Die Finanzierung für dieses Projekt wird von der Clayton-Stiftung für Forschung und die Retina Research Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der Retinoblastom tumorspheres <ol><li> Erhalten Retinoblastom Tumor Probe unter einem IRB-genehmigten Protokoll. </li><li> Bereiten Sie frische definiert Stammzellen Medien (Neurobasal-A Media, 1x B-27 Ergänzung minus Vitamin A, 1X Nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 1x L-Glutamin, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). </li><li> Mechanisch disaggregate das Tumorgewebe mit einem Skalpell mit einem Querschnittsthema Technik in eine sterile, Gewebekultur-behandelten 6-Well-Platte. Sofort im 100 L definiert Stammzellen Medien, um das Gewebe und sanft verteilen das zerkleinerte Gewebe mit dem Skalpell. 5 ml definiert Stammzellen Medien zum Brunnen. </li><li> Bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator und inspizieren täglich. Einige tumorspheres sollte aus dem gestörten Tumorgewebe fast sofort entstehen, mit steigenden Zahlen im Laufe von 2-4 Tagen. </li><li> Wöchentlich, Zentrifuge tumorspheres bei 300xg für 5 Minuten in frisch zubereiteten definiert Stammzellen Medien resuspendieren und Pipette nach oben und unten 10 mal größeren, zentral nekrotischen Bereichen zu stören und damit neue, gesunde Kugeln zu bilden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tumorzellen zur Injektion <ol><li> Sollte das Spritzen kultivierten tumorspheres vorsichtig pipet Kugeln in einem 15-mL konischen Rohr. Vorsichtig pipet oben und unten mit einer serologischen Pipette 10-15 Mal auf die Bereiche zu stören. </li><li> Zählen Sie die Zellen injiziert mit einer Hämazytometer und aliquoten mindestens 50.000 Zellen pro Injektion in ein neues Röhrchen werden. Bereiten Sie sich auf so viele Injektionen wie möglich auf die Anzahl der Zellen Verfügung stehen. </li><li> Zentrifuge bei 300xg für 5 Minuten. Vorsichtig absaugen den Überstand und resuspendieren in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration und resuspendieren in 10 ul PBS pro Injektion. </li></ol> 3. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Mit einer Insulin-Spritze verabreichen eine intraperitoneale Injektion von Nagetier Anästhesie-Cocktail (Ketamin 37,6 mg / ml, 1,92 mg Xylazin / ml, Acepromazin 0,38 mg / mL) bei 1 mL pro Gramm Körpergewicht (GBW). Warten Sie 5 Minuten für das Tier zu werden sediert. Überprüfen Sie Herzschlag und Ort des Tieres auf einem Heizkissen. Halten Sie Tiere auf einem Heizkissen jederzeit bis zur Genesung. </li><li> Nach Sedierung, verwalten 1 Tropfen Proparacain HCl auf dem rechten Auge. Ersetzen Tier auf Heizkissen und 1 Minute warten. </li><li> Verwalten 1 Tropfen Phenylephrin HCI auf dem rechten Auge. Ersetzen Sie das Tier auf dem Heizkissen und 5 Minuten warten. Wenn Erweiterung der Pupille nicht aufgetreten ist, erneut zu verwalten 1 Tropfen und weitere 5 Minuten warten. </li><li> Monitor auf Anzeichen von Bewegung oder Zuckungen, die bei&gt; 30 Minuten nach der Sedierung auftreten können. Auf den ersten Anzeichen für eine Bewegung, zu verwalten 1 ul / GBW von Ketamin HCl (verdünnt auf 10 mg / mL in PBS) und 5 Minuten warten. </li></ol> 4. Die Injektion von Tumorzellen <ol><li> Setzen Sie den narkotisierten Tier unter dem Mikroskop auf seiner Seite, mit dem rechten Auge nach oben und mit dem Kopf auf Gaze und zentriert um eine rote Reflex des rechten Auges Fundus (Schüler sollten in dieser Zeit erweitert werden) zu erhalten, wenn durch das Mikroskop beobachtet . </li><li> Prop bis die richtige Welt, indem Sie vorsichtig nach unten drücken gleichzeitig mit zwei Fingern auf den Augenlidern und