Name: an ex vivo model to study hormone action in the human breast
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
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Die Autoren danken M. Fiche von Universitätsspital Lausanne für die Bereitstellung der mammoplasty Foto, M. Wirth und A. Ayyanan der Schweizerischen Institut für Experimentelle Krebsforschung, National Center of Competence in Research Molekulare Onkologie, School of Life Sciences, Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne für die technische Unterstützung und R. Clarke der Universität Manchester für Kritik. Die Forschung, die diese Ergebnisse Unterstützung SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, und die Initiative Innovative Arzneimittel gemeinsames Unternehmen gemäß Finanzhilfevereinbarung erhalten hat, nicht. 115.188, Ressourcen, von denen der Finanzbeitrag aus dem Siebten Rahmenprogramm der EU (FP7 / 2007-2013) und European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Unternehmen in Sachleistungen bestehen. Die Web-Adresse der Initiative Innovative Arzneimittel ist <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Allgemeine Überlegungen: Der Zeit voraus, bis eine Ethik-Protokoll eingestellt, bereiten Fragebögen für Patienten, und sehen auf die Ausbildung der Klinikpersonal. Bevor Sie Material aus Brustverkleinerung Chirurgie, beschaffen Genehmigungen und sorgen Zustimmung des Patienten. Gewebe können infektiös sein und muss entsprechend behandelt werden. Schweizerisches Institut für experimentelle Krebsforschung - Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der ISREC zugelassen. 1. Die Gewebewiederherstellung, Herstellung und Bio-Banking Um eine optimale Probenqualität für bio-Banking zu gewährleisten, sind eine Reihe von Schritten, die im Krankenhaus vor dem Labor transportiert geführt. Im Krankenhaus: <ol><li> Erhalten menschlichen Brustgewebe unter sterilen Bedingungen aus Brustverkleinerung Chirurgie und Blutproben, falls erforderlich. Tissue muss von Pathologen, probieren wird, um die Anwesenheit von malignen Läsionen auszuschließen untersucht werden. </li><li> Setzen Sie den Brust tAusgabe unter der Haube auf einem sterilen Bord und bereiten Schere, chirurgische Skalpell und Pinzette, die bereits mit Dampf sterilisiert werden. Stellen tiefen Schnitt an verschiedenen Standorten des Brustgewebe mit einem Skalpell zu öffnen. In menschlichem Brustgewebe Ihre weißen Litzen aus Leitungen und Läppchen, die in gelben Fettgewebe eingebettet sind. ANMERKUNG: Das Verhältnis der weißen parenchymalen zum gelben Fettgewebe unterscheidet bei Frauen; Regel jüngere Frauen haben mehr Epithelgewebe. </li><li> Wählen Stücke aus weißem Material und halten Sie sie mit einer Pinzette, dann trennen Sie diese vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Schere. Vermeiden Sie, die Blutgefäße. </li><li> Rinse Gewebestücke in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, um Blut zu entfernen. Übertragen des Gewebes zu 250 ml Kunststoffflaschen mit F12-Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium F12) ohne Phenolrot mit 2% Penicillin / Streptomycin (einschließlich 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 g / ml Streptomycin) und 1% eintibiotic / Amphotericin B (einschließlich 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B). Speicher Gewebe in dem Medium für den Transport zum Labor. </li><li> Bereiten Stücke 3-5 mm Durchmesser für RNA- und Protein-Extraktion und Flash frieren sie in Kryoröhrchen mit kaltem (Trockeneis) Isopentan. Übertragen Sie sie auf Trockeneis-Box für den Transport zum Labor. </li><li> Setzen Stücke 3-5 mm in die Form und decken Sie es mit einer Schicht von optimalen Schnitttemperatur (OAT) und dann die Form auf dem flachen Boden der Box mit kaltem Isopentan gefüllt. Nach vollständigem Einfrieren übertragen Sie die Form auf die Trockeneis-Box. </li><li> Fix 5 Stück 3 - 5 mm Durchmesser in Paraformaldehyd (PFA) 4% und noch 5 Stück in Formaldehyd (FA) 4% in PBS bei RT histologische Analyse später. Zwei verschiedene Fixiermittel werden empfohlen, da einige Antikörper besser mit dem einen oder anderen der beiden. </li></ol> Im Labor: <ol start="8"><li> Tuncument alle Informationen über die Brustverkleinerung, werden Operationsdatum und ob die Proben aus linken und rechten Brust abgeleitet. </li><li> Legen Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C und übertragen Sie die fixierten Gewebe in der Histologie Kassetten nach 2 h der Fixierung. Dann setzen sie entweder in PBS oder 70% Ethanol, zum O / N Lagerung bei 4 ° C. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 2. Die Gewebeaufschluss und Hormonstimulation <ol><li> Übertragen Sie die Flaschen mit den Gewebeproben auf eine Sterilbank in einer P2 Zellkulturraum. Zeigen Gewebestücke auf sterilen Schneidebrett (29 x 19 cm). Halten Sie das Material mit einer Pinzette und kratzen die restlichen Fett und Behälter weg von der Drüsenkörper (weißer Teil) mit Skalpell. Legen Sie das weiße Material in PBS in einer 10 cm Kulturschale. </li><li> Nach dem Entfernen des Fettmaterials aus allen Stücken und Entsorgen sie nach der Sicherheitsregels des Labors, legen Sie die weißen Teile mit den epithelialen Geweben zurück auf dem Schneidebrett. Mit entgegen Skalpelle schneiden das Gewebe und hacken sie in Stücke von bis zu 2 mm Durchmesser. </li><li> Legen Sie die gehackte Material in Röhren von ausreichender Größe: bis zu 1, 2.5 und 10 ml in einen 5, 15 oder 50-ml-Röhrchen auf. Regel ergibt sich eine 5-ml-Tube Erträge genug Material für Paraffineinbettung und Hormonstimulationen, und ein 15-ml-Tube Erträge genug Material für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Größere Rohre zum Einfrieren Aliquote verwendet. </li><li> Bereiten Verdauung Master-Mix, bestehend aus Medium (DMEM / F12 ohne Phenolrot) mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B und Kollagenase A (Clostridiopeptidase A aus Clostridium histolyticum). Dosis Kollagenase nach Aufschlusszeiten. <ol><li> 12, 24 und 36 h Inkubation verwenden Endkonzentration von Kollagenase von 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml und 0,5 mg / ml. Fügen Verdauung Mastermix bis zu 4 mal derVolumen des aufgeschlossenen Material eine ausreichende Bewegung und Belüftung zu gewährleisten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Versuchsanordnung und der Dauer der Hormonstimulation, fügen Hormone entweder während oder nach der enzymatischen Aufschlußschritt und Mikro Erholung. </li></ol></li><li> Hinzufügen Hormon (e) bei gewünschten Konzentration Proben und das Fahrzeug zu der Kontroll testen. Für die Stimulation mit 17-β-Östradiol und Promegeston (R5020) verwenden eine Endkonzentration von 20 nM. HINWEIS: R5020 ist ein synthetisches Progesteron-Rezeptor-Agonist, der stabiler ist als natürliches Progesteron im Medium ist. <ol><li> Die Röhrchen auf dem Rollenmischer innerhalb einem Brutschrank bei 37 ° C und 40 rpm O / N. Vor dem Einsetzen der Proben auf dem Mischer resuspendieren sie sehr gut, um zu gewährleisten, dass alle wesentlichen verteilt entlang der Zentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Wie die Verdauung dauert mindestens 12 Stunden (O / N), für die Hormonstimulation Zeiten von weniger als 12 Stunden, fügen Sie die Hormone nach der Wiederherstellung der Mikrostrukturen (deunter Schritt 3 tailed). Fügen Sie die Hormone, wie Sie die Mikrostrukturen zu resuspendieren und legen Sie die Suspension auf ultra-niedrige Befestigungsplatten. Gewebemikrostrukturen auf ultra-niedrige Befestigungsplatten für bis zu 7 Tage in Wachstumsfaktor-freiem Medium zu bewahren etwa 70% Lebensfähigkeit gehalten werden. </li><li> Für RNA- und Protein-Analyse, sammeln Gewebemikrostrukturen durch Zentrifugation bei 400 xg für 5 min und Flash-Freeze in Zentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Wiederherstellung von Gewebe-Mikrostrukturen <ol><li> Zentrifugieren (n) bei 400 xg für 5 min. Absaugen Fett von der Spitze des Zentrifugenröhrchens und den Überstand des verbleibenden wäßrigen Flüssigkeitsüberstand, die in Fibroblasten angereichert ist, um ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 1250 × g für 5 min. HINWEIS: Da die Brustgewebe Mikrostrukturen sind sehr klebrig, für alle folgenden Schritte das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre. Pipettieren wird wegen der Gefahr, die Materialien empfohlen. </li&gt; <li> Resuspendieren des Pellets in Mikrostrukturen und in Fibroblasten von wäßrigen Flüssigkeitsüberstand in PBS, 2% fötales Kälberserum (FCS) angereichert ist, abgeleitet. Beide Schläuche Anschließend drehen sich mit 1250 xg für 5 min und dann verwerfen Sie die Überstände. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 3-5 ml Erythrozytenblut Lysepuffer und sie auf Rohre reinigen. Inkubieren für 5 min bei RT. </li><li> Hinzufügen 2x Volumen PBS, 2% FCS und zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Waschen der Pellets mit PBS, 2% FCS und Zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li></ol> 4. Proben für die Durchflusszytometrie <ol><li> Fügen Sie 1-2 ml Trypsin 0,25% zu dem Pellet und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren sehr schonend für 2 min mit einem 1000 ul Pipetman, um Zellen zu trennen. </li><li> Hemmt Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 9 ml PBS, 2% FCS. Zentrifuge bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 10 ml PBS, 2% FCS. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 40 um Zellsieb auf T platziertop einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf einzelne Zellen herzustellen. Wenn ein paar Mikroliter der Zellsuspension bleiben auf der Oberseite des Filters, damit sie durch den Filter durch Absaugen sie von der anderen Seite des Sieb mit einer Pipette und fügen Sie sie zu den gefilterten Mikrostrukturen. </li><li> Separate Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen von Mikrostrukturen mit einem Cocktail von Anti-CD45, anti-FAP und Anti-CD31-Antikörper und dann sortieren sie mit FACS, basierend auf pan-epithelialen Marker EpCAM und CD10 auf luminalen und basalen Zellen bzw. trennen 10 . </li></ol> 5. Die Proben für die Histologie <ol><li> Nach dem Waschen der mechanisch und enzymatisch abgebaute Material, wie oben beschrieben, zu fixieren Pellets von 1,5 ml Ausgangsmaterial in 1 ml 4% PFA in PBS bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.250 xg für 5 Minuten und wäscht mit 1-2 ml PBS zweimal. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min. Während dieser Zeit vorzubereiten 1% Mehrzweck-Agarose in Tris-Acetat-EDTA (TAE-Puffer) und erhitzt die Lösung in der Mikrowelle, bis die Lösung zum Sieden kommt. <ol><li> Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und die Flasche vorsichtig schwenken, um die Lösung zu mischen und resuspendieren alle verbleibenden Agarosepartikel. Kühle Agaroselösung bis 50 ° C und gießen 1 ml in einem Paraffinbasisform Größe 31 × 23 × 13,5 mm. </li></ol></li><li> Überstand verwerfen und legen Sie die Pellets auf der verfestigten Schicht (1 - 3 mm) aus Agarose mit einem Spatel mit einem flachen Ende. Decken Sie sie alle mit einer zusätzlichen Schicht aus Agarose (40 ° C). </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt, in der Regel innerhalb von 5 Minuten, legen Sie die Agarose-Blöcke in die Histologie Kassetten für Paraffineinbettung. Zusammen mit der Agarose-Proben stellen einen weißen Büro Papier in der Kassette mit allen Informationen über die Brustverkleinerung Zahl, Versuchsbedingungen, und das Datum in kleiner Schrift mit Bleistift geschrieben; dies schriftlich wider alle weiteren Behandlungsschritte. </li><li> Setzen Sie die Kassetten inPBS O / N, oder in 70% Ethanol für die Lagerung über das Wochenende bei 4 ° C. Wir haben keinen Unterschied zwischen den beiden Speicherlösungen bemerkt. Dann Transfer Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 6. Gefriermikrostrukturen (Future Kultivierung) <ol><li> Resuspendieren Gewebemikrostrukturen in Einfriermedium bestehend aus FCS mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und gefrier 1 ml Aliquots in Kryoröhrchen. Die Anzahl der erhaltenen Kryoröhrchen hängt von der Menge von Brustverkleinerung erhalten Vormaterial. </li><li> Einfrieren der Kryoröhrchen enthaltenden Gewebemikrostrukturen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank mit dem folgenden Programm: 5 min Verweilen bei 4 ° C, Absenken der Temperatur auf -7 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, die Verringerung der Temperatur auf -12 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, 10 min Behausung, Absenken der Temperatur auf -40 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, Abnahme der Temperatur auf -80 ° C mitGeschwindigkeit von 6 ° C / min. Dann übertragen Sie die Kryoröhrchen bis -80 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Am nächsten Tag, übertragen die Kryoröhrchen von -80 ° C bis Flüssigstickstofftank für lange Lagerung. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene ex vivo Kultur vorsieht Brustgewebe Mikro enthaltende intakte Kanäle und Läppchen, zusammen mit anderen Zelltypen, die normalerweise im menschlichen weiblichen Brust gefunden. Bei der Verarbeitung des menschlichen Brustgewebe gewöhnlich durch Reduktion mammoplasties erhalten, Entfernung von Fettgewebe, mechanische und enzymatische Verdauung des Stromamatrix und Lyse roter Blutkörperchen reichert Milchkanal Fragmente und Klemmen duktalen lobulären Einheiten. Gentle enzymatische Verdauung an...

