Wir möchten für die Unterstützung danken, die Verwaltungspersonal CIBIO (Universität Trient) und CNR Neuroscience Institute. Giovanni Provenzano wird von einem Post-Doc-Stipendium Fondazione Veronesi (Mailand, Italien) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (PRIN 2008 Grant # 200894SYW2_002 und PRIN 2010-2011 Stipendium # 2010N8PBAA_002 zu YB), Universität Trento (CIBIO Gründungszuschuss zu YB) und Telethon Foundation (Grant # GGP13034 finanziert YB).

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt und wurden von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt. 1. Tierpflege, Wohnen und Behandlung <ol><li> Führen Sie alle Versuchsprotokolle unter Verwendung von Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege. </li><li> Pflegen Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung. </li><li> Haus die Mäuse in Gruppen von 2-4, in Standardgröße Polycarbonat Mauskäfige mit Sägemehl und Einstreu werden wöchentlich gewechselt. </li><li> Verwenden Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse, weil die Anfälligkeit für Krankheiten können mit Alter und Geschlecht in verschiedenen Mausmodellen für neurologische Entwicklungsstörungen variieren. </li><li> Wählen einer geeigneten Anzahl von Tieren, statistische Signifikanz (ein Minimum von 10 Mäusen pro Genotyp für Verhaltensstudie und 4 Mäuse pro Genotyp für die Immunhistochemie Experiment) zu erreichen. </li></ol> 2. Morris Water Maze (MWM) <ol><li> Verwenden Sie ein Rundbecken (Durchmesser 100 cm, Höhe 50 cm). <ol><li> Platzieren Sie einige visuelle Hinweise auf den Raumteiler um den Behälter. </li><li> Legen Sie eine 10 cm Plattformdurchmesser in den Behälter an einer festen Stelle in der Mitte von einer der vier gedachte Quadranten. Halten Sie die versteckte Plattform im selben Quadranten für alle Studien in allen Trainingseinheiten. </li><li> Füllen Sie den Pool mit Leitungswasser, bis die Plattform 1 cm über der Wasseroberfläche. Äquilibrieren Wassertemperatur sollte möglichst nahe bei 22 ° C sein; Dieser Schritt kann mehrere Stunden dauern. In heißem Wasser, um den Zeitaufwand für die Wassertemperatur ins Gleichgewicht zu verkürzen. </li><li> In ca. 1,5-2 l weiß, ungiftige Farbe das Wasser undurchsichtig zu machen. </li></ol></li><li> Spuraufnahmeverfahren <ol><li> Einrichten MWM-Tracking-System mit Standard-CCD-Kameras und Video-Boards. Wählen Sie ein Video-Tracking-System zur Überwachung und Analyse mehrerer Variablen wie Weglänge, escape Latenz und Zeit in jedem Quadranten verbringen. </li><li> Teilen Sie die Arena in vier Quadranten und passen Erkennungseinstellungen, um eine optimale Kontrast zwischen Tieren und Hintergrund für die Live-Tracking zu gewährleisten. </li><li> Geben Sie den Plattformbereich. </li><li> Stellen Sie die maximale Probezeit als 60 Sek. </li></ol></li><li> MWM Testing <ol><li> Vor Verhalten Tests erlauben Mäusen eine Anpassungszeit von 20-25 min in einem Gebiet, wo sie nicht sehen können den Pool oder den räumlichen Informationen. </li><li> Trainieren Sie jede Maus für 9 Tage (zwei aufeinander folgenden Prüfungen am Tag, mit 20-30 min Abstand zwischen ihnen). </li><li> Schalten Sie den Computer und die Kamera ein und starten Sie das Video-Tracking-System-Software. </li><li> Nehmen Sie die Maus am Schwanz und legen Sie sie in das Wasser, mit dem Kopf wies auf die Seite des Pools, ausgehend von einer der vier Startpositionen (Nord, Süd, Ost, West). Für jede Maus, sollte die Startposition und in verschiedenen Studien pseudorandomized sein. </li><li> Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach dem Plattform für maximal 60 sec. Sobald das Tier die Plattform erreicht, lassen Sie es auf der Plattform 20 Sekunden bleiben. </li><li> Wenn der Maus konnte die Plattform innerhalb dieser Zeit finden, sanft in die Maus, um die Plattform, wobei sie an den Schwanz und lassen Sie ihn dort für 20 Sekunden zu bleiben. Sobald das Tier alle zwei Studien abgeschlossen, trocknen Sie es mit einem Tuch und legen Sie sie zurück in Käfig. </li><li> Jeder Tag der Ausbildungszeit, wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2.3.4-2.3.6). </li><li> Führen Sie den Sondentest am 9. Tag nach der letzten Trainingspfad. </li><li> Entfernen Sie die Plattform aus dem Pool. </li><li> Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach der Plattform für maximal 60 sec. </li><li> In regelmäßigen Abständen überprüfen Sie die Wassertemperatur, so dass sollte es die gleiche (22 ° C), und reinigen Sie den Pool. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Abschnitten aus perfundierten Tiere <ol><li> Opfern die Mäuse am Ende der MWM. Vier Mäuse pro Genotyp muss vor betäubt zu werden euthanization nach lokalen und internationalen Richtlinien. </li><li> Perfusion des Tieres transkardial (cut das Recht auriclewith scheren Blutung zu ermöglichen und die Einführung einer Flügelkanüle in den linken Ventrikel zu perfundieren) mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 4-5 min, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-15 22 min. </li><li> Sezieren und post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden. </li><li> Legen Sie die Gehirne in 50 ml Polystyrol konische Röhrchen mit 15 ml 0,02% Natriumazid in 0,1 M PBS und bei 4 ° C bis zum Schneiden erforderlich. </li><li> Schneiden Sie und entfernen Sie das Kleinhirn vor Vibratom Schneiden. </li><li> Kleben