencillo para la inducción directa de HE y sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción hematopoyéticas. Este método permite la inducción eficiente de HE en un plato y la observación directa del endotelial a la transición hematopoyéticas sin la necesidad de aislamiento de HE utilizando un procedimiento de clasificación de células engorroso. Formación de SE y la sangre a partir de células madre pluripotentes humanas pueden ser inducidas de manera eficiente mediante la sobreexpresión a pocos factores de transcripción (TFS). La combinación óptima de TFS capaces de inducir robusta hematopoyesis-pan mieloide de hPSCs incluye ETV2 y GATA1 o GATA2. En contraste, la combinación de GATA2 y TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programación hPSCs través de la sobreexpresión de estos factores que diferencia hPSCs directamente a la VE-cad + CD43 - CD73 - células HE que adquieren gradualmente el fenotipo hematopoyético definirse por la expresión de principios del CD43 marcador hematopoyético 7. Este método basado en lentiviral para la programación directa del método de pluripotentes células madre humana es aplicable para la generación de HE y las células de sangre para estudios mecanísticos, estudios de endotelial a la transición hematopoyético, y la regulación transcripcional de desarrollo hematopoyético y especificación. Aunque la current protocolo describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de los transgenes, resultados similares podrían obtenerse utilizando ARNm modificado 10.

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61061</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61063</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61064</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">A11105-01</td>
			<td rowspan="2">Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 Custom formulation&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>MCF</td>
			<td><a name="RANGE!D12">Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>Research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-cad) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560411</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>338305</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560199</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5795A</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555485</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Live/Dead assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Cell fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML&#160;</td>
			<td>Permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD43</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551457</td>
			<td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td>
			<td>BenderMedSystem</td>
			<td>BMS158</td>
			<td>Primary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-486-152</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-516-150&#160;</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nucleic acid stain</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>D1306&#160;</td>
			<td>Live/Dead assay (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td>CFC-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Stain solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32857</td>
			<td>Staining cytospins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table 2. hPSCs culture.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td>
			<td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 media&#160;&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>M500&#160;</td>
			<td>Serum-free&#160; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences/ Corning&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder&#160;</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>12500-062</td>
			<td>Basal Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s PBS powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dSH30013.04</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dispase II, powder</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">17105-041</td>
			<td rowspan="2">Neutral protease, Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer&#39;s Name</td>
			<td>Forward (Fwd)&#160; 5&#8217; --&#62;3&#8217;</td>
			<td>Reverse (Rev) 5&#8217;--&#62;3&#8217;</td>
			<td>Discription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN EF1a Fwd</td>
			<td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td>
			<td>--</td>
			<td>EF1a promoter sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETV2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&#160;</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

Durante el desarrollo, las células hematopoyéticas se derivan de un subconjunto especializado de las células endoteliales, el endotelio hemogenic (HE). HE desarrollo Modeling in vitro es esencial para estudios mecanísticos de la transición-endotelial hematopoyético y especificación hematopoyético. Aquí se describe un método para la inducción eficiente de SE a partir de células humanas pluripotenciales (hPSCs) mediante la sobreexpresión de diferentes conjuntos de factores de transcripción. La combinación de ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS se utiliza para inducir HE con potencial de pan-mieloide, mientras que una combinación de factores de transcripción y GATA2 TAL1 permite la producción de HE con eritroide y megacariocítica potencial. La adición de LMO2 a GATA2 y la combinación TAL1 acelera sustancialmente la diferenciación y aumenta células eritroides y megacariocíticos producción. Este método proporciona un medio eficiente y rápida de HE inducción de hPSCs y permite la observación del endotelio hematopoietic transición en una placa de cultivo. El protocolo incluye procedimientos hPSCs transducción y análisis post-transducción de SE y progenitores de sangre.

El diagrama esquemático de HE y la inducción de sangre de hPSCs por la sobreexpresión de factores de transcripción se muestra en la Figura 1. ETV2 con la combinación GATA1 o GATA2 induce la hematopoyesis pan-mieloide, mientras que un GATA2, TAL1 +/- combinación LMO2 induce la hematopoyesis predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas combinaciones TF directamente inducidos células el que posteriormente transforman en células progenitoras de sangre con un espectro diferente de diferenciación...

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Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K vistas.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

Video: Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Humano madre pluripotentes células Basado Toxicidad para el desarrollo de ensayos de la seguridad química Detección y biología de sistemas de generación de datos

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.