We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons <ol><li> Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d&#39;expression contenant l&#39;ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1). </li><li> Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d&#39;ADN démontrant A260 / 280 et A260 / 230 des valeurs supérieures à 1,8 sont généralement considérés comme de bonne qualité. A260 / 280 valeurs inférieures peuvent indiquer une contamination de la protéine, tandis que la baisse A260 / 230 valeurs indiquent les impuretés avec des sels ou un peu de solvant tel que le phénol. Concentration de plasmide recommandée est de 1-3 pg / pl. </li><li> Produire lentivirus pour transductions comme décrit dans les protocoles précédemment publiés 11. Induction de SE avec un potentiel pan-myéloïde nécessite co-expression de ETV2 et GATA1 ou ETV2 et GATA2.Induction de SE avec un potentiel erythro- et mégacaryocytes nécessite GATA2 et TAL1. L&#39;addition de LMO2 améliore de manière significative le rendement en cellules érythro-mégacaryocytaire de hPSCs en présence de 10 GATA2 et TAL1. </li></ol> 2. hPSCs Protocole Culture <ol><li> Cultiver des cellules souches pluripotentes en colonies serrées avec des arêtes vives à 70-80% de confluence avant repiquage. Mark et retirer spontanément différenciées colonies avant passage de cellules. </li><li> Diluer gel commercial de la matrice extracellulaire (voir le tableau 2) selon les instructions du fabricant et des plaques à 6 puits couche pendant une nuit à 4 ° C ou pendant au moins 1 heure à 37 ° C avant utilisation. Avant de passage de cellules, aspirer la matrice, ajouter 2 ml de milieu de culture commerciale complète frais (voir le tableau 2) et de garder les plaques à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes pour l&#39;ensemencement. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate moyen d&#39;un puits de confluence d&#39;une plaque à 6 puits avec hPSCs et ajouter 1,5 ml de solution dispase II préchauffé (2 mg / ml dans du DMEM / F12, stérilisé par filtration à travers des filtres de 0,22 um). Incuber pendant 5-7 minutes à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu&#39;à ce que les bords des colonies commencent à se soulever de la surface. </li><li> Aspirer solution Dispase II et se laver soigneusement les colonies à deux reprises par l&#39;ajout puis aspirer 2 ml de milieu DMEM / F12 frais. Puis, en utilisant un 5 ml sérologique pipette en verre, dissocier hPSCs avec 3 ml de milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) par pipetage suspension cellulaire monter et descendre plusieurs fois. </li><li> Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits contenant 1,5 ml de milieu de culture complet commerciale (voir le tableau 2). Agiter la plaque arrière et de droite à gauche à plusieurs reprises pour assurer une répartition uniforme des cellules où situer la plaque dans l&#39;incubateur. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pour une8-24 h. </li><li> La prochaine moyen de changement de jour dans un milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) et d&#39;examiner hPSCs morphologie. Résultats de passages réussis dans de petites colonies, bien attachés retenue HPSC morphologie. hPSCs doivent être nourris avec 2,5-3 ml par puits freshmedium sur une base quotidienne et un passage tous les 4-5 jours à pas plus de 70-80% de confluence. REMARQUE: si hiPSCs ont été maintenues sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ils doivent être transférés à des conditions exemptes d&#39;alimentation et des passages 2-3 fois avant transduction pour assurer la différenciation efficace. </li></ol></li></ol> 3. Induction de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (jour 0, la transduction du hPSCs) <ol><li> Pour préparer le milieu de réaction combiner 1,3 ml de milieu sans sérum complète commerciale (voir le tableau 2), le virus, polybrène, et l&#39;inhibiteur de ROCK Y27632 (tableau 1): ajouter 1,3 pi d&#39;inhibiteur de ROCK 10 mM à 1,3 ml de milieu à une concentration finaletion de 10 uM, et de polybrène à une concentration finale de 6 ug / ml. <ol><li> Ajouter une quantité appropriée de concentré (s) virale à une concentration finale de 0,5 à 1,0 MOI (multiplicité d&#39;infection) de chaque virus par cellule. Garder milieu réactionnel sur de la glace ou à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la suspension cellulaire unique est prêt. REMARQUE: La même quantité de virus pour chaque MOI dans la GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, et des mélanges de GATA2 / TAL1 / de réaction de LMO2 est optimale pour l&#39;induction de la différenciation. Cultures Toutefois, dans ETV2 / GATA2 transduites doublement MOI pour GATA2, par rapport à ETV2, améliore