This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den vom Ausschuss für Tierforschung an der Veterans Affairs Palo Alto Gesundheitswesen genehmigt ethischen Standards durchgeführt. 1. Golgi-Cox Färbung <ol><li> Gehirn-Extraktion und Färbung <ol><li> Am 1. Tag, tief betäuben Mäusen mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin vor euthanizing über Ausbluten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und sezieren das Gehirn. <ol><li> Entfernen Sie zuerst die Haut auf der Oberseite des Schädels, indem eine gekrümmte Schere an der Oberseite des Kleinhirns und sanft Messer durch die Schädeldach parallel zur zentralen Sulcus mit der Spitze der Schere spitz nach außen, bewegt sich in Richtung auf den Riechkolben. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf beiden Seiten. </li><li> Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um das Schädeldach heben und drehen Sie ihn in Richtung der Riechkolben und abbrechen. Dann drehen Sie den Schädel auf den Kopf und verwenden Sie eine Abholung durch den Wellenleiter geschnittenNerven und lösen das Gehirn. Schließlich verwenden die Abholung, das Gehirn aus dem Rückenmark in der Höhe des Foramen magnum trennen. </li></ol></li><li> Sofort tauchen das Gehirn in 15 ml im Handel erhältlichen, unverdünnt Golgi-Cox-Lösung. Lagern Sie das Gehirn in Golgi-Lösung in einem verschlossenen, 20 ml Glasflasche bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Am 2. Tag, gießen Sie langsam die Lösung, und ersetzen sie durch 15 ml frisches Golgi-Cox-Lösung. Verschließen Sie die Flasche, die das Gehirn und lassen Sie ungestört für weitere 9 Tage im Dunkeln. </li></ol></li><li> Schnitte und Einbettung <ol><li> Am 11. Tag, legen Sie die Gehirne in 30% Saccharose-Lösung, in ddH 2 O für die Dehydratisierung vorbereitet. Ändern Sie die Lösung mit frisch zubereiteten 30% Saccharose nach 12 Stunden. Das Gehirn in einer 30% igen Saccharoselösung für 3 Tage Inkubation bei 4 ° C. </li><li> Am 14. Tag, füllen Sie das Reservoir des Vibratom mit einer 30% Saccharoselösung, bis die Klinge fallen. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 1 mm / s mit einer Amplitude von 0,95 mm. </li><li> Tupfen Sie die Gehirne mit einem Kimwipe um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen, und entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge zu koronal geschnitten. </li><li> Fest montieren das gesamte Gehirn auf die Vibratom-Plattform mit Sekundenkleber und lassen Sie es für 2-4 min eingestellt. Legen Sie die Plattform mit dem halten Gehirn in den Behälter und stellen Sie die Klinge an die Spitze des Gehirns. </li><li> Mit dem Vibratom, schneiden das Gehirn in 150 &amp; mgr; m dicke Schnitte bei Raumtemperatur, daran zu denken, die Klinge nach jedem dritten Gehirn verändern. </li><li> Pick-up die Abschnitte aus dem Reservoir mit einem kleinen Pinsel gekippt und tauchen sie in eine Petrischale mit 0,3% Gelatine in ddH 2 O. gemacht Während die Abschnitte in der Petrischale bleibt, fügen Sie 0,5 ml 0,3% Gelatine auf jeder Folie und mit einer Bürste verteilen und Mantel Superfrost + Rutschen. </li><li> Vorsichtig holen die eingetauchten Abschnitte aus der Petrischale und legen Sie sie auf die verkleisterte Rutschen. Richten Sie die Hirnschnitten vonberühren sie nur an den Seiten und nicht an den Spitzen. </li><li> Nach etwa zehn Minuten, Mantel die Schnitte mit 30% Saccharose, bevor das Gewebe vollständig getrocknet ist. Danach lufttrocknen Präparate an einem dunklen Ort in einem Objektträgergestell für 3 Tage. </li><li> Verdünne Handel erhältlichen 10x Entwicklungslösung auf 1x mit ddH 2 O. Tauchen Sie die Folien in Entwicklungslösung für 7-10 min. Spülen Sie die Folien 3 mal in ddH 2 O. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Es werden 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 95% Ethanol-Lösungen mit destilliertem ddH 2 O. </li><li> Weichen Sie die Folien in immer höheren Ethanollösungen für jede 10 min. </li><li> Weichen Sie die Folien in 100% Ethanol-Lösung 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Weichen Sie die Folien in 100% Xylol 3 Mal hintereinander für jeweils 5 min, wobei die Abschnitte in der endgültigen Lösung bis sie Cover-gerutscht sind. </li><li> Legen Sie eine großzügige Menge von DPX (Di-n-butylphthalat in Xylol) Eindeckmedium (abaus 1-1,5 ml) auf jeder Folie mit einem Kunststofftransferpipette. Vorsichtig Deck um Blasen zu vermeiden. </li><li> Luft trocknen Abdeckung glitt-Hirn Abschnitten horizontal für 3 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Double Färbung <ol><li> Tief betäuben (siehe Schritt 1.1.1) die Tiere. </li><li> Führen Herzperfusion mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer 12 gebildet. </li><li> Extrahieren Sie die Gehirne (siehe 1.1.2) und speichern Sie in 45 ml 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C über Nacht auf einem Schüttler. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne zu einer 30% igen Zuckerlösung und warten, bis die vollständige Dehydratisierung für 48 Stunden bei 4 ° C. Entfernen Sie die Gehirne aus Saccharose und legen Sie sie direkt auf Kupferblöcken auf Trockeneis platziert. </li><li> Füllen Sie den Block mit optimalen Schnitttemperatur (OAT) Verbindung, und markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns mit dem Riechkolben als Wahrzeichen. </li><li> Mit einem Kryostaten geschnitten 70 Mikrometer dicke Abschnitte bei -20 ºC und legen Sie siein Cryoschutzstofflösung (25% Ethylenglykol, 25% Glycerin, in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) und halten bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Machen Sie eine Lösung von 50% Gefrierschutzmittel und 50% Methanol. Zu dieser Lösung werden 0,5% Wasserstoffperoxid (vol / vol). Inkubieren schwebenden Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Warm Abschnitte in 37 ºC in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 30-40 min, indem man sie in einem histologischen Ofen. </li><li> Inkubieren der Schnitte mit 0,3% Triton und 3% normalem Pferdeserum für 45 min bei Raumtemperatur vor der Immunofärbung. Inkubiere die Abschnitte bei 4 ºC über Nacht in 3 ml Lösung des DCX Antikörper, verdünnt 1: 500 in TBS mit 0,3% Triton und 1% normales Pferdeserum. </li><li> Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte 3 Mal hintereinander in TBS (10 min jeweils). </li><li> Inkubieren Abschnitte mit biotinyliertem Pferde-anti-Ziege (1: 200 in TBS) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. 3 Mal hintereinander in TBS waschen Sie die Abschnitte (10 min jeweils). </li><li> Inkubieren tSaum mit ABC Lite (1: 1000) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Werden 5 ul 30% H 2 O 2 zu einer Tablette von 10 mg DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) in 15 ml von 1 M Tris-HCl (pH 7,6) gelöste Lösung. Die Abschnitte unmittelbar in dieser Lösung für 5 Minuten inkubieren. </li><li> Beenden Sie die Reaktion durch Waschen mit eiskaltem TBS dreimal, gefolgt von einem Waschen in TBS bei Raumtemperatur. </li><li> Entwässern Abschnitte