Die Autoren danken M. Fiche von Universitätsspital Lausanne für die Bereitstellung der mammoplasty Foto, M. Wirth und A. Ayyanan der Schweizerischen Institut für Experimentelle Krebsforschung, National Center of Competence in Research Molekulare Onkologie, School of Life Sciences, Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne für die technische Unterstützung und R. Clarke der Universität Manchester für Kritik. Die Forschung, die diese Ergebnisse Unterstützung SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, und die Initiative Innovative Arzneimittel gemeinsames Unternehmen gemäß Finanzhilfevereinbarung erhalten hat, nicht. 115.188, Ressourcen, von denen der Finanzbeitrag aus dem Siebten Rahmenprogramm der EU (FP7 / 2007-2013) und European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Unternehmen in Sachleistungen bestehen. Die Web-Adresse der Initiative Innovative Arzneimittel ist <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Allgemeine Überlegungen: Der Zeit voraus, bis eine Ethik-Protokoll eingestellt, bereiten Fragebögen für Patienten, und sehen auf die Ausbildung der Klinikpersonal. Bevor Sie Material aus Brustverkleinerung Chirurgie, beschaffen Genehmigungen und sorgen Zustimmung des Patienten. Gewebe können infektiös sein und muss entsprechend behandelt werden. Schweizerisches Institut für experimentelle Krebsforschung - Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der ISREC zugelassen. 1. Die Gewebewiederherstellung, Herstellung und Bio-Banking Um eine optimale Probenqualität für bio-Banking zu gewährleisten, sind eine Reihe von Schritten, die im Krankenhaus vor dem Labor transportiert geführt. Im Krankenhaus: <ol><li> Erhalten menschlichen Brustgewebe unter sterilen Bedingungen aus Brustverkleinerung Chirurgie und Blutproben, falls erforderlich. Tissue muss von Pathologen, probieren wird, um die Anwesenheit von malignen Läsionen auszuschließen untersucht werden. </li><li> Setzen Sie den Brust tAusgabe unter der Haube auf einem sterilen Bord und bereiten Schere, chirurgische Skalpell und Pinzette, die bereits mit Dampf sterilisiert werden. Stellen tiefen Schnitt an verschiedenen Standorten des Brustgewebe mit einem Skalpell zu öffnen. In menschlichem Brustgewebe Ihre weißen Litzen aus Leitungen und Läppchen, die in gelben Fettgewebe eingebettet sind. ANMERKUNG: Das Verhältnis der weißen parenchymalen zum gelben Fettgewebe unterscheidet bei Frauen; Regel jüngere Frauen haben mehr Epithelgewebe. </li><li> Wählen Stücke aus weißem Material und halten Sie sie mit einer Pinzette, dann trennen Sie diese vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Schere. Vermeiden Sie, die Blutgefäße. </li><li> Rinse Gewebestücke in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, um Blut zu entfernen. Übertragen des Gewebes zu 250 ml Kunststoffflaschen mit F12-Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium F12) ohne Phenolrot mit 2% Penicillin / Streptomycin (einschließlich 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 g / ml Streptomycin) und 1% eintibiotic / Amphotericin B (einschließlich 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B). Speicher Gewebe in dem Medium für den Transport zum Labor. </li><li> Bereiten Stücke 3-5 mm Durchmesser für RNA- und Protein-Extraktion und Flash frieren sie in Kryoröhrchen mit kaltem (Trockeneis) Isopentan. Übertragen Sie sie auf Trockeneis-Box für den Transport zum Labor. </li><li> Setzen Stücke 3-5 mm in die Form und decken Sie es mit einer Schicht von optimalen Schnitttemperatur (OAT) und dann die Form auf dem flachen Boden der Box mit kaltem Isopentan gefüllt. Nach vollständigem Einfrieren übertragen Sie die Form auf die Trockeneis-Box. </li><li> Fix 5 Stück 3 - 5 mm Durchmesser in Paraformaldehyd (PFA) 4% und noch 5 Stück in Formaldehyd (FA) 4% in PBS bei RT histologische Analyse später. Zwei verschiedene Fixiermittel werden empfohlen, da einige Antikörper besser mit dem einen oder anderen der beiden. </li></ol> Im Labor: <ol start="8"><li> Tuncument alle Informationen über die Brustverkleinerung, werden Operationsdatum und ob die Proben aus linken und rechten Brust abgeleitet. </li><li> Legen Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C und übertragen Sie die fixierten Gewebe in der Histologie Kassetten nach 2 h der Fixierung. Dann setzen sie entweder in PBS oder 70% Ethanol, zum O / N Lagerung bei 4 ° C. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 2. Die Gewebeaufschluss und Hormonstimulation <ol><li> Übertragen Sie die Flaschen mit den Gewebeproben auf eine Sterilbank in einer P2 Zellkulturraum. Zeigen Gewebestücke auf sterilen Schneidebrett (29 x 19 cm). Halten Sie das Material mit einer Pinzette und kratzen die restlichen Fett und Behälter weg von der Drüsenkörper (weißer Teil) mit Skalpell. Legen Sie das weiße Material in PBS in einer 10 cm Kulturschale. </li><li> Nach dem Entfernen des Fettmaterials aus allen Stücken und Entsorgen sie nach der Sicherheitsregels des Labors, legen Sie die weißen Teile mit den epithelialen Geweben zurück auf dem Schneidebrett. Mit entgegen Skalpelle schneiden das Gewebe und hacken sie in Stücke von bis zu 2 mm Durchmesser. </li><li> Legen Sie die gehackte Material in Röhren von ausreichender Größe: bis zu 1, 2.5 und 10 ml in einen 5, 15 oder 50-ml-Röhrchen auf. Regel ergibt sich eine 5-ml-Tube Erträge genug Material für Paraffineinbettung und Hormonstimulationen, und ein 15-ml-Tube Erträge genug Material für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Größere Rohre zum Einfrieren Aliquote verwendet. </li><li> Bereiten Verdauung Master-Mix, bestehend aus Medium (DMEM / F12 ohne Phenolrot) mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B und Kollagenase A (Clostridiopeptidase A aus Clostridium histolyticum). Dosis Kollagenase nach Aufschlusszeiten. <ol><li> 12, 24 und 36 h Inkubation verwenden Endkonzentration von Kollagenase von 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml und 0,5 mg / ml. Fügen Verdauung Mastermix bis zu 4 mal derVolumen des aufgeschlossenen Material eine ausreichende Bewegung und Belüftung zu gewährleisten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Versuchsanordnung und der Dauer der Hormonstimulation, fügen Hormone entweder während oder nach der enzymatischen Aufschlußschritt und Mikro Erholung. </li></ol></li><li> Hinzufügen Hormon (e) bei gewünschten Konzentration Proben und das Fahrzeug zu der Kontroll testen. Für die Stimulation mit 17-β-Östradiol und Promegeston (R5020) verwenden eine Endkonzentration von 20 nM. HINWEIS: R5020 ist ein synthetisches Progesteron-Rezeptor-Agonist, der stabiler ist als natürliches Progesteron im Medium ist. <ol><li> Die Röhrchen auf dem Rollenmischer innerhalb einem Brutschrank bei 37 ° C und 40 rpm O / N. Vor dem Einsetzen der Proben auf dem Mischer resuspendieren sie sehr gut, um zu gewährleisten, dass alle wesentlichen verteilt entlang der Zentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Wie die Verdauung dauert mindestens 12 Stunden (O / N), für die Hormonstimulation Zeiten von weniger als 12 Stunden, fügen Sie die Hormone nach der Wiederherstellung der Mikrostrukturen (deunter Schritt 3 tailed). Fügen Sie die Hormone, wie Sie die Mikrostrukturen zu resuspendieren und legen Sie die Suspension auf ultra-niedrige Befestigungsplatten. Gewebemikrostrukturen auf ultra-niedrige Befestigungsplatten für bis zu 7 Tage in Wachstumsfaktor-freiem Medium zu bewahren etwa 70% Lebensfähigkeit gehalten werden. </li><li> Für RNA- und Protein-Analyse, sammeln Gewebemikrostrukturen durch Zentrifugation bei 400 xg für 5 min und Flash-Freeze in Zentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Wiederherstellung von Gewebe-Mikrostrukturen <ol><li> Zentrifugieren (n) bei 400 xg für 5 min. Absaugen Fett von der Spitze des Zentrifugenröhrchens und den Überstand des verbleibenden wäßrigen Flüssigkeitsüberstand, die in Fibroblasten angereichert ist, um ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 1250 × g für 5 min. HINWEIS: Da die Brustgewebe Mikrostrukturen sind sehr klebrig, für alle folgenden Schritte das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre. Pipettieren wird wegen der Gefahr, die Materialien empfohlen. </li&gt; <li> Resuspendieren des Pellets in Mikrostrukturen und in Fibroblasten von wäßrigen Flüssigkeitsüberstand in PBS, 2% fötales Kälberserum (FCS) angereichert ist, abgeleitet. Beide Schläuche Anschließend drehen sich mit 1250 xg für 5 min und dann verwerfen Sie die Überstände. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 3-5 ml Erythrozytenblut Lysepuffer und sie auf Rohre reinigen. Inkubieren für 5 min bei RT. </li><li> Hinzufügen 2x Volumen PBS, 2% FCS und zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Waschen der Pellets mit PBS, 2% FCS und Zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li></ol> 4. Proben für die Durchflusszytometrie <ol><li> Fügen Sie 1-2 ml Trypsin 0,25% zu dem Pellet und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren sehr schonend für 2 min mit einem 1000 ul Pipetman, um Zellen zu trennen. </li><li> Hemmt Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 9 ml PBS, 2% FCS. Zentrifuge bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 10 ml PBS, 2% FCS. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 40 um Zellsieb auf T platziertop einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf einzelne Zellen herzustellen. Wenn ein paar Mikroliter der Zellsuspension bleiben auf der Oberseite des Filters, damit sie durch den Filter durch Absaugen sie von der anderen Seite des Sieb mit einer Pipette und fügen Sie sie zu den gefilterten Mikrostrukturen. </li><li> Separate Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen von Mikrostrukturen mit einem Cocktail von Anti-CD45, anti-FAP und Anti-CD31-Antikörper und dann sortieren sie mit FACS, basierend auf pan-epithelialen Marker EpCAM und CD10 auf luminalen und basalen Zellen bzw. trennen 10 . </li></ol> 5. Die Proben für die Histologie <ol><li> Nach dem Waschen der mechanisch und enzymatisch abgebaute Material, wie oben beschrieben, zu fixieren Pellets von 1,5 ml Ausgangsmaterial in 1 ml 4% PFA in PBS bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.250 xg für 5 Minuten und wäscht mit 1-2 ml PBS zweimal. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min. Während dieser Zeit vorzubereiten 1% Mehrzweck-Agarose in Tris-Acetat-EDTA (TAE-Puffer) und erhitzt die Lösung in der Mikrowelle, bis die Lösung zum Sieden kommt. <ol><li> Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und die Flasche vorsichtig schwenken, um die Lösung zu mischen und resuspendieren alle verbleibenden Agarosepartikel. Kühle Agaroselösung bis 50 ° C und gießen 1 ml in einem Paraffinbasisform Größe 31 × 23 × 13,5 mm. </li></ol></li><li> Überstand verwerfen und legen Sie die Pellets auf der verfestigten Schicht (1 - 3 mm) aus Agarose mit einem Spatel mit einem flachen Ende. Decken Sie sie alle mit einer zusätzlichen Schicht aus Agarose (40 ° C). </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt, in der Regel innerhalb von 5 Minuten, legen Sie die Agarose-Blöcke in die Histologie Kassetten für Paraffineinbettung. Zusammen mit der Agarose-Proben stellen einen weißen Büro Papier in der Kassette mit allen Informationen über die Brustverkleinerung Zahl, Versuchsbedingungen, und das Datum in kleiner Schrift mit Bleistift geschrieben; dies schriftlich wider alle weiteren Behandlungsschritte. </li><li> Setzen