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informationen über die Mutations Landschaft in Brustkrebs ist in hohem Tempo zu. Weniger Aufmerksamkeit wurde auf systemische Faktoren, die die Entstehung von Brustkrebs beeinflussen bezahlt worden. Die Exposition gegenüber Fortpflanzungshormone hat einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf 1-3. Dennoch sind die Mechanismen, durch die Fortpflanzungshormone treffen auf die menschliche Brust kaum verstanden. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mausmodellen hat ergeben, dass sie Zell intrinsische und parakrine Signal durch mehrere Effektoren 4 einzubeziehen. Die begrenzte Wissen über die Hormonwirkung in der menschlichen Brust ist vor allem auf das Fehlen angemessener Modelle. Die meisten arbeiten auf die Mechanismen der Östrogenrezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) Signalisierung Hormonrezeptor-positiven Brustkrebszelllinien, wie zum Beispiel MCF-7 und T47D geführt. Diese wurden aus Pleuraergüsse von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die alrea hatte abgeleitetdy erhielt mehrere Behandlungen 5. Die biologische Relevanz der Ergebnisse in einer solchen einfachen in vitro-Modellen der menschlichen Brust ist fragwürdig und Zielgene in diesen in vitro-Modellen identifiziert sind unterscheiden sich von Zielgenen, die in Tiermodellen 6 identifiziert. Beim primären menschlichen Brust Epithelzellen in vitro kultiviert werden sie neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression und damit Hormonantwort 7,8 verlieren. Dieses Problem kann durch anspruchsvolle 3D-Ansätze mit Matrigel circumventd werden. Auf diese Weise, C. Clarke und Mitarbeitern gelang Festlegung Brustepithelzellen die Hormon-Rezeptor-Expression erhalten und zeigte eine proliferative Reaktion auf Progesteron Stimulation 9. Noch zwei in vivo Progesteronrezeptorzielgene wichtig, Wnt-4 und RANKL, wurden nicht von Progesteron Stimulation in diesem System 9 induziert. Dieser Ansatz wurde kürzlich weiter mit in vitro genommen </em&gt; Hormonvorbehandlung und RANKL Induktion 10 erreicht. Ein Vorbehalt bleibt, dass Matrigel hat Aktivitäten, die chargenabhängig sind, ist teuer und erfordert eine Versuchsanordnung, die geeignet sind für kleine Zahlen nur Zelle ist. Basierend auf der Erkenntnis, dass in vivo ER und PR-Signalisierung werden weitgehend durch parakrine Interaktion 11 vermittelten wir argumentiert, daß die intrazellulären Wechselwirkungen beibehalten werden müssen. Ein weiterer wichtiger Faktor, der als Gewebe verloren werden, um einzelne Zellen zur in vitro Kultur dissoziiert sind die Wechselwirkungen der Epithelzellen mit der extrazellulären Matrix; doch diese sind entscheidend für die epitheliale Differenzierung und ihre Störung ist in der Tumorgenese 12 wichtig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, um Brustgewebe Mikrostrukturen aus frischen chirurgischen Ablagematerial 13 zu isolieren. Das Brustdrüsengewebe, bestehend aus einem zweischichtigen Epithel mit inneren und äußeren Lumen myoepithelial Zellen wird von Fettgewebe präpariert und in mechanische und enzymatische Dissoziation unterworfen. Nach dem Waschen und Zentrifugation werden Fragmente der Milchgänge erhalten, die auf enger Interaktion mit vielen Stromazellen behalten. Diese Gewebemikrostrukturen bleiben Hormon reagieren. Das Modell wurde in klinischen Proben 13 validiert. Als solches kann das vorliegende Verfahren dazu beitragen, die Hormonwirkung in der Brust in einem biologisch und klinisch relevanten Kontext zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