la différenciation. Par conséquent, pour ces cultures, le ratio 1: 2 pour MOI de ETV2 et une MOI de GATA2 est recommandée (par exemple, si le concentré viral est estimé à environ 6,8 x 10 7 particules / ml, ajouter 10 ul de ETV2 et 20 ul de GATA2 concentrés viraux à 0,68 x 10 6 cellules par une seule réaction ETV2 / GATA2 dans un 35 mm et d&#39;une plaque de 6 puits). </li></ol></li><li> Préparer hPSCs en une seule susp cellulaireension. <ol><li> Cultivez hPSCs dans des conditions exemptes de cellules nourricières, comme décrit dans la section 2. Le jour 4 suivant le dernier passage, observer la densité cellulaire et de morphologie sous un microscope inversé. hPSCs doivent croître en colonies serrées avec des arêtes vives, sans différenciation spontanée et atteindre ~ 60-70% de confluence le jour de la transduction. </li><li> Aspirer le milieu, ajouter 1,5-2 ml de réactif commerciale de dissociation cellulaire (tableau 1) par puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 5-7 min. </li><li> Recueillir des cellules dans des volumes égaux de milieu complet commerciale (voir le tableau 2) avec 10 uM de l&#39;inhibiteur de ROCK, compter les cellules et de déterminer la viabilité. Pellet cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les cellules dans un milieu complet commerciale avec 10 uM de l&#39;inhibiteur de ROCK à une concentration de 3.4-5 x 10 6 cellules par ml. NOTE: La viabilité des cellules est essentiel pour la transduction virale réussie et la différenciation ultérieure.Généralement, la viabilité des cellules avant la transduction doit être supérieure à 90%. </li></ol></li><li> Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire, contenant 0.68-1 x10 6 cellules, dans 1,3 ml du milieu de réaction préparé en 3.1. </li><li> Aspirer la solution de la matrice de la plaque de 6 puits revêtu nuit préparé en 2.2., Transférer le mélange de réaction à un puits d&#39;une plaque à 6 puits et distribuer les cellules uniformément. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 24 heures. Après 24 h au moins 80% des cellules doit être fixé à la matrice. </li></ol> 4. Induction de Hematoendothelial précurseurs de hPSCs (Jour 1-7) <ol><li> 24 heures après la transduction, éliminer le milieu contenant le virus et laver les cellules attachées avec un milieu de culture cellulaire incomplète commerciale (voir le tableau 1), puis ajoutez 3 ml par puits de milieu de culture cellulaire incomplète commerciale contenant des cytokines hématopoïétiques: EFC 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml (ci-après dénommé 3F-moyen). </li><li> Remplacer milieu total avec des produits frais 3F-moyen les jours 2, 3 et 4 jours pour éliminer les cellules mortes et les débris. Après le jour 4, lorsque les cellules hématopoïétiques flottantes apparaissent, remplacer la moitié de la 3F-support tous les jours tout en conservant le volume total à 4 ml. NOTE: pSIN-EF1 plasmides d&#39;expression lentiviral incorporent gène de résistance à la puromycine permettant ainsi une sélection positive des cellules transduites. Le 1 ug / ml de puromycine peut être ajouté au milieu au cours des 1-2 premiers jours de différenciation pour éliminer les résiduels des hPSCs indifférenciées. </li><li> Observez la morphologie des cellules le jour 4 sous un microscope inversé: grappes serrées de cellules ayant une morphologie typique endothéliale commencent à apparaître (Figures 2A, 3A). Globules ronde apparaît du jour 5 au jour 7 de la différenciation, tandis que certaines régions peuvent conserver hPSCs morphologie. Analyser HE et différenciation hématopoïétique tel que décrit ci-dessous. REMARQUE: différente hematoendothelial réussieiation se traduit par la production de cellules sanguines qui apparaissent comme des cellules rondes réfractiles attaché de manière lâche aux cellules endotheliales planes sous-jacents. Ces cellules prolifèrent activement à former de petits agrégats, et finalement se détacher et flotteur (Figures 2A et 3A). Cellules sanguines vivantes peuvent être distingués visuellement des cellules mortes et mourantes en fonction de leur capacité à réfléchir la lumière et se développer dans des conditions de culture. </li></ol> 5. Analyse des Hemogenic endothélium (HE) stade de différenciation. <ol><li> Détecter la formation de SE entre les jours 3 et 4 de différenciation par l&#39;observation microscopique des cellules ayant une morphologie endothéliale. Il n&#39;y a pas de globules flottants dans la culture à ce stade de différenciation. La présence de SE peut être confirmée par coloration immunofluorescence et de débit analyse cytométrique en utilisant des anticorps VE-cadhérine, CD73, CD226 et CD43. <ol><li> Pour évaluer la formation HE par les cellules de l&#39;utilisation de l&#39;analyse