This research was supported by the FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASC.

Alle tierexperimentellen Studien wurden vom Ausschuss der Ethik der Tierversuche des Technion genehmigt. Für dieses Verfahren wurden athymischen nackten Mäusen verwendet, um eine immunologische Abstoßung zu vermeiden. Bei Verwendung eines anderen Typs von Maus sollten die Mäuse rasiert vor dem chirurgischen Eingriff und Verabreichung von Cyclosporin (oder eines anderen anti-Abstoßung Ersatz) empfohlen werden. 1. Gerüst Vorbereitung und Handy Einbetten <ol><li> Vorbereitung Gerüste bestehend aus 1: 1-Mischung von Poly-L-Milchsäure (PLLA) und Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA), in der folgenden Weise: <ol><li> Auflösen 500 mg PLLA und 500 mg PLGA in 10 ml Chloroform. </li><li> Hinzufügen 0,24 ml Polymerlösung zu 0,4 g Natriumchlorid-Teilchen in einer Teflonformen gesammelt. Verwenden Sie einen Salzmesser von 212 bis 600 &amp; mgr; m. Lassen Sie das Chloroform zu O / N verdampfen. </li><li> Leach das Salz unter Verwendung von destilliertem Wasser führt zu vernetzten porösen 3D-Gerüsten. </li><li> Geschnitten Polymerstückemit einer Schere, dann in 70% Ethanol (v / v) einweichen für 30 Minuten und waschen 3 Mal in PBS für 2 Minuten vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Vorbereitung einer tri-Kultur der folgenden Zellen in 1: 1 Endothelzellmedium (EGM-2 mit den Komponenten seiner Kugel Kit und Muskelzellmedium (Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS ), 2,5% HEPES-Puffer, 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin (Pen-Strep-Lösung). <ol><li> Verwenden 0,5 x 10 6 C2C12 Myoblasten, 0,9 × 10 6 menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und 0,2 x 10 6 normale humane Hautfibroblasten (NHDF). </li></ol></li><li> Mischen der Zellen miteinander in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 4 min, saugt den mittleren und Resuspendieren des Pellets in einer Mischung von 4 ul eiskaltem extrazellulären Matrixlösung und 4 ul Zellmedium. </li><li> Schneiden Sie ein Stück von 10 mm x 7 mm x 1 mm (Länge x Breite x Dicke) PLLA / PLGEin Gerüst und Samen der Zellsuspension in einer Platte mit 6 Vertiefungen, lassen die extrazelluläre Matrix-Lösung zu verfestigen (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) vor der Zugabe von 4 ml Zellmedium. </li><li> Vor der Implantation die Gerüste für zehn Tage inkubieren, und ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag. </li></ol> 2. Vor dem Start des chirurgischen Eingriffs <ol><li> Vorzubereiten und zu sterilisieren (Autoklav) folgende chirurgische Instrumente: eine kleine, feine, gerade Schere, eine Feder Schere, gerade, spitzen Pinzette, einer gezahnten Pinzette und einem Nadelhalter. </li><li> Vorbereitung einer Mischung aus Ketamin: Xylazin Lösung in einem Mikrozentrifugen-Röhrchen hergestellt, indem 425 ul Ketamin und Xylazin 75 ul in einer 1 ml-Spritze. </li><li> Verdünnte 0,3 mg / ml Buprenorphin in steriler Kochsalzlösung (1,20). </li></ol> 3. Flap Construction (Graft-Implantation) <ol><li> Verwendung einer Insulinspritze, betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul pro20 g Körpergewicht). </li><li> Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) vor dem direkten Betrieb. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Bühne auf 37 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage. </li><li> Verwenden Baumwollspitzen, zu verwalten Schmieraugensalbe, um die Augen der Maus (um Austrocknung zu vermeiden). </li><li> Verwenden Baumwollspitzen, sauber die Einschnittstelle mit Jod und dann mit 70% Ethanol, um eine aseptische Arbeitsfeld zu etablieren. </li><li> Mit Hilfe von kleinen Schere und Pinzette, einen Einschnitt durch die Haut, von der Höhe der Knie bis zum Leistenband, parallel zu den Schenkelgefäße, bis der Arteria und Vena femoralis (AV) Gefäße ausgesetzt sind. </li><li> Halten Sie die Haut nach unten mit einem Aufroller, um einen besseren Zugang zu dem Gewebe zu