MAL, JCG und MRS werden von der NIA (R00AG033176 und R01AG040081) und Laboratory Directed Forschung und Entwicklung, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231 unterstützt.

Ein. Tissue Processing und Verdauung <ol><li> Erhalten menschlichen Brustgewebe als discard Material von chirurgischen Eingriffen. Reduktion mammoplasties bieten kann normal oder gutartigen Zellen; Fibroadenome und gynecomastias bereitzustellen gutartigen Zellen; Nicht-Tumor-Gewebe Mastektomie (periphere oder kontralateralen zu einem Tumor, oder subkutanen) bereitzustellen, die Zellen von normal bis zu gutartigen enthaltenden Mikrotumoren reichen kann. Ordnungsgemäße IRB Zulassung vorliegt vor dem Erhalten der discard Material. Alle Materialien sollten unter bloodborne Erregers Vorschriften behandelt werden. </li><li> Das Material in sterilen Behältern mit Puffer oder Medien (zB 1:1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium und Ham F-12) mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml Polymyxin B ergänzt, und 10% fötalem Rinderserum und Transport zu Labor bei 4 ° C. Reduction mammoplasty Gewebe gelagert oder bei 4 ° C versandt werden für 72 Stunden ohne nennenswerte Beeinträchtigung subsequent Lebensfähigkeit der Zellen. Kleine Stücke von Nicht-Reduktion mammoplasty Gewebe kann mehr zeitnahe Bearbeitung. </li><li> Trennen Sie die epithelialen Bereiche aus dem Stroma-Matrix von Fettgewebe, Bindegewebe und Blutgefäße mit einer Kombination aus sterilen Skalpell, Zangen und Scheren. Schneiden Sie Stücke von Gewebe mit einer Schere und in einem großen Glas sterile Schale (z. B. 150 mm). Sanft sezieren Sie die epithelialen Bereichen, die als weiße Fäden im yellower Stroma eingebettet erscheinen, mit der Pinzette das Material und das Skalpell zu kratzen die grob Fettmaterial halten. Zur Verdauung zu erleichtern, schneiden Sie das Epithelgewebe in kleinere Stücke von ~ 3-4 mm mit gegnerischen Skalpellen und in einen 50 ml Reagenzglas. Wenn große Mengen von Gewebe verarbeitet werden kann frischer Skalpellklingen benötigt. Entfernen Fettmaterial aus der Schüssel zur Entsorgung nach den institutionellen Regelungen. <ol class="lalpha"><li> In stark Bindegewebe (zB subkutan mastectomies mit schweren fibrocystic Krankheit), wird es mehr feste, weiße, nicht-epithelialen Material sein. Es kann schwierig sein, sich zu zerlegen die Epithelzellen aus solchen faserigen Matrizen. Große Stücke aus Fasermaterial kann in kleinere Stücke, ~ 1-3 mm Platz im Bereich sind verdaut und separat geschnitten werden. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die seziert Epithelgewebe in einen konischen Zentrifugenröhrchen (50 ml oder 15 ml) mit dem Gewebe, umfassend nicht mehr als ein Drittel des Volumens der Röhre. Bringen der Röhre bis zum vollen Volumen, so dass nur ein kleiner Luftraum, um zum Mischen während der Rotation zu ermöglichen, unter Verwendung eines gewebespezifischen Verdauungsansatz (DME/F-12 oder gleichwertig, 10 ug / ml Insulin, Antibiotika wie oben und Endkonzentration von 10 % FCS, 200 U / ml Kollagenase und rohe 100 U / ml Hyaluronidase. </li><li> Die Röhrchen auf einem HulaMixer Röhrchenrotator und Drehen um 360 ° bei 8 rpm über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 600 × g für 5 min. Überstand verwerfen Fett und Medium für Entsorgung gemäßING institutionelle Regelungen. </li><li> Überprüfen für die Fertigstellung der Verdauung durch Verdünnen eines kleines Aliquot der Pellet in Medium. Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die mikroskopische Untersuchung Klumpen von Zellen (Organoide) mit glatten erscheinenden duktalen, alveoläre oder duktale-alveolären Strukturen frei von angeschlossenen Stroma (Abbildung 1A) zeigt. Reduction mammoplasty Gewebe wird in der Regel noch zeigen angeschlossenen Stroma nach einer nächtlichen Verdauung und zusätzliche Verdauung Zeit erfordern. <ol class="lalpha"><li> Resuspendieren des Pellets in unvollständig verdaut frischem Gewebe Verdauungsansatz und Wiederverwendung inkubieren unter Rotation bei 37 ° C für eine weitere Stunde 4-12. Wiederholen Sie die Schritte 1,6 und 1,7. Wenn Verdauung noch unvollständigem erneut hinzuzufügen Verdauungsansatz dem Pellet und Wiederverwendung inkubieren unter Rotation bei 37 ° C über Nacht. Die Konzentration der Enzyme kann reduziert over-Verdau über Nacht zu verhindern. </li></ol></li><li> Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, Zentrifugenröhrchen bei 600 xg für 5 min absaugen DigestIonen-Mix, Pellet erneut in Medium plus Antibiotika bei etwa 15 ml/50 ml Tube, 5 ml/15 ml Tube. </li></ol> 2. Filtration und Einfrieren von verdaute Material <ol><li> Übertragen Aliquots des resuspendierten Pellets auf eine sterile 100 um Sieb über einer sterilen 50-ml-Tube. Lassen des Mediums Drain in das Rohr, so Rewash die Organoiden auf 1-2x mal mit 2-3 ml Medium. Wiederholen, bis alle der resuspendierten Pellets übertragen wurde. Wenn es zu viele Organoide auf dem Filter und das Medium verbraucht nicht mehr einfach sind, verwenden Sie einen neuen Filter (s) für die restliche Material. Drehen Sie das Filter (s) auf einem anderen sterilen Röhrchen und waschen Sie die Organoide in das Rohr mit Medium. Dies ist der 100 um organoide Pool. </li><li> Nehmen Sie das Material, das in den ursprünglichen 50 ml Tube abgelassen und wiederholen Sie den Vorgang von 2,1 mit einem 40 um Sieb, um die 40 um organoide Pool, die meist alveolären Strukturen enthält erhalten. Das Material, das in th abgelassene Rohr bildet den Filtrat Pool, der einzelne / kleinen Klumpen von mesenchymalen und Epithelzellen und kleine Stücke von dem Gefäßsystem enthält. </li><li> Pellet die 100 um, 40 um und Filtrat Pools bei 600 xg für 5 min. </li><li> Überstand rekonstituieren jedes Röhrchen in CPM II (DME/F-12 oder gleichwertig mit 44% FCS und 6% DMSO) mit etwa 1 ml CPMII pro 0,1 ml verpackt Pellet. Halten bei 4 ° C. </li><li> Samen einer Testschale für die 2 organoiden Pools indem 0,1 ml der resuspendierten Materials in eine 35 mm-Gewebekulturschalen Plastikschale tropfenweise wie in 3.2. Das Filtrat Pool kann direkt auf Gewebekulturkunststoff werden mit Fibroblasten-Medium (DME/F-12 oder gleichwertig mit 10 ug / ml Insulin und 10% FBS) ausgesät. </li><li> Aliquot der verbleibende resuspendierten Materials in Nunc Typ Einfrieren Ampullen (1 ml / 2 ml Ampulle). Einfrieren über Nacht bei -80 ° C und dann übertragen umgehend Lagerung in flüssigem Stickstoff. Wir haben keine signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit beobachtetin unserem ursprünglichen Ampullen gelagert seit den späten 1970er Jahren eingefroren. </li></ol> 3. Seeding Gefrorene Organoide und Subculture of Primary Kulturen <ol><li> Schnell auftauen das gefrorene Ampulle enthält die Organoiden in einem 37 ° C warmen Wasserbad. Saatgut den Organoiden in 2 bis 10 (in der Regel ~ 6) 60 mm-Schalen, oder 1-3 100 mm-Schalen in Abhängigkeit von visuellen Schätzung der Anzahl der in der Ampulle Organoiden. Etwa 20-40 Organoide pro 60 mm-Schale ausgesät ist optimal. </li><li> Aufgetaut Organoiden sorgfältig platziert, tropfenweise auf die Schale Oberfläche mit einer 1 ml Pipette oder Pasteurpipette für eine gleichmäßige Verteilung der Organoiden. Organoiden angeordnet dicht beieinander wird wenig Platz für Auswachsen haben, was zu weniger Zellen für die Subkultur oder Einfrieren. Vermeiden Sie ein Verkratzen der Schale Oberfläche (Zellen neigen nicht zu vergangenen verkratzte Oberflächen wachsen). Warten 1-2 min, damit die Organoide zu befestigen und dann langsam Wachstumsmedium zu vermeiden verdrängen die Organoide (zB 2-3 ml/60 mm-Schale). Ichncubate bei 37 ° C in CO 2 befeuchteten Inkubator. Dies sind die primären Kulturen. Wir verwenden derzeit M87A + Oxytocin (X) Medium für die robustesten HMEC Wachstum (Abbildung 2). </li><li> Nach 1 Tag überprüfen, ob die Organoide angebracht sind. Fügen Sie zusätzliche Medium (zB 2-3 ml/60 mm-Schale). Zellmigration aus den Organellen sichtbar sein soll, indem 24-48 h und mitotischen Auswachsen von 48-72 Stunden nach der Aussaat (Abbildung 1B, C). Manchmal Anlage ist nach 24 Stunden schlecht, besonders wenn Ausplattieren overdigested Organoide oder Organoide von älteren Frauen, aber die meisten Präparate werden innerhalb von 72 Stunden zu befestigen. Kleine Stücke von dem Gefäßsystem kann befestigen und verursachen Fibroblastenzelle Auswuchs (1D). </li><li> Führen Kulturen mindestens 3 mal pro Woche. Zellen in M87A-type Medien gezüchtet wachsen in der Nähe Zusammenfluss innerhalb von 5-8 Tagen, je nach Dichte der Aussaat. </li><li> Wenn eine erhebliche Fibroblastenwachstumsfaktor, Differential Trypsinisierung (DT), bezogen auf dierasche Ablösung von Fibroblasten von der Oberfläche aus Kunststoff, benötigt wird, um die Fibroblasten zu entfernen. Wenn die epithelialen Patches groß, absaugen Medien, waschen Teller (zB 1-2 ml/60 mm-Schale) sich mit STE (Kochsalzlösung, 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA), absaugen, mit frischem 0,5 ml STE und bei Raumtemperatur zu verlassen für ca. 1 min mit kontinuierlicher mikroskopischer Beobachtung. Wenn die Fibroblasten, sondern lösen die Epithelzellen sind noch anhaftenden, sanft, aber stark klopfen die Seite der Schale gegen eine harte Oberfläche, um die Fibroblasten zu vertreiben und dann schnell anzusaugen. Waschen Sie einmal mit PBS und saugen wieder. Kulturen stark mit Fibroblasten kontaminiert sein benötigen Sie einen zusätzlichen DT. </li><li> Subculture primären Kulturen, wenn große epitheliale Patches vorhanden sind, aber bevor Zusammenfluss. Die Dichte von organoiden Aussaat und Anlage beeinflussen die erforderliche Zeit. Um die primäre Kultur zu erhalten und mehrere sekundäre Kulturen, zeitlich beabstandet zu erzeugen, führen wir Partielle Trypsinizations (PT). </li><li> Aspirate Medien, waschen ein 60 mm-Schale mit 1-2 ml STE, 0,5 ml frische STE austeilen. Beobachten Zellablösung unter dem Mikroskop bei Raumtemperatur 1-5 min, unter leichtem Klopfen der Schale zu Zellablösung fördern. Trypsinisierung sollte gestoppt, wenn ~ 50% der Zellen wurden abgenommen werden. Frühe PTs haben in der Regel eine schnelle Zellablösung. Für spätere PTs können Zellen bei 37 ° C für eine schnellere Ablösung platziert werden, unter sorgfältiger Überwachung, wie alle Zellen kommen können schnell ab. </li><li> 2 ml Serum-haltigen Medien in die Schale, um repipette waschen, und übertragen in ein steriles 15 ml-Tube. Wiederholen 2x mit weiteren ~ 1-2 ml Medium, Zugabe der Wäsche, um das Rohr. Refeed die primäre Gericht und zum Inkubator. Zählen der Zellen, die in dem Rohr mit der Hämozytometer. Einmal subkultiviert, sind Zellen, no lo; PTs kann um 4 bis 8 mal mit guten Zellerneuerung in den primären Gerichte und eine entsprechende langfristige Wachstum aus den subkultiviert oder gefroren Secondaries (zweiten Durchgang Zellen werden als Secondaries wiederholt werdennger Vorwahlen). Sobald organoide Material nicht mehr in den primären Kulturen zeigen subkultiviert secondaries einen Rückgang der langfristigen Verdopplung der Population Potenzial. </li><li><ol class="lalpha"><li> Für