halten Sie diese Position stetig für den Rest des Verfahrens. </li><li> Mit einer sterilen 30-Gauge-Nadel an einem Luer-Lock-Spritze, die Welt durchdringen seitlich durch die Bindehaut und Sklera neben dem Limbus corneae im Bereich der Pars plana (Abb. 1) und nur durch die Aderhaut in den Glaskörperraum. Entfernen Sie die Nadel aus der Öffnung. </li><li> Sterilisieren Hamilton Nadel mit einem Alkoholtupfer. Zeichnen Sie die Zellsuspension in die Hamilton-Spritze und die Nadel in die Öffnung, bis die Nadel wird visualisiert durch das Mikroskop hinter der Linse in den Glaskörper in der Nähe der Netzhaut. Mit Hilfe einer zweiten Person, während die Nadel ständig in dieser Position, drücken Sie den Kolben langsam. Entfernen Sie die Nadel. Falls erforderlich, verwenden Sie ein Wattestäbchen keine Flüssigkeit aus der Öffnung zu absorbieren. </li><li> Vorsichtig den Druck aus den Augenlidern, die Maus Augenlider zu schließen. </li><li> Verwalten 1 Tropfen Hypromellose für jedes Auge und kehren Tier Heizkissen für die Verwertung. </li></ol> 5. Die Überwachung der injizierten Mäusen und Ernte von Tumoren <ol><li> Täglich prüfen die injizierten Auge für Leukokorie (weiß papillären Reflex) und / oder periokuläre Ausdehnung, die in der Regel zeigt sich 2-4 Wochen nach der Injektion. </li><li> Sobald das Tumorwachstum festgestellt wird, Tier nach den Richtlinien des Instituts einschläfern. </li><li> Wenn das Auge des Tumors durch die Augenlider bedeckt sind, verwenden Sie das Skalpell zu zwei Schnitte senkrecht auf die Lidspalte zu machen und heben Sie die Hautlappen. </li><li> Unter Visualisierung mit dem Stereomikroskop, einen umlaufenden Schnitt am Limbus, Entfernen der Hornhaut und der Linse, und sorgfältig zu sezieren den Großteil der Tumormasse von den anderen Geweben mit tweeGefriergeräte. Ort des Tumors in sterile RPMI-1640-Medien. </li><li> Sie mit einer Pinzette langsam ziehen die offene Welt aus der Steckdose. Um zu gewährleisten, eine angehängte Sehnerv so Tumorinvasion visualisiert werden können, ziehen Sie den Globus, bis der Nerv freigelegt und mit einer Schere auf die Nerven so lange wie möglich schneiden. Legen Sie in 10% Formalin für regelmäßige Verarbeitung zur histologischen Untersuchung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Retinoblastoma tumorspheres beginnen, aus dem disaggregierten Gewebe fast sofort, als sie befreit von der Tumormasse sind, erscheinen. Innerhalb von 2-4 Tagen werden mehr tumorspheres beginnt sich zu bilden und an Größe zunehmen. Die Kugeln sind in der Regel regelmäßig und zeigen eine gut definierte, sekundäre Membran umgibt das Aggregat (Abbildung 2). Das Tier in der Regel präsentiert mit Leukokorie innerhalb von 4 Wochen nach der Injektion (Abbildung 3b), gefolgt von der Erweiterung des Erdballs und Dehnung der umgebenden Gewebe 5-8 Wochen nach der Injektion wie der Tumor wächst (Abbildung 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Querschnittsdiagramm der Maus Auge Hervorhebung Features in das Protokoll verwiesen. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Culture menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro abgebildet bei a) 4x, und b) 10-fach Objektiv Vergrößerung. Retinoblastoma primären Tumorzellen produzieren tumorspheres mit einem regelmäßigen Sphäroid Form und eine knusprige äußere Membran. Scale-Balken stellen a) 500 um, und b) 200 um. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3 Eye of Rag2 -. / - Maus zeigt a) normale Funktionen, b) Leukokorie Hinweis auf eine Tumormasse in Glaskörperraum und c) eine große Tumormasse Füllung um den Globus mit zugehörigen periokuläre Blähungen, intraokularen Blutungen.