Sie die Kassetten inPBS O / N, oder in 70% Ethanol für die Lagerung über das Wochenende bei 4 ° C. Wir haben keinen Unterschied zwischen den beiden Speicherlösungen bemerkt. Dann Transfer Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 6. Gefriermikrostrukturen (Future Kultivierung) <ol><li> Resuspendieren Gewebemikrostrukturen in Einfriermedium bestehend aus FCS mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und gefrier 1 ml Aliquots in Kryoröhrchen. Die Anzahl der erhaltenen Kryoröhrchen hängt von der Menge von Brustverkleinerung erhalten Vormaterial. </li><li> Einfrieren der Kryoröhrchen enthaltenden Gewebemikrostrukturen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank mit dem folgenden Programm: 5 min Verweilen bei 4 ° C, Absenken der Temperatur auf -7 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, die Verringerung der Temperatur auf -12 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, 10 min Behausung, Absenken der Temperatur auf -40 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, Abnahme der Temperatur auf -80 ° C mitGeschwindigkeit von 6 ° C / min. Dann übertragen Sie die Kryoröhrchen bis -80 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Am nächsten Tag, übertragen die Kryoröhrchen von -80 ° C bis Flüssigstickstofftank für lange Lagerung. </li></ol>

<ol>
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C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+the+FACS:+a+devil+in+the+details.">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene ex vivo Kultur vorsieht Brustgewebe Mikro enthaltende intakte Kanäle und Läppchen, zusammen mit anderen Zelltypen, die normalerweise im menschlichen weiblichen Brust gefunden. Bei der Verarbeitung des menschlichen Brustgewebe gewöhnlich durch Reduktion mammoplasties erhalten, Entfernung von Fettgewebe, mechanische und enzymatische Verdauung des Stromamatrix und Lyse roter Blutkörperchen reichert Milchkanal Fragmente und Klemmen duktalen lobulären Einheiten. Gentle enzymatische Verdauung an...

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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informationen über die Mutations Landschaft in Brustkrebs ist in hohem Tempo zu. Weniger Aufmerksamkeit wurde auf systemische Faktoren, die die Entstehung von Brustkrebs beeinflussen bezahlt worden. Die Exposition gegenüber Fortpflanzungshormone hat einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf 1-3. Dennoch sind die Mechanismen, durch die Fortpflanzungshormone treffen auf die menschliche Brust kaum verstanden. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mausmodellen hat ergeben, dass sie Zell intrinsische und parakrine Signal durch mehrere Effektoren 4 einzubeziehen. Die begrenzte Wissen über die Hormonwirkung in der menschlichen Brust ist vor allem auf das Fehlen angemessener Modelle. Die meisten arbeiten auf die Mechanismen der Östrogenrezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) Signalisierung Hormonrezeptor-positiven Brustkrebszelllinien, wie zum Beispiel MCF-7 und T47D geführt. Diese wurden aus Pleuraergüsse von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die alrea hatte abgeleitetdy erhielt mehrere Behandlungen 5. Die biologische Relevanz der Ergebnisse in einer solchen einfachen in vitro-Modellen der menschlichen Brust ist fragwürdig und Zielgene in diesen in vitro-Modellen identifiziert sind unterscheiden sich von Zielgenen, die in Tiermodellen 6 identifiziert. Beim primären menschlichen Brust Epithelzellen in vitro kultiviert werden sie neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression und damit Hormonantwort 7,8 verlieren. Dieses Problem kann durch anspruchsvolle 3D-Ansätze mit Matrigel circumventd werden. Auf diese Weise, C. Clarke und Mitarbeitern gelang Festlegung Brustepithelzellen die