de cytométrie en flux au jour 3et quatre jours d&#39;une expérience. Recueillir les cellules par incubation de cultures avec commercial réactif de dissociation cellulaire (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2 et ensuite utiliser jusqu&#39;à 1 x 10 5 cellules par réaction de coloration (cytométrie de flux procédure de coloration décrit dans 12). REMARQUE: VE-cadhérine + HE cellules acquièrent expression de début hématopoïétique marqueur CD226, mais manque l&#39;expression de CD73 et CD43 6. En revanche, les cellules ES non-expriment CD73 (figures 2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunofluorescence pour HE HPSC dérivés. <ol><li> Laver la monocouche attachée de cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) et fixer ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde 4% entre 30 et 60 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules à nouveau avec du PBS puis perméabilisent utilisant 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules dans du PBS à deux trois fois, puis incuber àun tampon de blocage consistant en PBS avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de 30 à 120 min. </li><li> Préparer la solution de coloration, contenant à la fois des anticorps primaires (1: 1000 dilution) de souris CD43 anti-humain de lapin et anti-VE-cadhérine humaines dans du PBS avec 5% de FBS, (tableau 1). </li><li> Aspirer le tampon de blocage à partir des cellules et ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration avec les anticorps primaires a été ajoutée; incuber 3 heures à température ambiante, ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois en ajoutant 2 ml de PBS avec 5% de FBS. </li><li> Préparer un deuxième tampon de coloration, contenant des anticorps secondaires à dilution 1: 500 dans du PBS avec 5% de FBS: âne anti-lapin conjugué à un colorant fluorescent vert, et anti-souris conjugué à un colorant fluorescent rouge (Tableau 1). Ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration secondaire et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver trois fois avec du PBS sans sérum. Cellules tache avec une solution 300 nM DAPI travail en DH2 O pendant 10-15 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS deux fois et ajouter 2-3 ml de PBS dans le puits avec des cellules colorées. Observer la fluorescence avec des filtres de microscope vert, rouge et bleu. </li></ol></li></ol> 6. Analyse des précurseurs hématopoïétiques induits <ol><li> Maintenir des cultures de cellules flottantes jusqu&#39;à ce que la différenciation se dilatent de manière significative, jusqu&#39;à 10-14 jours, en changeant la moitié de la 3F-moyen, tel que décrit au paragraphe 3.1, tous les deux jours. </li><li> Dissociation de différenciation et de recueillir des monocouches de cellules par traitement de cellules avec un réactif de dissociation cellulaire du commerce (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Effectuer cytométrie de flux utilisant des anticorps anti-VE-cadhérine, anticorps CD43 et CD45 pour évaluer l&#39;hématopoïèse dans les cultures 12. Notez qu&#39;une fraction importante de cellules, jusqu&#39;à 40% des cellules ETV2 et GATA2 transduites, co-exprime VE-CAD et CD43. Les anticorps suivants peuvent être utilisés pour détecter des lignées cellulaires spécifiques suivantes eXpansion ou la différenciation des progéniteurs sanguins induites: CD235a (cellules érythroïdes), CD41a (mégacaryocytes), CD32 (tous les types de cellules myéloïdes), CD66b (neutrophiles) et CD163 (macrophages). </li><li> Effectuer CFC-dosage clonogénique en utilisant un milieu commercial (Tableau 1) selon les instructions du fabricant. <ol><li> Transfert 1-2 x 10 4 cellules dans 3 ml de milieu donogene commerciale (voir tableau 3) pour évaluer le nombre de cellules et de types de colonies hématopoïétiques formant colonie. Densité d&#39;ensemencement optimale permet l&#39;identification et l&#39;isolement de colonies uniques qui se développent indépendamment les uns des autres et ne se chevauchent pas. La densité de semis peut varier entre les expériences en fonction de l&#39;efficacité de différenciation, mais ne devrait pas dépasser 1 x 10 4 cellules par 1 ml de milieu donogene commerciale. </li><li> Mélanger cellules dans un milieu donogene commerciale par tourbillonnement doux, et transférer 3 ml de suspension à deux 35 mm des plats ultra-faible attachementpour le dosage de CFC, 1,5 ml de suspension à chaque plat. Distribuer uniformément milieu et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 14 jours. Éviter de perturber les plats; observer la formation de colonies sur les jours 7 et 10 de dosage. </li><li> Identifier et compter les colonies hématopoïétiques selon leurs morphologies sur 14 jours. </li></ol></li></ol>