Sie das Gehirn aufrecht mit der Schnittstelle, mit Sekundenkleber, auf die Halteplatte der Vibratom. </li><li> Schneiden Sie das Gehirn in 20-40 um dicke Koronalschnitte, in serieller Reihenfolge in den dorsalen Hippocampus, auf entsprechende Vibratom. </li><li> Sammeln Vibratom Scheiben mit einem Pinsel und in ein 24 Multi-Well-Platte mit 1 ml 0,1 M PBS für jeden gut. </li><li> Shop Sektionen für kurzfristige in PBS oder langfristig in 0,02% Natriumazid in PBS bei 4 ° C (Gewebe könnte für bis zu einem Jahr) eingesetzt werden. </li></ol> 4. Immunhistochemie <ol><li> Transfer 3-5 dorsalen Hippocampus-Abschnitte für jede Maus in 24-Multiwell-Platte, die 500 ul 0,1 M PBS für jede Vertiefung. </li><li> Waschen Sie die in jeder enthaltenen Abschnitte auch mit 500 ul 0,1 M PBS (5 min, 3-mal mit leichtem Schütteln). </li><li> Stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubieren Abschnitte in 1% H 2 O 2 in PBS für 20 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min). </li><li> Permeabilisierung Gewebe: inkubieren Abschnitte für 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS. </li><li> Während der obigen Schritte (4.4; 4.5), stellen genug Blockierungspuffer (10% Ziegenserum und 0,1% Triton-X100 in PBS) für das gesamte Experiment (number der Abschnitte x 100 ul x 3 Stufen). </li><li> Anmerkung: Die Verwendung Serum von derselben Spezies, in denen die sekundären Ab (an Biotin konjugiert) gemacht wurde. </li><li> Verhindert die unspezifische Bindung des Antikörpers durch Inkubieren Abschnitte in Blocking-Puffer (100 &amp; mgr; l / Schnitt) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln. </li><li> Inkubieren Abschnitte in primären Ab (pERK) in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren verdünnt. </li><li> Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min). </li><li> Inkubieren mit dem sekundären Ab mit Biotin (1: 250) konjugiert in Blockierungspuffer verdünnt, für 1 h bei RT unter leichtem Rühren (das gleiche wie in Schritt 4.6 verwendet wird). </li><li> Vorbereitung ABC Reagenz gleichzeitig, weil Avidin und Biotin sind mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur bis komplex. </li><li> Bereiten Sie das erforderliche Volumen des ABC-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min). </li><li> INCUBATe Schnitte für 45 min bei RT mit ABC-Reagenz. </li><li> Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min). </li><li> Bereiten DAB Arbeitslösung muss jeder Schritt, der DAB im Abzug durchgeführt werden, wie DAB ist karzinogen und teratogen. </li><li> Übertragen DAB-Lösung auf eine neue Platte mit Kunststofftransferpipette. </li><li> Platz Abschnitte in der Platte, die DAB-Arbeitslösung und langsam Wirbelplatte mit der Hand, um maximale Exposition gegenüber Abschnitten zu ermöglichen. </li><li> Überwachen DAB Reaktion auf Mikroskop, bis eine ausreichende Signal entwickelt (2-5 min). </li><li> Die Reaktion bei der gewünschten Farbintensität, die durch das Waschen des Gewebes in 0,1 M PBS (3 x 5 min). </li><li> Bleichmittel verwenden, um alle verbleibenden DAB Substratlösung im Abzug über Nacht ausschalten und entsorgen Sie es nach den Laborrichtlinien. </li><li> Berg Abschnitte auf Gelatine beschichtete Objektträger durch schwimmende in PBS. Dann trocknen Sie sie bei Raumtemperatur mindestens 3-4 Stunden. </li><li> Die Abschnitte der Reihe nach zu entwässern in 50%, 70%, 95%und 100% Ethanol für jede 2 min, und klar, in 100% Xylol für 5 min. </li><li> Deckglas mit Eindeckmedium und lassen in Abzug über Nacht trocknen. </li></ol> 5. Cell Count <ol><li> Zählen pERK-positive Zellen sollte drei vor fünf Abschnitte auf dem Niveau des dorsalen Hippocampus pro Tier analysiert werden. </li><li> Erwerben Sie mehrere Hellfeld-Bilder von jedem Abschnitt bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung eines geeigneten Mikroskop und dann montieren sie mit einer Bildbearbeitungssoftware. </li><li> Führen Zellzahlen auf tiff-umgewandelt Mosaikbilder mit dem ImageJ freie Software. </li><li> Zählen pERK-gefärbten Zellen im Hilus und Körnerzellschicht über zwei bis drei Kästen von 100 × 100 &amp; mgr; m jeder Zählung. </li><li> Zelldichten, wenn die Anzahl markierter Zellen pro Zählung Fenster (100 x 100 um) ausgedrückt werden. </li><li> Statistische Analysen zu signifikanten Unterschied zwischen den Genotypen zu bewerten. Dies kann mit Student-t erreicht werdenTest oder ANOVA, gefolgt von entsprechenden Post-hoc-Test unter Verwendung von kommerziellen Software. Legen statistische Signifikanzniveau bei p &lt;0,05. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder.">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li><li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+broader+phenotype+of+autism:+genetic,+brain,+and+behavioral+perspectives.">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li><li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Immunhistochemie pERK enthüllt neuronale Aktivierung folgt MWM in En2 - / - Mäuse, ein Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. / - - Erniedrigte pERK wurden in der CA3 Teilgebiet der En2 erkannt Mutanten im Vergleich zu WT. Anders, als in CA3 Unterfeld, eine allgemeine Erhöhung der pERK-positiven Neuronen beobachtet stattdessen sowohl hilus erkannt und GCL von En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT. Eine mögliche Erklärung für die...