<ol>
	<li>Ch&#232;vez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma.">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li><li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors.">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li><li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Ch&#232;vez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors:+Dependence+on+Receptor+Expression.">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Baylor College of Medicine IACUC Ausschusses durchgeführt.

Die Technik hier beschriebenen erleichtert die Ausbreitung Retinoblastom Tumoren in ihren intraokularen, intravitreale Milieu. Die intraokulare Injektion Technik hat in der Vergangenheit verwendet, um Tumore aus Retinoblastom-Zelllinien 1 sowie die virale Vektoren für die Gentherapie intraokularen 2,3 liefern zu schaffen. Diese Technik wurde inzwischen erfolgreich genutzt, um Menschen Retinoblastom Tumoren durch direkte Injektion von Zellen aus dem Primärtumor und Injektion von tumorspheres sowie serielle Ausbreitung von Xenograft zu produzieren. Sichtbares Zeichen der Tumorbildung (in der Regel Leukokorie) ist in der Regel zunächst innerhalb von 4 Wochen darauf hingewiesen, nach der intraokularen Blutungen und Ausdehnung des Globus und / oder Gewebe um die Umlaufbahn innerhalb von 5-8 Wochen entwickeln. Eine Minderheit der injizierten Mäusen verletzen das injizierte Auge, was zu einer endgültigen Schließung der Augenlider. In diesen Fällen ist Ausdehnung das einzige Zeichen der Tumorbildung. Gründung der murinen Xenograft nicht erfolgreich mit allen menschlichen Retinoblastom Tumoren, obwohl Ausbreitung von etablierten Xenograft ist höchst erfolgreich. Diese Beobachtung legt nahe, dass bestimmte Eigenschaften des Primärtumors, wie Invasivität und Ausmaß der Differenzierung oder eine andere unbekannte Faktor, kann Einfluss auf die Fähigkeit dieser Tumoren in der Maus-Okular Umwelt belasten. Die Menge des Gewebes, die von einem menschlichen Retinoblastom Tumor erworben werden können, ist recht klein, und es bestehen erhebliche Einschränkungen auf die Fähigkeit zur Kultur menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro wie begrenzte Lebensdauer, Verlust von soliden Tumoren Gewebe sowie Veränderungen in der zellulären Phänotyp. Dieses Protokoll bietet eine relativ einfache Art und Weise auf den menschlichen Tumor ausbreiten und einen Maus-Modell der menschlichen Erkrankung. Dies erlaubt eine weitere in vitro und in vivo Experimente der Biologie der Retinoblastom und längere Wartungsintervalle der Tumor außerhalb des Patienten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Phenylephrin HCl 2,5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Ophthalmic Lösung </td></tr><tr><td> 30-ga Needle </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Regelmäßige Fase </td></tr><tr><td> 10-mL Luer-Lock-Spritze </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc Insulinspritze </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte, gewebekulturbehandelten </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacain HCl 0,5% </td><td> Butler AHS </td><td> 017239 </td><td> Ophthalmic Lösung </td></tr><tr><td> Ketamin HCl 100mg/ml </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-ul Hamilton-Spritze </td><td> Hamilton Company </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga Hamilton Needle </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-04 </td><td> Kundenspezifische Länge - 0,5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-A Media </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Medien </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 005-CI </td><td></td></tr><tr><td> Disposable # 11 Scalpel </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Nager Anästhesie Combo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> In-house-Apotheke Formulierung (Ketamin 37,6 mg / ml, 1,92 mg Xylazin / ml, Acepromazin 0,38 mg / mL) </td></tr><tr><td> Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td> Rekonstituieren bei 10 ug / ml Stammlösung </td></tr><tr><td> Rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02634 </td><td> Rekonstituieren bei 10 ug / ml Stammlösung </td></tr><tr><td> OMS-75 Operationsmikroskop </td><td> Topcon Medical Systems </td><td> OMS-75 </td><td> Dieses Modell ist nicht mehr </td></tr><tr><td> 10% Formalin </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and propagation of human retinoblastoma tumors in immune deficient mice

Die Kultivierung Retinoblastom Tumorzellen in definierten Stammzellen Medien entstehen primäre tumorspheres dass gewachsen und nur für eine begrenzte Zeit aufrechterhalten werden kann. Diese kultivierten tumorspheres kann zeigen deutlich unterschiedliche zelluläre Phänotypen, wenn die ursprüngliche Tumoren verglichen. Demonstration, dass kultivierte Zellen die Fähigkeit zur Bildung neuer Tumoren haben ist wichtig um sicherzustellen, dass kultivierte Zellen-Modell der Biologie des ursprünglichen Tumors. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vermehrung menschlicher Retinoblastom Tumoren in vivo mit Rag2 - / - immungeschwächten Mäusen. Kultivierte humane Retinoblastom tumorspheres der niedrigen Passage oder Zellen aus frisch geernteten menschlichen Retinoblastom Tumor direkt in den Glaskörperraum des murinen Augen injiziert erhalten bilden Tumore innerhalb von 2-4 Wochen. Diese Tumoren können geerntet und entweder weiter in murine Augen in vivo passagiert oder gewachsen tumorspheres in vitro. Propagation wurde erfolgreich für mindestens drei Passagen wodurch eine ständige Quelle der menschlichen Retinoblastom Gewebe für weitere Experimente durchgeführt. Wesley S. Bond und Lalita Wadhwa sind Co-Erstautoren.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

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Research

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11.7K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.

Serie: Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Forschung

Medizin

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Einrichtung eines Menschen Multiple Myeloma Xenograftmodell im Huhn, das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese Studieren

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.