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IS est un actionnaire fondateur et consultant pour Cynata.

La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu&#39;à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes 10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP 10. Au cours de la ...

La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d&#39;auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l&#39;embryon produit à partir de l&#39;endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale 1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d&#39;étudier les mécanismes moléculaires régulant l&#39;endothélium à la transition hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Les méthodes actuelles pour les études de SE sont basés sur l&#39;induction de la différenciation dans les agrégats hematoendothelial (EBS) avec l&#39;ajout de cytokines hématopoïétiques 3-5, et de co-culture avec des cellules hPSCs stromales hématopoïèse-6,7 de soutien ou dans des cultures en deux dimensions avec extracellulaire et c matricesytokines 8,9. Ces méthodes classiques de différenciation sont basées sur l&#39;introduction de signaux externes agissant à la surface de la cellule et d&#39;initier des cascades de voies moléculaires qui conduisent finalement à l&#39;activation du programme de transcription orienter le développement hematoendothelial. Ainsi, l&#39;efficacité de hPSCs différenciations dans ces systèmes repose sur une induction efficace de ces signaux, la transduction du signal vers le noyau, et l&#39;activation résultant de régulateurs transcriptionnels spécifiques. En outre, l&#39;étude de SE dans les cultures de différenciation classiques nécessite l&#39;étape supplémentaire consistant à isoler des cellules SE en utilisant le tri de cellules. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l&#39;induction directe de SE et de sang par la surexpression de facteurs de transcription hématopoïétiques. Cette méthode permet l&#39;induction efficace de SE dans un plat et l&#39;observation directe de l&#39;endothélium à la transition hématopoïétique, sans la nécessité pour l&#39;isolation des SE en utilisant une procédure de tri cellulaire encombrant. Formation de SE et de sang à partir de cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement induites par la surexpression seulement quelques facteurs de transcription (FT). La combinaison optimale de TFS capables d&#39;induire robuste hématopoïèse pan-myéloïde de hPSCs comprend ETV2 et GATA1 ou GATA2. En revanche, la combinaison de GATA2 et TAL1 induit erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmation hPSCs par la surexpression de ces facteurs différencie hPSCs directement à la VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellules qui acquièrent progressivement le phénotype hématopoïétique défini par l&#39;expression du début hématopoïétiques CD43 marqueur 7. Cette méthode basée lentivirus pour la programmation directe de pluripotentes méthode des cellules souches humaines est applicable pour la génération de SE et de cellules sanguines pour des études mécanistes, des études de l&#39;endothélium à la transition hématopoïétique, et la régulation transcriptionnelle du développement hématopoïétique et la spécification. Bien que le cprotocole de dusyst décrit la production de sang en utilisant une expression constitutive des transgènes, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant l&#39;ARNm modifié 10.

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61061</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61063</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61064</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">A11105-01</td>
			<td rowspan="2">Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 Custom formulation&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>MCF</td>
			<td><a name="RANGE!D12">Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>Research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-cad) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560411</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>338305</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560199</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5795A</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555485</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Live/Dead assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Cell fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML&#160;</td>
			<td>Permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD43</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551457</td>
			<td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td>
			<td>BenderMedSystem</td>
			<td>BMS158</td>
			<td>Primary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-486-152</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-516-150&#160;</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nucleic acid stain</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>D1306&#160;</td>
			<td>Live/Dead assay (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td>CFC-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Stain solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32857</td>
			<td>Staining cytospins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table 2. hPSCs culture.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td>
			<td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 media&#160;&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>M500&#160;</td>
			<td>Serum-free&#160; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences/ Corning&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder&#160;</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>12500-062</td>
			<td>Basal Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s PBS powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dSH30013.04</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dispase II, powder</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">17105-041</td>
			<td rowspan="2">Neutral protease, Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer&#39;s Name</td>
			<td>Forward (Fwd)&#160; 5&#8217; --&#62;3&#8217;</td>
			<td>Reverse (Rev) 5&#8217;--&#62;3&#8217;</td>
			<td>Discription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN EF1a Fwd</td>
			<td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td>
			<td>--</td>
			<td>EF1a promoter sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETV2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&#160;</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l&#39;endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l&#39;endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l&#39;induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu&#39;une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L&#39;ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l&#39;induction de hPSCs et permet l&#39;observation de l&#39;endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l&#39;analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.

Le schéma de SE et l&#39;induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu&#39;un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hé...

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Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K vues.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

Vidéo: Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Recherche

Biologie du développement

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.