Neurologische Entwicklungsstörungen umfassen eine große und heterogene Gruppe von Erkrankungen wie das Down-Syndrom, fragile X-Syndrom (FXS), Rett-Syndrom, Neurofibromatose, tuberöser Sklerose und ASD, in dem die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) wird früh während gestört der pränatalen Phase 1. Diese Entwicklungsfunktionsstörungen des Gehirns können tiefe, lebenslange Auswirkungen auf die Motorik, Sprache, Lernen und Gedächtnis-Prozess führen. Eine Vielzahl von genetischen und Umweltfaktoren bei der Pathogenese von Störungen der neurologischen Entwicklung während der letzten Jahre 2,3 gebracht. Auch wenn die molekularen Mechanismen, die klinische Phänotyp zugrunde liegenden unbekannt bleiben, haben die oben genannten Erkenntnisse die Entwicklung von mehreren Mausmodellen dieser Erkrankungen erlaubt. Lern- und Gedächtnisdefizite in einer Reihe dieser Mausmodelle wie Tsc1 +/-, Tsc2 +/- identifiziert worden ist,Nf1 +/- und En2 ​​- / - Mäusen 2,4-7. Eine wichtige Herausforderung auf dem Gebiet der Neuroentwicklungsstörungen ist die Identifizierung von zellulären und molekularen Prozesse zugrunde liegenden Speicher und Lernstörungen. Ausgewählte Signalwege während der Lern- oder Speicher aktiviert die Transkription bestimmter Gene zu induzieren und schließlich zur de novo Proteinsynthese führen. Immediate-Early-Gene (IEGs) Aktivierung und Protein-abhängige synaptische Modifikationen schnell in Gehirnneuronen als Reaktion auf neuronale Aktivität und Verhaltenstraining 8,9 induziert. Defizite in der Signalwege mit neurofibromin haben mit dem Lernen in neurologische Entwicklungsstörungen beeinträchtigt Verbindung gebracht. Neurofibromin ist das Produkt aus dem NF1-Gen, dessen Mutation Neurofibromatose Typ 1, einem komplexen genetischen Syndrom mit Tumoren des Nervensystems, Verhaltens- und Motor verzögert und kognitive disakeiten 10. Mäuse heterozygot für Nf1 Löschung zu hemmenden Nervenzellen beschränkt Defizite in der Frühphase der Langzeit-Potenzierung (LTP) sowie kompromittiert räumlichen Lernen in MWM 5,11,12. Interessanterweise Nf1 Mangel in diesem Mausmodell führt zu einer Überaktivierung des Ras-Signalisierung in hemmenden Inter während des Lernens, was zu erhöhten ERK-Phosphorylierung und schließlich in einer abnormalen Steigerung der GABA-Freisetzung aus diesen Neuronen 5. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, die Visualisierung der neuronalen Aktivität nach Verhaltens Aufgaben stellt eine Möglichkeit, bestimmte Schaltungen in der Entwicklung des Nervenerkrankungen beteiligt rekonstruieren. Die hier beschriebene Immunhistochemie Protokoll zielt darauf ab, zu bewerten und zu quantifizieren Hippocampus ERK Phosphorylierung folgenden MWM in einem ASD Mausmodell mit kognitiven Defiziten. MWM wird häufig zur hippocampalen abhängigen räumlichen Lernen und Gedächtnis bei Nagetieren 13,14 untersuchen </sup&gt;. Wir entscheiden uns, ERK-Phosphorylierung als Molekular Auslesen aufgabenabhängige hippocampalen Lernen verwenden, da ERK wurde gezeigt, dass eine wesentliche Rolle bei Lern- und Gedächtnisbildung 15 haben. Darüber hinaus ist die ERK Weg für erfahrungsabhängige Plastizität im Entwicklungs Sehrinde 16 notwendig. Schließlich Mäusen fehlt einer der beiden ERK Isoformen (ERK2) im ZNS zeigen deutliche Anomalien in kognitiven, emotionalen und sozialen Verhaltensweisen, 17, die anzeigt, dass ERK-Signal könnte eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Neuroentwicklungsstörungen wie ASD zu spielen. Wir verwendeten Engrailed 2 knockout (En2 - / -) Mäusen als Modell für neurologische Entwicklungsstörungen. En2 - / - Mäuse zeigen anatomische und Verhaltens &quot;ASD-like&quot; Funktionen, einschließlich Verlust von Vorderhirn Inter 18, verminderte Expression von ASD-verwandte Gene 19, verringert Geselligkeit und Beeinträchtigung der kognitiven Flexibilität 6,7,20. Spatial learning und Gedächtnisstörungen, wie sie in der MWM erkannt, sind in En2 besonders robust - / - Mäusen 6,7 und möglicherweise relevant für die ASD-Patienten in 21 beobachteten kognitiven Beeinträchtigungen werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine beeinträchtigte räumliche Lernen in MWM mit reduzierten neurofibromin Expression und erhöhter pERK Spiegel im Hilus En2 - / - erwachsenen Mäusen 7. Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für die immunhistochemischen Charakterisierung pERK folgenden MWM in diesem ASD-Mausmodell.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