mit einer Reihe von Ethanollösungen (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, jeweils 5 min), in Xylol klären und dann die Abdeckung Slip mit DPX wie in Schritt 1.3. </li></ol> 3. Visualisierung <ol><li> Nach vollständiger Trocknung der Teile, überschüssiges DPX oben auf den Folien mit einer scharfen Klinge, und legen Sie sie auf dem Scan-Tisch des Mikroskops. Das System besteht aus einem Mikroskop mit Scantisch, einen Joystick und einen 12-Bit-Farbkamera ausgestattet zusammensetzt. </li><li> Starten Sie das Programm. Öffnen Sie eine neue Datei. </li><li> Platzein Bezugspunkt auf dem Bildschirm, indem Sie mit dem Mauszeiger an jedem Ort. Dadurch werden alle Icons aus der Werkzeugpalette des Programmfensters zu aktivieren. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Joystick Free&quot; in der Symbolleiste und dann verwenden Sie den Joystick, um die Gyrus dentatus des Hippocampus im ersten Abschnitt zu finden. </li><li> Im Reiter im Programmfenster &quot;Extras&quot;, wählen Sie &quot;Serial Section Manager&quot;. Klicken Sie auf das Symbol &quot;Neuer Abschnitt&quot; in der linken unteren Ecke des Fensters. Das Fenster &quot;Serial Abschnitt Setup&quot; zu öffnen. </li><li> Wählen Sie die Serien Abschnitt Setup-Fenster und geben Sie die Gesamtzahl der Abschnitte, die Hippokampus-Regionen enthalten. Wählen Sie das Auswertungsintervall. Geben Sie im Abschnitt Schnittdicke (70 &amp; mgr; m für DCX und 150 &amp; mgr; m für die Golgi-gefärbten Schnitten). </li><li> Starten Verfolgung der Gyrus dentatus Region, indem Sie auf das Symbol &quot;Freihandkonturzeichnung&quot; in der Werkzeugleiste. Skizzieren Sie die dentatus körnige Zellschicht. &lt;/ Li&gt; <li> Wählen Sie &quot;100X&quot; aus dem Menü &quot;Vergrößerung&quot;. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf der Strecke und schalten Sie das Ziel, 100X. Suchen Sie die dentatus Körnerzellkörpern und Dendriten im Rahmen dieses Ziels. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf einen ausgewählten Neuron, und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neuron Tracing&quot; auf der Symbolleiste. Verfolgen Sie den Umfang des dentatus Körnerzellkörper. Wenn Verfolgung beendet der rechten Maustaste auf &quot;Fertigzellkörper&quot; zu wählen. </li><li> Starten Sie Verfolgen der Dendriten manuell in x, y und z-Richtung und folgen jeder Zweig mit dem Joystick und z-Motor-Regler. An einer Gabelung oder Trifurkation Knoten, wählen Sie die entsprechende Option im Dropdown-Menü auf der rechten Maustaste. Verfolgen Sie jeden der Zweige, die von diesen Knoten entstehen. Am Ende jeder Verzweigung rechten Maustaste und wählen Sie &quot;Beenden&quot; aus dem Dropdown-Menü. </li><li> Mit den Pfeiltastensymbole im Software-Fenster wählen Sie zufällig ein anderes dentatus Körnerzellen und folgen Sie dem gleichen Verfahren wie described in Schritt 3,9 bis 3,10. Speichern Sie die gesamte Ablaufverfolgung. </li><li> Starten Sie die neuronale Tracing-Software. </li><li> Öffnen Sie das erste NRX Datendatei von der ersten Maus der Versuchsgruppe. Hängen Sie den NRX-Datei des zweiten Maus der Versuchsgruppe. Fortfahren, bis alle NRX Dateien aus dieser Gruppe werden angehängt. </li><li> Unter der Registerkarte Analyse, wählen Sie &quot;Fan In-Diagramm&quot;. Es öffnet sich das Fan In-Analysefenster. Häkchen &quot;Dendriten&quot; und klicken Sie auf Anzeigen, die die Länge und Verzweigung Muster von Dendriten für diese Gruppe von Mäusen (Abbildung 1) zeigt. </li></ol> 4. EDFI Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht es dem Benutzer, schnell erfassen eine große Anzahl von Bildern durch die z-Achse von jedem Feld und erzeugt ein 2D-Bild, das alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse enthält. Das Ergebnis wird ein zusammengesetztes Bild, das alle fokussierten Pixel aus gesammelten Bilder enthält. <ol><li> Schließen Sie das Mikroskop in ein digitales NockenÄra. Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden und dann zu einem 10X-Objektiv zu wechseln. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse. </li><li> Starten Sie eine Video-Aufnahme-Programm. </li><li> Drücken Sie die Aufnahmetaste. Sobald der Aufnahmeknopf gedrückt wird, verwenden Sie das Makro-Fokus-Knopf, um von oben nach unten auf dem Abschnitt für insgesamt 4 Sekunden zu bewegen. Speichern Sie die Videodatei. </li><li> Verwenden ImageJ Freeware, um die AVI-Videodateien in einem unkomprimierten Format durch Öffnen der Datei und speichern Sie sie in unkomprimierte Dateiformat zu konvertieren. </li><li> Starten Sie eine Bildanalyse-Programm und öffnen Sie die AVI-Datei. Gehen Sie zum Menü &quot;Bearbeiten&quot; und klicken Sie auf &quot;Erweiterte Tiefenschärfe&quot;. Wählen Sie den entsprechenden Videodatei. Im &quot;Output&quot; Optionen wählen &quot;Geneverbund Bester-Fokus-Bild&quot;. </li><li> Im &quot;Focus Analysis&quot; Optionen, wählen Sie &quot;Normalized Illumination&quot; und &quot;Max Local Contrast&quot; Optionen. Wählen Sie dann &quot;Create &quot;. Das resultierende Bild repräsentiert alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse (Figur 2). </li><li> Speichern Sie das resultierende Bild. </li></ol> 5. Generieren Extrem-Bilder mit hoher Auflösung HINWEIS: Diese Methode erlaubt es dem Benutzer, mit geringer Vergrößerung und extrem hochauflösende Bilder von hoher Vergrößerung-Bilder mit hoher Auflösung automatisch in einer automatisierten Weise. <ol><li> Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden. Das Mikroskop ist mit einer Digitalkamera verbunden ist. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse. </li><li> Starten Sie eine Bildaufnahme-Programm. </li><li> Verwenden Sie einen 10X-Objektiv und zu erwerben, und speichern Sie hochauflösende (4076 x 3116) Bilder von der Region von Interesse achten Sie darauf, um mindestens 10% überlappen müssen. </li><li> Führen Image Composite Editor um Bilder zu nähen. </li><li> Gehen Sie zum Menü Datei, und klicken Sie auf &quot;Neues Panorama&quot;. Wählen Sie den Ordner, in dem die Bilder stverknüpft. Wählen Sie die Bilder, die auf der gleichen Region und drücken Sie &quot;OK&quot; gehören. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Export to Disk&quot; und speichern Sie das Bild. Diese Abbildung stellt eine extrem hochauflösende Bild des Bereichs von Interesse, die für die Analyse und / oder Demonstrations (Figur 3) verwendet werden könnten. </li></ol>

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Veröffentlichungskosten für diesen Artikel werden von MBF Bioscience gesponsert.

Hier wurden zwei Methoden beschrieben, um das Ausmaß der dendritischen Verzweigung in reifen und neugeborenen Neuronen mit herkömmlichen Färbemethoden in Verbindung mit RTI und EDFI quantifizieren. Die Übernahme von hochauflösenden Bildern von Neuronen ein extrem nützliches Verfahren zum Testen der schädlichen Wirkungen von neurodegenerativen Erkrankungen und wiederum stellt ein Mittel zur therapeutischen Strategien, Hippocampusneuronen Ziel beurteilen. Während die RTI-Methode wurde ...