Hormon-Rezeptor-Expression erhalten und zeigte eine proliferative Reaktion auf Progesteron Stimulation 9. Noch zwei in vivo Progesteronrezeptorzielgene wichtig, Wnt-4 und RANKL, wurden nicht von Progesteron Stimulation in diesem System 9 induziert. Dieser Ansatz wurde kürzlich weiter mit in vitro genommen </em&gt; Hormonvorbehandlung und RANKL Induktion 10 erreicht. Ein Vorbehalt bleibt, dass Matrigel hat Aktivitäten, die chargenabhängig sind, ist teuer und erfordert eine Versuchsanordnung, die geeignet sind für kleine Zahlen nur Zelle ist. Basierend auf der Erkenntnis, dass in vivo ER und PR-Signalisierung werden weitgehend durch parakrine Interaktion 11 vermittelten wir argumentiert, daß die intrazellulären Wechselwirkungen beibehalten werden müssen. Ein weiterer wichtiger Faktor, der als Gewebe verloren werden, um einzelne Zellen zur in vitro Kultur dissoziiert sind die Wechselwirkungen der Epithelzellen mit der extrazellulären Matrix; doch diese sind entscheidend für die epitheliale Differenzierung und ihre Störung ist in der Tumorgenese 12 wichtig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, um Brustgewebe Mikrostrukturen aus frischen chirurgischen Ablagematerial 13 zu isolieren. Das Brustdrüsengewebe, bestehend aus einem zweischichtigen Epithel mit inneren und äußeren Lumen myoepithelial Zellen wird von Fettgewebe präpariert und in mechanische und enzymatische Dissoziation unterworfen. Nach dem Waschen und Zentrifugation werden Fragmente der Milchgänge erhalten, die auf enger Interaktion mit vielen Stromazellen behalten. Diese Gewebemikrostrukturen bleiben Hormon reagieren. Das Modell wurde in klinischen Proben 13 validiert. Als solches kann das vorliegende Verfahren dazu beitragen, die Hormonwirkung in der Brust in einem biologisch und klinisch relevanten Kontext zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

Das Studium der Hormonwirkung in der menschlichen Brust durch Mangel an geeigneten Modellsystemen behindert. Bei der In-vitro-Kultur, Grund Brustepithelzellen neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression zu verlieren. Weit verbreitete Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs-Zelllinien sind von begrenzter Relevanz für die in vivo-Situation. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren. Frische menschlichem Brustgewebe Proben aus chirurgischen Ablagematerial wie Reduktion mammoplasties oder mammectomies mechanisch und enzymatisch verdaut, um Gewebefragmente, die Kanäle und Läppchen und mehrere Stroma-Zelltypen zu erhalten. Diese Gewebemikrostrukturen in Basismedium ohne Wachstumsfaktoren gehalten bewahren ihre interzellulären Kontakte, die Gewebearchitektur und bleiben Hormon für einige Tage reagiert. Sie sind ohne weiteres für RNA- und Proteinextraktion, histologische Analyse bearbeitet oder in Gefriermedium gespeichert. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische Zellpopulationen anzureichern. Dieses Protokoll bietet eine einfache, Standardansatz für die translationale Studien mit sehr komplexen, vielfältigen menschlichen Proben.

Um die Rolle von Östrogen und Progesteron zu studieren und ihre molekularen Funktionen in der menschlichen Brust, besser zu verstehen, erfassen wir frischen menschlichen Brustgewebeproben von Patienten, die eine Reduzierung mammoplasties (Abbildung 1) nach Erlangung ihrer Einwilligung nach Aufklärung. Wir erhalten auch medizinische und Fortpflanzungsgeschichte der Patienten sowie eine Blutprobe an Serumprogesteronspiegel zum Zeitpunkt der Operation zu bestimmen. Gewebe aus frischen Reduzierung mammopl...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K Aufrufe.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert. 

Serie: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Forschung

Medizin

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...