Das Studium der Hormonwirkung in der menschlichen Brust durch Mangel an geeigneten Modellsystemen behindert. Bei der In-vitro-Kultur, Grund Brustepithelzellen neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression zu verlieren. Weit verbreitete Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs-Zelllinien sind von begrenzter Relevanz für die in vivo-Situation. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren. Frische menschlichem Brustgewebe Proben aus chirurgischen Ablagematerial wie Reduktion mammoplasties oder mammectomies mechanisch und enzymatisch verdaut, um Gewebefragmente, die Kanäle und Läppchen und mehrere Stroma-Zelltypen zu erhalten. Diese Gewebemikrostrukturen in Basismedium ohne Wachstumsfaktoren gehalten bewahren ihre interzellulären Kontakte, die Gewebearchitektur und bleiben Hormon für einige Tage reagiert. Sie sind ohne weiteres für RNA- und Proteinextraktion, histologische Analyse bearbeitet oder in Gefriermedium gespeichert. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische Zellpopulationen anzureichern. Dieses Protokoll bietet eine einfache, Standardansatz für die translationale Studien mit sehr komplexen, vielfältigen menschlichen Proben.

Um die Rolle von Östrogen und Progesteron zu studieren und ihre molekularen Funktionen in der menschlichen Brust, besser zu verstehen, erfassen wir frischen menschlichen Brustgewebeproben von Patienten, die eine Reduzierung mammoplasties (Abbildung 1) nach Erlangung ihrer Einwilligung nach Aufklärung. Wir erhalten auch medizinische und Fortpflanzungsgeschichte der Patienten sowie eine Blutprobe an Serumprogesteronspiegel zum Zeitpunkt der Operation zu bestimmen. Gewebe aus frischen Reduzierung mammopl...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K Aufrufe.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert. 

Serie: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Forschung

Krebsforschung

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Biotechnik

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Medizin

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Ein

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