gewinnen. </li><li> Verwendung von Feder Schere und Pinzette, sorgfältig isolieren die Arteria und Vena femoralis Gefäße aus dem umgebenden Gewebe. Starten Sie von der Ebene des Leisten ligAment zu der Bifurkation der überlegenen epigastrischen Gefäße. Verlassen Sie die profunda unberührt, um den Blutfluss in dem Bein zu erhalten und zu verhindern nachfolgende Ischämie. </li><li> Falten Sie das Transplantat (von Abschnitt 1) ​​um den freiliegenden Schenkel AV, unter dem profunda und oberhalb der Bifurkation in die Tibia und proneal AV, und kommen Sie mit seinen Enden mit 8-0 Seidenfäden. </li><li> Implantatdurchblutung durch die Kapillaren sprießen aus nur den Oberschenkel AV Schiffe zu gewährleisten, wickeln Sie ein Stück sterilisiert Latex um das Transplantat, und Naht mit 6-0 Nähten. </li><li> Schließen Sie die darüber liegende Haut mit 4-0 Seidenfäden. </li><li> Überwachen Sie die Maus, bis eng Erholung von der Anästhesie und jeden Tag danach, bis das Transplantat als Klappe übertragen. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) zweimal täglich für 2-3 Tage. HINWEIS: Verwenden Sie Kochsalzlösung in jeder Phase, um eine Austrocknung des freiliegenden Gewebes zu vermeiden. </li></ol> 4. Flap Überweisung <ol><li> An einem oderzwei Wochen nach der Implantation, zu betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul / 20 g) unter Verwendung einer Insulinspritze. </li><li> Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) vor dem direkten Betrieb. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Bühne auf 37 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage. </li><li> Verwenden Baumwollspitzen, gelten Schmieraugensalbe, um die Augen der Maus (um Austrocknung zu vermeiden). </li><li> Verwenden Baumwollspitzen, reinigen Sie die Einschnittstelle (von der Kniebereich auf den Bauch) mit Jod und dann mit 70% Ethanol, um eine aseptische Arbeitsfeld zu etablieren. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Fäden in der Haut und, mit einer Schere, einen Einschnitt durch die Haut parallel zum Leistenband, weiter durch die Bauchhaut. </li><li> Das Latex Stück mit einer Pinzette vorsichtig entfernen und setzen die vaskularisierten Lappen. </li><li> Mit Hilfe eines SCISSors und Pinzetten, sezieren die Gewebelappen aus dem umgebenden Gewebe. </li><li> Mit einer Pinzette und einen Nadelhalter, zu ligieren, das distale Ende des Oberschenkel AV mit 8-0 Seidennähten Blutungen aus dem AV zu vermeiden. Dann Kauterisieren des AV auf der Höhe des Knies, distal in die gefaltete implantierte Gewebe und dem 8-0 Nähte. </li><li> Übertragen Sie leicht den Oberschenkel AV durch das Transplantat umgeben, in Richtung des ventralen Abdominalwand, Vermeidung von Schäden an der Arterie, um zu bestimmen, an dem der Abstand der volle Dickenfehler vorgenommen werden sollen. ACHTUNG: Ziehen Sie die Arterie zu weit wird die Arterie beschädigt werden. </li><li> Mit einer feinen Schere, einen Einschnitt in der ventralen Bauchwand. </li><li> Verwendung einer Feder Schere, einen Einschnitt in der Rektusabdominis Muskel. Entfernen Sie eine ca. 1 cm x 0,8 cm Segment der Rektusabdominis Muskeln mit der darüberliegenden Haut. </li><li> Übertragen Sie die Oberschenkel AV, durch die gefäß Graft eingehüllt, als axiale Klappe, in die gesamte Dicke Defekt in der Bauch Abdominal Wand. </li><li> Naht der Klappe zu dem umgebenden Muskelgewebe, mit 8-0 Seidenfäden, um Bruch zu verhindern. </li><li> Um Nähen die inneren Organe zu vermeiden, heben Sie den Muskel mit einer Pinzette, wenn Vernähen der Klappe an der Bauchmuskulatur. Verlassen Sie die Bauchhaut, um den Effekt einer vollständigen Bauchwanddefekt imitieren ausgesetzt. </li><li> Abdeckung der Wunde in der Haut mit iodierten Gaze und einem sterilen Verband, um eine Verunreinigung der freiliegenden Bereich zu verhindern. </li><li> Naht der Haut des Beines mit 4-0 Seidenfäden. </li><li> Überwachen Sie die Maus, bis eng Erholung von der Anästhesie und jeden Tag danach, bis zum Abruf der Klappe. Subkutan injizieren Buprenorphin (Endkonzentration von 0,05-0,1 mg / kg) zweimal täglich für 2-3 Tage. </li><li> HINWEIS: Verwenden Sie Kochsalzlösung in jedem Stadium zur Dehydratisierung der freiliegenden Gewebes zu vermeiden. </li></ol> 5. Ultraschall Bestimmung des Gefäßdurchblutung der Graft HINWEIS: Vor dem Transfer, Gefäßperfusion of das Transplantat bei einer und zwei Wochen nach der Implantation mit Ultraschall gemessen. <ol><li> Betäuben die Maus mit 2% Isofluran. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer beweglichen Bühne auf 38 ° C erhitzt, auf die normale Körpertemperatur zu gewährleisten, und befestigen Sie dann die Maus mit einem Klebstoff Bandage. </li><li> Finden Sie die Arteria und Vena femoralis Gefäße mit nicht-linearen Wandler auf dem B-Modus eingestellt. </li><li> Überprüfen Sie die Durchgängigkeit der Femoralgefäße des Transplantats unter Verwendung des Wandlers auf der Farb-Doppler-Modus eingestellt. </li><li> Vorbereitung nicht-spezifischer Kontrastmittel nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verbinden einer Schwanzvenenkatheter (12 cm Schlauch mit einer 27 G-Nadel) in eine 1 ml Spritze, die mit Kochsalzlösung gefüllt. Sichern die Spritze neben der Maus auf dem Heiztisch (um eine Bewegung der Spritze zu vermeiden). </li><li> Verbinden Sie den Katheter an die Maus Schwanzvene und sichern Sie die Nadel. </li><li> Spritzen Sie etwas von der Kochsalzlösung, um sowohl sicherzustellen, dass Injektionen werden in die Vene und zu füllen gemachtder Schlauch mit Kochsalzlösung (um Luftblasen zu vermeiden). </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 70 ul von Kontrastmittel und ersetzen Sie die Kochsalzlösungsspritze mit dem Kontrastmittel-Spritze. </li><li> Einrichten der Ultraschall zur Bild Injektion des Kontrastmittels. In Eigenschaften des nicht-linearen Modus Einrichten der Anzahl von Rahmen bis 1500 und die Störung Puls bis 30% der Aufnahmen. HINWEIS: Nach der Unterbrechung Impulses die Mikrobläschen erneut füllen die Behälter mit einer Geschwindigkeit, die der Fließgeschwindigkeit der Mikrobläschen in den Kapillaren abhängt und unabhängig von der Einspritzrate der Mikrobläschen. Die Anzahl der Rahmen kann nach der Füllzeit 19,20 verändert werden. </li><li> Spritzen Sie das Kontrastmittel in die Schwanzvene. </li><li> Machen Sie Bilder in der nichtlinearen Kontrastmodus der hochauflösenden Ultraschallsystem. </li><li> Analysieren Sie die Ergebnisse mit Hilfe der Software, wie zuvor beschrieben, 19,20. <ol><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) auf dem erhaltenen Bild imunmittelbar nach der Unterbrechung Impuls in der Kontrastmodus. Der ROI ist die Fläche nur durch das Kontrastmittel gefüllt zu skizzieren. </li><li> Berechnung der Überhöhungs (PE), welches das Verhältnis der mittleren Intensität des nicht-linearen Signals nach dem Einspritzen der Mikrobläschen gegenüber nach der Unterbrechung Impuls und ist ein Maß für die Durchblutungsvolumens. </li><li> Berechnung der Durchflussmenge, die aus der Zeit (T), die bis zum Peak-Signal (P) verstreicht, bestimmt wird. </li></ol></li></ol> 6. Bestimmung des Ausmaßes der Graft Vaskularisation HINWEIS: Das Ausmaß der Gewebetransplantat Vaskularisation ist ein oder zwei Wochen nach der Implantation bestimmt. <ol><li> Verwendung einer Insulinspritze, betäuben die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin: Xylazin (35 ul / 20 g). </li><li> Verwendung von 1-ml-Spritze, intravenös zu injizieren 200 ul 10 mg / ml Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Dextran (FITC-Dextran, MG = 500.000) in die Schwanzvene. &lt;/ li&gt; <li> Zehn Sekunden nach der Beendigung der Injektion euthanize die Maus durch zervikale Dislokation. </li><li> Öffnen Sie das Bein der Maus und setzen das Transplantat. </li><li> Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Waschen Sie die Transplantatbereich und gelten 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Bild das Transplantat in der Maus Bein, mit einem konfokalen Mikroskop. </li><li> Quantifizierung funktionellen Gefäßdichte (FVD). <ol><li> Isolieren Sie den grünen Kanal (Anregung = 488 nm) der konfokalen mikroskopischen Bildern. </li><li> Leitet die resultierenden Bilder, die durch ein Hochpassfilter, um die kontrastreiche Strukturen betonen. </li><li> Verwenden ein Filter zum Entfernen von Flecken, um Geräusche, die durch das Hochpassfilter verstärkt worden sind, beseitigt werden. </li><li> Richten Sie den Wert der Schwelle auf dem resultierenden Bild; der Schwellenwert wird so eingestellt, dass die Funktionen und Strukturen in dem Originalbild in dem binären Bild sichtbar sind. </li><li> Tragen Sie eine Größe-Schwelle, so dass nur Gruppen von verbundenen Pixeln größer als der definierte size Schwelle bleiben in dem binären Bild. </li><li> Skizzieren Sie das Skelett der Gefäße im Transplantat mit der Zhang-Suen Algorithmus 21. </li><li> Errechnen FVD durch Summieren der Längen der Mittellinie des Schiffes übereinstimmen, und Dividieren des Ergebnisses durch die Fläche der ROI. </li></ol></li></ol> 7. Immunhistologische und histologischen Färbung des Transplantats <ol><li> Immunhistologische Färbung <ol><li> Nach konfokale Bildgebung, Abrufen des Transplantats mit einem kleinen Schere und Pinzette. Sezieren die AV Gefäße in den beiden Enden des Transplantats und Abrufen des Transplantats. </li><li> Befestigen Sie die Transplantate in 10% neutral gepuffertem Formalin für 30 min - 2 h. </li><li> Legen Sie die Transplantate in der Histologie Kassetten und Store in 70% Ethanol, bis Paraffineinbettung. </li><li> In Paraffin mit einem Standard-Fixierung und Einbettung Protokoll 22 einzubetten und in Scheiben in Paraffin eingebetteten Gewebe in 5 &amp; mgr; m Schnitte mit einem Mikrotom. Schneiden Sie die ganze Gewebe senkrecht zu der AVSchiffe. </li><li> Entparaffinieren in Paraffin eingebetteten Schnitten durch Eintauchen in 100% Xylol zweimal je 10 min. </li><li> Die Objektträger in einem 250 ml Kunststoff Coplin-Gefäß. </li><li> Rehydrieren durch serielle Immersionen in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% und doppelt destilliertem Wasser (DDW)) für jede 3 min. </li><li> Vorbereitung Antigendemaskierung durch Verdünnen von 2,35 ml Antigendemaskierung Lösung mit 250 ml DDW. Erhitzen Sie die Antigen-Demaskierung Lösung für 2 Minuten in der Mikrowelle bis 95 ° C eingestellt. </li><li> Legen Sie die Dias in den vorgeheizten Antigen Demaskierung Lösung und Wärme noch einmal für 3 Minuten in der Mikrowelle bis 95 ° C eingestellt. Kühlen Sie die Folien bis 50 ° C. </li><li> Erhitzen Sie erneut 2 Minuten und dann auf RT abkühlen. </li><li> Die Folien inkubieren in 3,3% H 2 O 2 in Methanol für 10 min bei RT, um die Aktivität der endogenen Peroxidase quenchen und dann zweimal in PBS spülen. </li><li> Bereiten Sie eine Inkubationskammer: Ort nassen absorbent Blätter in einem histologischen Box und trocknen Sie die Folien mit heiklen Aufgabe Wischer. </li><li> Kreisen Sie die Slice-Bereich auf dem Objektträger unter Verwendung einer hydrophoben Stift und Inkubation für 30 min bei RT, mit etwa 50 &amp; mgr; l Ziegenserum Blockierungslösung (2%, in PBS) pro Scheibe. </li><li> Verdünnen Sie die Kaninchen-Anti-CD31-Antikörpers 01.50 in Blockierungslösung, gelten etwa 50 &amp; mgr; l Antikörper pro Scheibe und Inkubation O / N, bei 4 ° C. Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min. </li><li> Verdünnen Sie die biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper 1: 400 in PBS, Platz über Folien etwa 50 &amp; mgr; l Antikörper pro Scheibe und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min. </li><li> Verdünnte Streptavidin-Peroxidase-1: 400 in PBS, gelten etwa 50 &amp; mgr; l pro Scheibe und Inkubation mit Rutschen für 30 min bei RT. Spülen 3 mal mit PBS, je 5 min. </li><li> Übernehmen ungefähr 50 &amp; mgr; l Aminoethylcarbazol (AEC) Substrat pro Scheibe, laut Hersteller &amp; #8217; s-Anweisungen. Tauchen Sie die Folien in DDW, um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Färben die Kerne in blau durch Eintauchen der Abschnitte in etwa 50 ul Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. Sanft in Wasser abspülen und dann bedecken Sie die Abschnitte mit Eindeckmedium. </li><li> Quantifizieren, CD31-positive Färbung mit Hilfe eines doppelblinden Ansatz. CD31-Färbung erscheint als ein brauner Fleck. Wählen Sie 4-5 verschiedene Felder in einem 40-facher Vergrößerung Sichtfeld unter einem Binokular. Zählen Sie die Anzahl der CD31-positiven Lumen. <ol><li> Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von CD31-positiven Lumen pro Gerüst durch Dividieren der Gesamtzahl der gezählten Lumen mit der Anzahl der Felder und dem fieldarea (nach den binokularen Daten). HINWEIS: Die aufgebrachte Reagenzienvolumen muss ausreichend sein, um die gesamte umrissen Scheibe decken. </li></ol></li></ol></li><li> Histologischen Färbung <ol><li> Fix Transplantate in 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Einbetten Transplantate in Paraffin unter Verwendung von StandardFixierung und Einbettung Verfahren. </li><li> Entfernen des Paraffins aus der in Paraffin eingebetteten Schnitten durch Eintauchen in 100% Xylen zweimal 10 min. </li><li> Schnelle Wäsche zweimal für Rehydrierung in 100% Isopropanol. </li><li> Schnelle Wäsche zweimal 95% Ethanol. </li><li> Dreimal mit Leitungswasser zu waschen. </li><li> Tauchen Sie ein in Hämatoxylin für 10 min. </li><li> Dreimal mit Leitungswasser zu waschen. </li><li> Immere in Eosin für 2 min. </li><li> Schnelle Wasch entwässern in 95% Ethanol zweimal. </li><li> Schnelle Wäsche 100% Isopropanol zweimal. </li><li> Schnelle Wäsche 100% Xylol zweimal. </li><li> Deckel mit DPX Kleber mit Deckglas 1,5 mm dick. </li><li> Bild mit Mikroskop in 40-facher Vergrößerung. </li></ol></li></ol> 8. Mechanische Eigenschaften Beurteilung <ol><li> Abrufen des Transplantats mit einem kleinen Schere und Pinzette. </li><li> Spülen Sie das Transplantat in PBS. </li><li> Die Breite und Dicke des Transplantats und die Berechnung der Querschnittsfläche, wie durch die Dicke multipliziert Breite. </li><li> Unse die Testinstrument, um eine Spannungs-Dehnungskurve von hydratisiertem Transplantate zu generieren. <ol><li> Montieren Sie das Transplantat zwischen den System Zug- Griffe und messen die endgültige Länge zwischen den beiden Griffen (dh Ausgangslänge). </li><li> Tragen Sie eine Verformungsgeschwindigkeit von 0,01 mm / s, bis zum Versagen. </li><li> Notieren Sie sich die entwickelte Kraft und mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren Sie eine Spannungs-Dehnungskurve in Matlab. <ol><li> Berechnen Stamm nach Verschiebung, dividiert durch die ursprüngliche Länge. Stress als die gemessene Kraft dividiert durch die Querschnittsfläche berechnet. </li><li> Bestimmen Steifigkeit als die Steigung des linearen Bereichs der Spannungs-Dehnungs-Kurve und dem Maximalpunkt der Kurve ist die Zugfestigkeit. </li></ol></li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revascularization+of+human+acellular+dermis+in+full-thickness+abdominal+wall+reconstruction+in+the+rabbit+model.">Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model.</a> Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).</li><li>Buinewicz, B., Rosen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+cadaveric+dermis+(AlloDerm):+a+new+alternative+for+abdominal+hernia+repair.">Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair.</a> Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).</li><li>Bringman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hernia+repair:+the+search+for+ideal+meshes.">Hernia repair: the search for ideal meshes.</a> Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).</li><li>Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biological+and+composite+scaffolds+for+abdominal+wall+reconstruction.">Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction.</a> Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).</li><li>Cheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+blood+vessel+networks+connect+to+host+vasculature+via+wrapping-and-tapping+anastomosis.">Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis.</a> Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).</li><li>Shandalov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+muscle+flap+for+reconstruction+of+large+soft+tissue+defects.">An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects.</a> PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).</li><li>Zhang, T. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+wall+reconstruction+using+biological+tissue+grafts:+present+status+and+future+opportunities.">Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities.</a> Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).</li><li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells.">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).</li><li>Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+beds+provide+key+signals+to+pancreatic+hormone-producing+cells.">Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells.</a> PloS one. 7 (7), e40741 (2012).</li><li>Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization--the+conduit+to+viable+engineered+tissues.">Vascularization--the conduit to viable engineered tissues.</a> Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).</li><li>Koffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts.">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+a+tissue-engineered+human+vascularized+cardiac+muscle.">Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle.</a> Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Bearzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlGF-MMP9-engineered+iPS+cells+supported+on+a+PEG-fibrinogen+hydrogel+scaffold+possess+an+enhanced+capacity+to+repair+damaged+myocardium.">PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium.</a> Cell death &amp; disease. 5, e1053 (2014).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1+expression+by+mesenchymal+stem+cells+results+in+trophic+support+of+cardiac+myocytes+after+myocardial+infarction.">SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction.</a> FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).</li><li>Dvir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevascularization+of+cardiac+patch+on+the+omentum+improves+its+therapeutic+outcome.">Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome.</a> PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).</li><li>Marsano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+controlled+expression+of+VEGF+by+transduced+myoblasts+in+a+cardiac+patch+on+vascularization+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infarct+stabilization+and+neovascularization+mediated+by+VEGF-loaded+PEGylated+fibrinogen+hydrogel+in+a+rodent+myocardial+infarction+model.">Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).</li><li>Nillesen, S. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+angiogenesis+in+acellular+scaffolds+by+combined+release+of+FGF2+and+VEGF.">Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.</a> J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels.">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat Commun. 4, 1399 (2013).</li><li>Tee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats.">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).</li><li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber.">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Fortschritte im Tissue Engineering haben mit einer wachsenden Nachfrage nach Ersatzgewebe für den Wiederaufbau von verschiedenen Gewebetypen erfüllt. Eine Vielzahl von synthetischen und biologischen 1,17,18 14-16 Materialien sowie Herstellungsverfahren wurden für ihre Fähigkeit, diesen Anforderungen gerecht beurteilt. Trotz der Fortschritte in der klinischen Versorgung und im Tissue Engineering, die Wiederherstellung der vollen Dicke Bauchwanddefekten bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein...

Bauchwanddefekte entstehen oft nach schweren Traumata, Krebsbehandlung, Verbrennungen und Entfernung infizierter mesh. Diese Fehler beinhalten häufig erhebliche Gewebeverlust, komplizierte chirurgische Eingriffe und präsentiert eine große Herausforderung für die plastische Wiederherstellung Chirurgen 1-4. Tissue Engineering Forscher der Suche nach neuen Quellen für künstliche Gewebe haben unterschiedliche Materialien, Zellquellen und Wachstumsfaktoren untersucht. Erfolgreiche Restaurationen aus verschiedenen Geweben, wie zum Beispiel 5,6 Trachea, der Blase 7, 8 Kornea, Knochenhaut 9 und 10 durch Implantation von technischen Geweben wurden bereits berichtet. Jedoch die Herstellung einer dicken vaskularisierten technisch hergestellte Gewebe, insbesondere zur Rekonstruktion von großen Defekten, bleibt eine große Herausforderung im Tissue Engineering. Eine der wichtigsten Faktoren, die die Dicke eines lebensfähigen Gewebekonstrukt wird die Steuerung der Sauerstoffversorgung auf seine Nachteiletituent Zellen. Beim Rückgriff auf Diffusion konstruieren Dicke ist auf der von einer sehr dünnen Schicht. Der maximale Abstand zwischen Sauerstoff- und Nährstoff-Zufuhr Kapillaren in vivo etwa 200 um, die mit der Diffusionsgrenzsauerstoff 11,12 korreliert. Unzureichende Vaskularisierung in Gewebeischämie führen und zu eskalieren zu Gewebeabbau oder Nekrose 13. Darüber hinaus müssen die für die Geweberekonstruktion verwendet ideales Material biokompatibel und nicht-immunogen sein. Es muss auch in der Lage, die weitere Integration von Wirtszellen mit dem Biomaterial und die strukturelle Integrität zu gewährleisten. Verschiedene biologische 14-16 und synthetische 1,17,18 Matrizen wurden zuvor zum Wiederaufbau von Gewebe untersucht, aber ihre Verwendung bleibt wegen des Mangels an wirksamen Blutversorgung, Infektionen oder unzureichende Gewebefestigkeit begrenzt. In dieser Studie wurde ein biokompatibles, zell embedded Gerüst der Food and Drug Administration (FDA) -zugelassene Poly-L-Milchsäure (PLLA) / Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) umfasste, wurde um die Arteria und Vena femoralis (AV) Schiffe mit einer nackten Maus implantiert und getrennt von dem umgebenden Gewebe, wodurch Vaskularisierung nur aus den AV Gefäße. Eine Woche nach der Implantation war das Transplantat lebensfähigen, dick und gut vaskularisiert. Diese dicke vaskularisiertes Gewebe mit den AV Gefäße, wurde dann als gestielten Lappen zu einer Bauch voller Dicke Defekt in der gleichen Maus übertragen. Eine Woche nach der Übertragung wurde die Klappe lebensfähigen, vaskularisiert und gut mit dem umgebenden Gewebe integriert, wobei eine ausreichende Festigkeit, um Bauchorgane zu unterstützen. Somit ist die technisch stark, vaskularisierten Gewebelappen, wobei eine autologe Stiel, stellt ein neues Verfahren für die Reparatur von voller Dicke Bauchwanddefekte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small fine straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small vessel cauterizer&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td align="right">5686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedaxylan</td>
			<td>Euravet</td>
			<td>DJ03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorketam 1000</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4A0726B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>vetmarket</td>
			<td>B15100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 silk sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td align="right">647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 polypropylene sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td>9351F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 silk sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td align="right">684568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (6mm needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS250 non-linear transducer</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromarker non-targeted contrast agent</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td>VS-11694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tail vein catheter</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td>VS-11912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 software</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td align="right">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antigen unmasking solution</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin-peroxidase</td>
			<td>Jackson&#160;</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hamatoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MHS-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit</td>
			<td>Life technologies, Invitrogen&#160;</td>
			<td>00-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectamount</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered vascularized muscle flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

Graft Vaskularisation und Perfusion in vivo Die Transplantate wurden ein oder zwei Wochen vor ihrer Übertragung als axiale Klappen implantiert. Bei einer und zwei Wochen nach der Implantation, der groben Beobachtung des Transplantatbereich enthüllt lebensfähig und vaskularisierten Gewebetransplantate. Diese Transplantate nachgewiesen gefäß zu sein, wie durch positive Immunfärbung CD31 (1A) bestimmt ist, und stark durchbluteten, wie von FITC-Dextran-Injektion i...

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Engineered Vascularized Muscle Flap

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.2K Aufrufe.  Kaplan Medical Center. To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps. 

Serie: Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Forschung

Biotechnik

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study skeletal muscle reformation and function in a scalable format that is amenable to experimental manipulations. 3D muscle culture systems are desirable as they enable scientists to study skeletal muscle ex vivo in the context of human cells. 3D in vitro&#160;models closely mimic aspects of the native tissue structure of adult skeletal muscle. However, their universal application is limited by the availability of platforms that are simple to fabricate, cost and user-friendly, and yield relatively high quantities of human skeletal muscle tissues. Additionally, since skeletal muscle plays an important functional role that is impaired over time in many disease states, an experimental platform for microtissue studies is most practical when minimally invasive calcium transient and contractile force measurements can be conducted directly within the platform itself. In this protocol, the fabrication of a 96-well platform known as &#39;MyoTACTIC&#39;, and en masse production of 3D human skeletal muscle microtissues (hMMTs) is described. In addition, the methods for a minimally invasive application of electrical stimulation that enables repeated measurements of skeletal muscle force and calcium handling of each microtissue over time are reported.

This manuscript describes a detailed protocol to produce arrays of 3D human skeletal muscle microtissues and minimally invasive downstream in situ assays of function, including contractile force and calcium handling analyses.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, failed by the first steps of the reconstructive ladder. Despite promising aesthetic and functional outcomes, the main limiting factor remains the need for a drastically applied lifelong immunosuppression and its well-known medical risks, preventing broader indications. Therefore, lifting the immune barrier in VCA is essential to tip the ethical scale and improve patients&#39; quality of life using the most advanced surgical techniques. De novo creation of a patient-specific graft is the upcoming breakthrough in reconstructive transplantation. Using tissue engineering techniques, VCAs can be freed of donor cells and customized for the recipient through perfusion-decellularization-recellularization. To develop these new technologies, a large-scale animal VCA model is necessary. Hence, swine fascio-cutaneous flaps, composed of skin, fat, fascia, and vessels, represent an ideal model for preliminary studies in VCA. Nevertheless, most VCA models described in the literature include muscle and bone. This work reports&#160;a reliable and reproducible technique for saphenous fascio-cutaneous flap harvest in swine, a practical tool for various research fields, especially vascularized composite tissue engineering.

The present protocol describes the porcine fascio-cutaneous flap model and its potential use in vascularized composite tissue research.

Ein zuverlässiges schweinisches Faszien-Hautlappenmodell für vaskularisierte Komposit-Allografts Bioengineering-Studien

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...