Die Induktion der extrazellulären phosphoryliert-regulierten Kinase (pERK) ist ein zuverlässiges Auslesen der molekularen Lernabhängige neuronale Aktivierung. Hier beschreiben wir ein Perk Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir pERK Immunfärbung auf neuronale Aktivierung zu studieren folgenden Morris-Wasserlabyrinth (MWM, ein klassisches Hippocampus-abhängige Lernaufgabe) in Engrailed-2-Knockout (En2 - / -) Mäusen, einem Modell des Autismus-Spektrum-Störungen (ASD). Im Vergleich zum Wildtyp (WT) steuert, En2 - / - Mäuse zeigten eine signifikante räumliche Lernen Defizite in der MWM. / - - Nach MWM wurden signifikante Unterschiede in der Anzahl von pERK-positiven Neuronen in spezifischen Unterfelder hippocampalen En2 detektiert Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren. So kann unser Protokoll robust Schiede erkennenpERK-positiven Neuronen zu Hippocampus-abhängige Lernwertminderung in einem Mausmodell der ASD verbunden. Allgemeiner kann unser Protokoll angewandt werden, um das Profil des Hippocampus Aktivierung sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite zu untersuchen.

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um sichtbar zu machen, mittels Immunhistochemie die Expression eines spezifischen Marker der Hippocampus-Neuronen-Aktivität nach MWM in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. Alle hier gezeigten experimentellen Daten wurden von unserer jüngsten Arbeiten 7 übernommen. Männliche und weibliche WT und En2 ​​- / - gleichaltrigen Erwachsenen Wurfgeschwistern (3-5 Monate alt, Gewicht = 25-35 g) aus heterozygoten Verpaarungen er...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Aufrufe.  University of Trento.  Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden. 

Serie: Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

Mit MazeSuite und Functional Near Infrared Spectroscopy man Lernen in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach<em&gt; In-Vitro</em&gt; Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Die Beurteilung räumliches Lernen und Gedächtnis in Klein squamate Reptilien

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.