Dynamische Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Synapsen sind die Markenzeichen der Entwicklung, Alterung, und zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen 1-3. Die Fähigkeit der Neuronen synaptische Informationen zu erhalten und zu integrieren, hängt von dendritischen Morphologie und dynamische Veränderungen synaptischer Verbindungen. Tatsächlich existiert eine positive Korrelation zwischen dendritischen Dorn und Synapsen Nummer, die sowohl die kognitiven Funktionen beeinflussen 4. So ist es nicht verwunderlich, dass Verringerungen in dendritischen Dorn Nummer haben mit kognitiven Störungen in einer Reihe von neurologischen Erkrankungen 5-7 in Verbindung gebracht, woraufhin ein großes Interesse an dendritischen Dorn Quantifizierung. Dennoch ist die Quantifizierung der Wirbelsäule Dichte bleibt eine zeitaufwendige und mühsame Aufgabe, die nützliche Informationen über die Topographie und die Verteilung von Synapsen auf der Dendritenbaum erzeugen ausfällt. Glücklicherweise Färbemethoden (zB Golgi-Cox und Double (DCX)) in Verbindungmit hoch entwickelten bildgebenden Verfahren kann eingesetzt werden, um Strombarrieren überwinden und hochaufgelöste Bilder von dendritischen Verzweigung in einem zuverlässigen und schnellen Weise. Während Golgi-Cox-Färbung eingesetzt werden kann, um den Zustand der dendritischen Verzweigung in allen Neuronen 8 beurteilen können DCX eingesetzt werden, um neugeborene Neuronen besonders im Gyrus dentatus und Subventrikularzone 9, eine wichtige Überlegung beschriften da die Neurogenese in beiden auftritt diese Regionen in der gesamten Lebensspanne 10,11. Nach der Färbung wurden zwei bildgebenden Verfahren eingesetzt werden, um dendritischen Eigenschaften zu bewerten: i) Echtzeit-Bildgebung (RTI) und ii) erweitert Schärfentiefe-Bildgebung (EDFI). Die FTI-Technik liefert eine mittlere zu verfolgen und zu quantifizieren, die Länge und die Reihenfolge der Verzweigung entlang der einzelnen dendritischen Segmente und Branchen. So ermöglicht sie es, die gesamte Fläche und Volumen von jedem dendritischen Baum besetzt schätzen. Mehr specifically im RTI Verfahren der Benutzer kontinuierlich identifiziert die Segmente und refokussiert iterativ das Neuron Spursoftware speichert die x, y und z-Koordinaten der dendritischen Struktur und rekonstruiert die Trajektorie der dendritische Struktur in 3D. Im Vergleich dazu bietet die EDFI-Methode eine ziemlich einfache und beschleunigten Mittel zur Bewertung dendritischen Dichte in ziemlich dicken Gewebeproben durch die Erzeugung eines zusammengesetzten Bildes, die Informationen über den gesamten Z-Achse. Dazu zeichnet der Anwender High-Definition-Video-Dateien über die Dicke des Abschnitts, und dann nutzt Software zu suchen, die Video-Frames, um Punkte zu identifizieren, wobei ein Pixel vollständig im Fokus. Anschließend werden die fokussierten Pixel zusammengeführt und in eine hochauflösende Bildverbund 2D integriert. Dieses zusammengesetzte Bild enthält alle Pixel, die In-Fokus unabhängig von ihrer Position in der z-Achse sind. Qualitative und quantitative Analyse dieser 2D-Bilder können anschließend verwendet werden, um die Dichte zu bestimmen,der dendritischen Verzweigungen in jedem Feld. Schließlich stellen wir ein Verfahren zum Erzeugen von Panorama extrem hochauflösende Bilder für die Analyse und Bewertung von Dendriten in einem gesamten Bereich von Interesse. Diese Technik kann eingesetzt werden, um den mangelnden Zugang zu sehr hochauflösende und teure Digitalkameras überwinden. Mit dieser Methode, eine fängt Serienbilder an verschiedenen Orten entlang der x- und y-Achsen und automatisch Stiche sie zusammen mit einer Freeware (zB Image Composite Editor). Bemerkenswerterweise kann dieses Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse der dendritischen Verzweigung nicht in einem weiten Bereich verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Das Ausmaß der Verzweigung, die aus vorhandenen und neu geboren dentatus Körnerzellen in Wildtyp-Mäusen entweder mit Golgi-Cox oder DCX-Färbung (Abbildung 1) analysiert. Dendritische Segmente DCX-positiven Zellen gefunden wurden 13-36 Micron lang. Die Normalverteilung der dendritischen Länge wurde mit Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; Figuren 4 und 5). Bei der Analyse der Länge der Segment...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Aufrufe.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Serie: Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Die Macht der Interstimulus Intervall für die Beurteilung der zeitlichen Verarbeitung bei Nagern

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen