Diese Arbeit wurde von der philanthropischen Beiträge der John G. und Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grants # 0727033) und dem Melanoma Research Alliance unterstützt. Die Autoren danken der University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) für die Koordinierung der Gewebeverteilung und Sammlung und die Erleichterung der translationalen Forschung, wie Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, dem MD Anderson Cancer Center Department of danken, sowie Pathologie und der Melanom-Mond-Schuss-Programm. Schließlich sind die Autoren danken allen Patienten und Familien, die von Melanom betroffen anzuerkennen.

Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wird von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Probenbeschaffung <ol><li> Sammeln Forschung Gewebeproben von Tumorüberschuss und damit verbundene normale Gewebe 10-12. Lagern Sie die Proben auf nassem Eis, um Autolyse zu vermeiden. </li><li> Senden Sie alle Gewebe, medizinische Geräte und Fremdkörper während eines chirurgischen Eingriffs an der Abteilung für Pathologie für notwendige Untersuchung entnommen, um eine pathologische Diagnose zu erleichtern. </li><li> Griff Gewebe für die Forschung in Übereinstimmung mit den geltenden Forschung und Gewebebanken Richtlinien und Verfahren zugeordnet. HINWEIS: Biospecimen Sammlung beinhaltet die Koordination der Pathologen, Pathologen Assistenten, histotechnologists und Gewebebeschaffungsspezialisten. </li></ol> 2. Pathologie Qualitätssicherung (QS) <ol><li> Vervollständigen und überprüfen Patientenakten als Früh QA Maßnahme und konsultieren Sie einen Pathologen zu Diagnose pa überprüfentienten Aufzeichnungen (Pathologie Berichten Gewebeschnitten, etc.) und Gewebeproben. Richter Gewebeproben auf morphologische Merkmale von Interesse, wie Prozentsatz der Tumor-Nekrose, Gewebetumor-Schnittstelle, etc. Dies ist in Übereinstimmung mit Biobanken Best Practices 10-12. </li><li> Nach der ersten Überprüfung, führen regelmäßige Überprüfungen von Biobanken Daten und Forschungs Proben während der gesamten Dauer des Aufenthalts der Bioprobe. </li><li> Link Ergebnisse und Anmerkungen von histopathologischen und weitere Untersuchungen zu den Proben und geben diese Daten an die Forscher über eine proprietäre Biobanken-Software-System. HINWEIS: QA Prozesse gewährleistet die Integrität sowohl der klinischen und technischen Aspekte der Biobanken Operationen. </li><li> Führen genetischen und molekularen Tests, um zu überprüfen und zu charakterisieren, die Proben für die klinische Anwendung. </li><li> Sammeln und Daten basierend auf Feedback von Forschern, die mit Hilfe wurden die Proben für Laborversuche zu analysieren. VerfolgenProben mittels Barcode-Technologie. Diese elektronische Tracking-System ist auch in biorespository Best Practices 10-12 befürwortet. </li></ol> 3. Proben / Gewebeverarbeitung <ol><li> So schnell wie möglich immer frische Gewebeproben auf nassem Eis und Prozess zu speichern, um die Änderungen, die durch Extraktion der Gewebeprobe aus seiner natürlichen Umgebung induzierten begrenzen. Prozess normalen tumor abgestimmt und Tumorgewebeproben separat um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. HINWEIS: Basierend auf Forschungsprotokollen kann Bioprobe Verarbeitungs Sammlung von Proben in einem oder mehreren Medientypen beinhalten. </li><li> Vor Beginn des Prozesses, bereiten eine sterile Petrikulturschale, ein Skalpell, sowie eine Nadel oder Pinzette zur Gewebeverarbeitung. Stellen Sie sicher, dass Röhrchen wurden hergestellt, etikettiert und durchgeführt, um Zeit der Probenverarbeitung (Abbildung 2) zu begrenzen gelegt. </li><li> Alle relevanten Gewebe Daten wie Patientenname, Anzahl, Behandlung, DatumChirurgie, und andere relevante Informationen, wie sie für das Studium geeignet sein, sollte in einem institutionellen Gewebedatenbank leicht zugänglich gemacht werden. Begrenzte Patientendaten sollten im Labor auf Papier oder in Tabellenform gehalten werden. ANMERKUNG:. Nur zu sammeln, die für die Art der Forschung, nämlich Bioprobe Informationen biomedizinischen Grundlagenforschung, klinische Forschung, translationale Forschung, usw. Für krankheitsspezifischen Informationen, die Biobanken Mitarbeiter sollten Daten, die von der aktuellen Literatur für notwendig erachtet und Regierungsorganisationen zu sammeln sicherzustellen, die richtige Diagnose und sinnvolle Forschung. Dies umfasst, ist aber nicht an Tumororten und Cancer Staging Informationen. </li><li> Planen alle gewünschten nachfolgenden Experimenten im Voraus auf der Größe der Gewebeschnitte für jeden Typ der Analyse, sowie die Lage der Ausschnitte erforderlich zu entscheiden. Im Idealfall, wenn auch nicht möglich ist, alle Analysen sollten repräsentativ für die gesamte Gewebeschnitt, um die für die Gewebe heterogenei Konto seinty und Grenze Vorspannung der Downstream-Analysen. Legen Sie alle erforderlichen Produkte im Voraus, wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Legen Sie die Gewebeprobe in der offenen Petrikulturschale, flach an der Oberfläche. Hinweis: Lassen Sie nur autorisierte Biobanken Mitarbeiter identifiziert Proben handhaben und zu identifiziereGesundheitsDaten zu überprüfen. Die Ermittler sollten nur die Patientenkennungen wie von den unterzeichneten informierte Zustimmungen dürfen und wie durch den IRB regulierten Zugang. Alle Proben müssen ausreichend gekennzeichnet sein und sollte mindestens ein einzigartiges Gewebe Identifikationsnummer und Gewebetyp gehören. Sind keine PHI in den Etiketten gemäß HIPAA-Vorschriften. </li><li> Überprüfen Sie die Probe von allen Seiten, um ein besseres Verständnis ihrer Struktur und Dimensionen zu gewinnen. Pin der Probe auf den Boden der Schale mit der Nadel, und fahren Sie um das Gewebe entlang der größten und am besten Vertreter Achse halbieren. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück Gewebe und legen Sie sie in einem sterilen 1,5 ml microcentrifuge Rohr 1 ml RNA-Stabilisierungslösung enthält. Kann diese Probe auf Eis für den Rest des Verfahrens eingebracht und bei 4 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. HINWEIS: Bei der Arbeit mit RNA, Schutzhandschuhe sollten immer getragen werden, und RNAse-freier Filterspitzen sollten verwendet werden, um die Chancen des Abbaus und RNA-Kontaminationen zu begrenzen. </li><li> Legen Sie eine offene und pre-markierten Biopsie-Kassette in den Deckel der Petrikulturschale. Schneiden Sie ein Stück Gewebe nicht dicker als 3 bis 5 mm und überträgt es auf der Kassette. Setzen Sie die Kassette in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für mindestens 72 Stunden. Übertragen Sie die Kassette in 70% Ethanol für langfristige Lagerung vor der Paraffineinbettung. HINWEIS: Beschriftung von Kassetten sollten in Bleistift oder mit empfohlenen Marker als Verwendung von Xylol während der Verarbeitung sonst Etiketten zu löschen durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie ein Stück Gewebe und legen Sie sie in einer Gewebeform. Bedecken Sie den Gewebeschnitt im optimalen Schneidtemperatur (OAT) Verbindung, und frieren Sie es sofortbei -20 ° C für Kryoschneiden. Dieser Gewebeschnitt kann bei -20 ° C, bis sie zur Kryoschneiden gespeichert werden. </li><li> Schnitten eine oder mehrere Gewebestücke und übertragen sie in ein 50 ml Röhrchen mit MACS-Puffer (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,5% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) für die nachfolgende Durchflusszytometrieanalyse . Für die Durchflusszytometrie können größere Proben zu bevorzugen sein, wie Zellen können während der Tumor Dissoziation, Zell Fixierung und Permeabilisierung verloren, wenn erforderlich. Allgemeiner kann dieser Abschnitt am Ende entnommen werden, sobald die noch andere Stücke verarbeitet wurden. Übrig gebliebenen kann repräsentativ Tumorprobe für die Durchflusszytometrie verwendet werden. Gegebenenfalls kann diese Röhrchen bei 4 ° CO gespeichert / N oder zur durchflusszytometrischen Färbung unmittelbar nach der Spaltung in eine Zellsuspension (siehe Schritt 4 - Durchflusszytometrischer Färbung) verwendet. </li><li> Geschnitten restliche Gewebe in Stücke nicht größer als eine maximale Größe von 0,5 mm x 0,5 mm und sie auf kryogeneFläschchen für sofortige Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Diese Schnapp gefrorenen Proben kann verwendet werden für zukünftige Analysen und kollaborative Zwecke. HINWEIS: Besondere Sorgfalt sollte beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff als direkten Kontakt können schwere Verletzungen verursachen genommen werden. Augen sollten mit Schutzbrille mit Seitenschutz oder mit einem Gesichtsschutz geschützt werden. Kryo-Handschuhe auch getragen werden, um von flüssigem Stickstoff Verbrennungen durch Spritzwasser und direkter Kontakt zu schützen. Handschuhe sollten richtig passen, aber locker genug sein sollte, um schnell mit flüssigem Stickstoff splash in sie entfernt werden. </li></ol> 4. Durchflusszytometrische Färbung <ol><li> Gewebehomogenisierung <ol><li> Vorbereitung Digestionsmedium mit DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) und Kollagenase I (2 mg / ml). Platzieren frisch oder O / N-gespeicherten Tumor in MACS-Puffer in dem Deckel einer Petrischale, und tauchen mit Digestionsmedium. HINWEIS:. Unterschiedliche Aufschlussmethoden existieren, die jeweils mit Vorteilen (zB Zelloberflächenprotein abpression, Lebensfähigkeit). Stellen Sie sicher, die richtige Methode für Ihr gewünschtes nachgeschalteten Anwendung haben. </li><li> Pin Tumor zum Boden der Schale mit einer Nadel und geschnitten von der Außenseite mit einem Skalpell zu zentrieren, bis der Tumor hat eine pastenartige Textur. Bringen Tumor Mischung in ein 50-ml-Tube, Dichtung und legen Sie in einem Plastikbeutel, um Lecks zu vermeiden. Überführungsrohr in einen Inkubator, und drehen bei 225 RPM, 37 ° C, 1 h. </li><li> Filter Tumorzellsuspension durch ein 70 um Zellsieb. Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g, 4 ° C, 5 min. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M Stamm EDTA, 10 ml FCS oder FBS). </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren in einer Konzentration von 1x10 &amp; sup7; Zellen / ml. Transfer 100 ul pro Vertiefung (10 6 Zellen) in einer 96-Well-Rundbodenplatte für die Färbung. </li></ol></li><li> Lebensfähigkeit und Antikörper-Färbung <ol><li> Fügen Sie 200 ul der Lebensfähigkeit Fleckenlösung in jede Vertiefung und mischen. IncuBeize für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. </li><li> In Antikörpermischung bei empfohlenen / titriert Konzentration (nach Hersteller) für die Oberflächenantigene in 200 ul FACS-Puffer. Inkubieren Zellen bei 4 ° C, 30 min, in der Dunkelheit. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. </li><li> Mit 200 ul FACS-Puffer waschen, Spin-down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. Die Zellen in 200 ul FACS-Puffer, und fahren Sie Durchflusszytometer zur Erfassung und Analyse fließen. HINWEIS: Bei der Durchführung der intrazellulären Durchflusszytometrie Färbung, führen Fixierung und Permeabilisierung Schritte und intrazelluläre Färbung zwischen den Schritten 4.2.2 und 4.2.3. Wenn die Durchführung Zytokin-Färbung sollte Zellen voraktivierten vorhergehenden Färbung wie empfohlen und ein Inhibitor der intrazellulären Proteintransport und Sekretion wie Monensin sollten bei der Aktivierung verwendet werdensicherzustellen Eigentums lösliche Faktoren. Fixierte Zellen können kurzfristige (eine Woche) bei 4 ° C im Dunkeln nach der Akquisition mit einem Durchflusszytometer gespeichert werden. </li></ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. 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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Letztlich müssen die Verfahren zur Verarbeitung von durch die gewünschte Hypothese diktiert und erwarteten technischen Assays (Figur 1) ausgeführt werden kann. Der folgende Abschnitt dient als Überblick über potenzielle Assays, die auf solchen Gewebeschnitten durchgeführt werden können, zu beschreiben. Es ist keineswegs eine erschöpfende Übersicht, sondern soll Führungsprobenverarbeitungsmethoden und Wahl der Downstream-Assays mit der Beschreibung Techniken und Listing ihre Stärken und Schwä...

Medizinische Forschung immens aus dem Studium der sowohl menschliche Zelllinien und Tiermodellen profitiert. Zelllinien ermöglichen eine bessere Steuerung der Komponenten in einem System, sowie die Verwendung von Zellen aus dem richtigen Organismus. Arbeiten mit menschlichen Zellen, während repräsentativer, präsentiert eine drastisch vereinfacht Momentaufnahme der Mechanismen, die für die Gesundheit und Krankheit verantwortlich sein können, denn Zelllinien möglicherweise nicht die Auswirkungen von anderen Zellen, Stromazellen Komponenten und Organe, die Reaktionen 1 auswirken können rekapitulieren. Auf der anderen Seite, Tiermodelle, die aber nicht völlig genau bei der Wiedergabe menschlicher Erkrankungen und genetische Heterogenität bieten weitere Einsicht, indem für die Eingabe von ganzen Tiersystemen in den meisten Modellen 2,3. Mängel beiseite, beide Methoden haben ihre Vorteile und ergänzen. Allerdings bleibt das Hauptziel, die menschliche Zellen und Organen, in einem vollen Körper, Multi-Organ-System zu studieren. Dementsprechend hat der translationalen Forschung taken große Fortschritte bei der Erleichterung der Untersuchung von menschlichen Organen und Geweben von Patienten extrahiert werden, um besser zu verstehen, die Mechanismen zugrunde liegenden Krankheit. Translationale Forschung bietet den Vorteil, das Studium der Folge der Behandlungen und Krankheiten in der gesamten Körper und in geeignete Zellen, wodurch das Beste aus beiden Welten zwischen Zell- und Tier Arbeiten 4. Translationale Forschung ist auch nicht ohne Mängel. Geernteten Proben von menschlichen Patienten, bei der Entnahme aus dem Host sofort auf Ischämie und andere externe Faktoren, aus denen sie sonst geschützt unterzogen. Dies kann zu Stress-induzierten molekularen und genetischen Veränderungen führen und verursachen Verzerrungen bei der nachfolgenden Studien. Daher wurde viel Mühe in Gewinnung und Verarbeitung Gewebe durch strenge Methoden zur Organ- und Zellintegrität zu bewahren besten für nachgelagerten Studien 5 gesetzt. Wichtig ist, dass zukünftige Anwendungen eng bei der Auswahl von Methoden o berücksichtigt werdenf Verarbeitung menschlichen Proben, wie bestimmte Methoden können sich negativ auf zelluläre Komponenten und Signalwege bei der Sparsamkeit andere. Für jede Forschung mit menschlichen Geweben, müssen Regulierungsfragen angesprochen werden. Nach den Tuskegee und Belmont Berichte gab es eine wachsende Akzeptanz der Tatsache, dass die biomedizinische Forschung wurde mit inhärenten Risiken häufig zu unvermeidbaren ethischen Dilemmata 6 verbunden. Das Bedürfnis nach nationalen Standards erkannt wurde und die Bundesregierung erstellt Institutional Review Boards (IRBs) als Mittel, um die Prinzipien der Belmont Bericht zu wahren (Achtung der Personen, Wohltätigkeit, Justiz). IRB jeder Institution ist ein Ausschuss von Ärzten, Forschern und Mitgliedern der Gemeinschaft für den Schutz der Studienteilnehmer verantwortlich sind. Es erfordert, dass freiwillige Zustimmung aller Teilnehmer der biomedizinischen Forschung Studien erhalten werden kann, und dass diese Zustimmung in einer informierten Einwilligung fo dokumentiert werden<html> rm. Die Einwilligungsprozess zielt darauf ab, eine angemessene Information an einen Teilnehmer bereitzustellen, so dass eine fundierte Entscheidung treffen können, ob oder nicht, in einer Studie aufnehmen, oder die Teilnahme fortsetzen werden. In diesem Zusammenhang muss die Einwilligungsdokument gute Lesbarkeit und sollte in der Sprache, die leicht von der Zielgruppe verstanden werden kann (6. bis 8. Klasse Leseniveau) geschrieben werden. Die Möglichkeit, Nötigung oder unzulässigen Beeinflussung minimiert werden müssen, und das Thema muss ausreichend Zeit gegeben, um die Teilnahme zu erwägen. Der Teilnehmer muss außerdem die Möglichkeit haben, ihr Recht auf Zustimmung zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verlaufs der Studie ohne Strafe zurückziehen auszuüben. Freiwillige Einwilligung nach Aufklärung ist eine obligatorische Voraussetzung für die Teilnahme einer Person in der Forschung und es ist auch rechtswirksam 7. Gemäß den Vorschriften für den Schutz der menschlichen Probanden 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), muss die Studienteilnehmer der Zweck der Untersuchung informiert werden, die Verfahren in der Forschung, Alternativen zur Teilnahme Alle erkennbaren Risiken und Beschwerden (einschließlich nicht nur zu Verletzungen, sondern auch psychologische, soziale oder wirtschaftliche Schaden, Beschwerden oder Unannehmlichkeiten), Nutzen der Forschung für die Gesellschaft und gegebenenfalls für den Einzelnen, wie lange das Thema wird erwartet, zu beteiligen, Person, die Antworten auf Ihre Fragen oder im Falle eines Forschungsbedingten Verletzungen oder Notfall, die Erklärung, dass die Teilnahme freiwillig zu kontaktieren und dass die Weigerung zur Teilnahme werden nicht in irgendwelche Folgen oder den Verlust von Leistungen wie einen Kompromiss in regelmäßigen klinischen Versorgung führen dass die Teilnehmer sonst berechtigt, als Ergebnis seiner / ihrer Diagnosen eine Erklärung über das Recht des Patienten auf Vertraulichkeit und Recht, von zurückzutreten erhalten, und schließlichdie Studie jederzeit ohne Folgen. Gewebeproben von Teilnehmern, die im Verlauf der Studie Einwilligung widerrufen sollte nicht angeschüttet werden und muss sofort verbraucht werden. Verzicht auf eines oder mehrere Elemente der Einwilligung kann von dem IRB für einige Forschungsprojekte, die in der Praxis nicht ohne eine Änderung der benötigten Elemente oder für Untersuchungen, bei denen erforderlichen Elemente sind nicht anwendbar getan werden konnte, erhalten werden. Muss darauf geachtet werden, um die Vertraulichkeit der Daten zu gewährleisten. Der Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) ist ein Bundesgesetz, das der Nutzung oder Offenlegung &quot;geschützte Gesundheitsdaten&quot; (PHI) ohne schriftliche Genehmigung von den Teilnehmern verhindert. PHI umfasst, ist jedoch nicht zu Gesundheitsinformationen übertragen lassen oder in irgendeiner Form oder Medium und enthält Felder, die verwendet werden könnten, um eine individuelle Identifizierung 9 begrenzt. Durch diese Arbeit wollen wir das Protokoll, die während tissu befolgt werden müssen skizzierene Verarbeitung - einschließlich der Beschaffung und Lagerung und betonen, wie wichtig die folgenden strengen Richtlinien, um die Verzerrungen, die durch die Spannungen ein Gewebe, auf Extraktion unterworfen führen können, zu minimieren. Wir bemühen uns auch um eine kurze Übersicht über die nachgeschaltete Tests oder Analysen (Abbildung 1), die auf solchen Proben durchgeführt werden könnte, so dass Leser können eine qualifizierte Entscheidung über welche Assay (n) am besten ihren Bedürfnissen zu machen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> Die Ergebnisse angezeigt unten zeigen Durchflusszytometrie Gating-Strategie für die breite Immun Phänotypisierung auf einem verarbeiteten Melanomtumor. Der Tag der Färbung wurde Gewebeprobe unter 225 RPM Dreh verdaut und homogenisiert mit Collagenase I und DNase I Inkubation für 60 min bei 37 ° C. Nach dem Verdau wurde die Zellsuspension durch ein 70 um Sieb filtriert, um Zelltrümmer zu beseitigen, und die Zellen wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern Durchflusszytometrie für die Immunzelle Phänotyp...

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Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

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Research

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Medicine

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Serie: Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Generation umfassender Thoracic Oncology Database - Tool für Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Forschung

Medizin

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma and devastating tissue loss. Despite favorable and highly encouraging early and intermediate functional outcomes, rejection of the highly immunogenic skin component of a VCA and potential adverse effects of chronic multi-drug immunosuppression continue to hamper widespread clinical application of VCA. Therefore, research in this novel field needs to focus on translational studies related to unique immunologic features of VCA and to develop novel immunomodulatory strategies for immunomodulation and tolerance induction following VCA without the need for long term immunosuppression.
This article describes a reliable and reproducible translational large animal model of VCA that is comprised of an osteomyocutaneous flap in a MHC-defined swine heterotopic hind limb allotransplantation. Briefly, a well-vascularized skin paddle is identified in the anteromedial thigh region using near infrared laser angiography. The underlying muscles, knee joint, distal femur, and proximal tibia are harvested on a femoral vascular pedicle. This allograft can be considered both a VCA and a vascularized bone marrow transplant with its unique immune privileged features. The graft is transplanted to a subcutaneous abdominal pocket in the recipient animal with a skin component exteriorized to the dorsolateral region for immune monitoring.
Three surgical teams work simultaneously in a well-coordinated manner to reduce anesthesia and ischemia times, thereby improving efficiency of this model and reducing potential confounders in experimental protocols. This model serves as the groundwork for future therapeutic strategies aimed at reducing and potentially eliminating the need for chronic multi-drug immunosuppression in VCA.

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularized Composite Allotransplantations (VCA) have become a clinical reality. However, broad clinical application of VCA is limited by chronic multi-drug immunosuppression. The authors present a reliable and reproducible large animal model to translate novel immunomodulatory strategies that can minimize or potentially eliminate the need of immunosuppression in VCA.

Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...