eine Subkultur auf Secondaries, Samenzellen direkt aus der Tube in die Gerichte. Impfen von 1-2 x 10 5 Zellen/100 mm Schale in einem robusten Medium wie M87A + X wird zur Konfluenz von 4-7 Tagen führen. Fügen wir Choleratoxin zu dem Medium in zweiter Durchgang zur proliferative Potenzial zu erhöhen; Choleratoxin in Primärkultur weggelassen, weil sie zu mehrlagigen Zelle Auswachsen führt von den Organoiden. </li><li> Zum Einfrieren als Secondaries, Pellet Rohr bei 600 xg für 5 min, und resuspendieren in CPMII mit einer Enddichte von 10 6 Zellen / ml. Aliquot resuspendiert Zellen in Nunc Typ Gefrierpunkt Ampullen, frieren über Nacht bei -80 ° C und dann zeitnah zu übertragen Lagerung in flüssigem Stickstoff. </li></ol></li><li> Es wird empfohlen, um Zellen von der ersten zur Aufbewahrung PT einzufrieren, undVerwenden von Zellen aus der zweiten PT für Subkultur. Zusätzliche Terminals können eingefroren gelagert für den zukünftigen Gebrauch werden. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der menschliche Brustgewebe Verarbeitung hier vorgestellte Verfahren ermöglicht Gewinnung reiner Brustepithelzellen aus dem heterogenen Gemisch von Zelltypen in der menschlichen Brust. Filtration durch Poren von fester Größe ermöglicht eine Trennung von verschiedenen Fraktionen der Brustdrüse (zB duktale und duktalen-alveolären vs alveolären) aus dem aufgeschlossenen Stromazellen Matrix. Isogenen Mamma Fibroblasten erhalten, um die Epithelzellen angepasst werden. Gefrorene verdaute Material hat gute Lebensfähigkeit seit über 30 Jahren beibehalten. Diese Methode wurde erfolgreich auf alle, aber sehr faserig Mamma Gewebe gearbeitet und ist einfach durchzuführen. Andere Varianten des Brustgewebes Verarbeitung existieren, bieten keinen epithelialen Fraktionen, die als lebensfähig, sauber, oder getrennt sind. Platzierung verarbeitet Organoide in Kultur mit geringer Beanspruchung induzierenden Medien wie M87A ermöglicht langfristiges Wachstum des HMEC mit mehreren Linie Marker. HMEC die auf Kunststoff kultiviert wurden noch die Fähigkeit beibehalten Gattungente 3D-Strukturen mit normalen in vivo-ähnlichen Linie Beziehungen. Diese HMEC Kulturen eignen sich für umfangreiche experimentelle Untersuchung, einschließlich hoher Durchsatz, der normalen HMEC Verhalten und Faktoren, die zu treiben oder zu hemmen Seneszenz und Transformation kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glass Petrischale 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Schere 6,5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pinzetten 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Skalpelle Einweg </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymyxin B-Sulfat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Zellsieb 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Zellsieb 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubes 15 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubes 50 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC Gerichte 10 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC Gerichten 6 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kryoröhrchen </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf Modell </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Experimentelle Untersuchung der normalen humanen Mamma Epithelzelle (HMEC) Verhalten und wie normale Zellen zu erwerben abnormale Eigenschaften können durch in-vitro-Kultur-Systemen erleichtert werden, die genauer in vivo Modell Biologie. Verwendung von menschlichem gewonnenes Material zur Untersuchung zellulärer Differenzierung ist Alterung, Seneszenz, und Immortalisierung besonders vorteilhaft angesichts der vielen signifikanten Unterschiede in diesen molekularen Eigenschaften zwischen menschlichen und üblicherweise verwendet Nagerzellen 1-2. Mammazellen stellen eine bequeme Modellsystem, da große Mengen von normalen und abnormalen Geweben verfügbar sind aufgrund der Häufigkeit der Reduktion mammoplasty und Mastektomie Operationen. Die Brustdrüse besteht aus einer komplexen Mischung von vielen verschiedenen Zelltypen, z. B. Epithel, adipöses, mesenchymalen, Endothelzellen. Die Epithelzellen sind verantwortlich für die differenzierte Mamma Funktion der Laktationund auch der Ursprung der überwiegenden Mehrheit der menschlichen Brustkrebs. Wir haben Methoden entwickelt, um Brustdrüse chirurgischen discard Gewebe in reinen epithelialen Komponenten sowie mesenchymale Zellen 3 verarbeiten. Das verarbeitete Material kann eingefroren unbegrenzt, oder initiiert in Primärkultur. Chirurgische discard Material ins Labor transportiert und manuell seziert, um für epitheliale enthaltendem Gewebe anzureichern. Nachfolgende Verdauung des sezierten Gewebes mit Kollagenase und Hyaluronidase Streifen Stromatumoren Material aus den Epithelien an der Basalmembran. Die erhaltenen kleinen Stücke der epithelialen Baum (Organoiden) kann aus dem aufgeschlossenen Stroma durch sequentielle Filtration an Membranen von festen Porengröße abgetrennt werden. Je nach Porengröße kann erhaltenen Fraktionen aus größeren duktalen / alveoläre Stücke, kleinere alveolaren Cluster oder Stromazellen werden. Wir haben überdurchschnittliches Wachstum beobachten, wenn Kulturen Organoide sind nicht als dis initiiertsociated Einzelzellen. Platzierung von Organoide in Kultur mit Low-Stress induzierenden Medien unterstützt das langfristige Wachstum von normalen HMEC mit Markern der Multiple Lineage Typen (myoepithelialen, luminale, Vorläuferzellen) 4-5. Eine ausreichende Anzahl von Zellen von einem individuellen Gewebe erhalten werden umfangreiche experimentelle Untersuchungen über standardisierte Zellansätzen sowie Abfragesignals unter Verwendung von Hochdurchsatz Modalitäten ermöglichen. Cultured HMEC haben in einer Vielzahl von Studien, die die normalen Vorgänge, die Wachstum, Differenzierung, Altern und Seneszenz, und wie diese normalen Prozesse während unsterblich und malignen Transformation 4-15,16 verändert eingesetzt. Die Wirkungen von Wachstum in Gegenwart von extrazellulärem Matrixmaterial anderen Zelltypen und / oder 3D-Kultur kann mit Wachstums auf Kunststoff 5,15 verglichen werden. Cultured HMEC, beginnend mit normalen Zellen, bieten eine experimentell handhabbar System Faktoren, die zu untersuchenkann zu treiben oder zu verhindern menschlichen Alterung und Krebsentstehung.

Repräsentative Zahlen für Gewebe angemessen zu Organoide verdaut und in Kultur sind in Abbildung 1 dargestellt. Unvollständig verdaute Gewebe zeigen Material noch an der Außenseite des diesen Strukturen befestigt, und wird wahrscheinlich eine gewisse fibroblastische Zellwachstum in Primärkultur, erfordern DT zu entfernen. Overdigested Gewebe wird weniger glatte Außengrenzen und kann länger dauern, bis in Primärkultur befestigen. Epithelialen Auswachsen sollte innerhalb von 48-72 h (1B, C) ​​zu beginnen. Kleine Stücke von Gefäßsystem (1D) eine Quelle von Mesenchymzelle Auswachsen sein. Epithelial Auswüchse zeigen morphologisch heterogene Populationen mit proliferative Populationen, die Mischungen von Zellen enthalten, mit Marker mit myoepithelialen, Vorläuferzellen und luminalen Linien (1E, 3C-E) verbunden. Das Wachstum im niedrigen Spannungen Medien wie M87A mit Cholera-Toxin und Oxytocin ergänzt wird unterstützt langfristig überdurchschnittlicheWachstum von normalen pre-Stasis HMEC zur vorherigen Medien Formulierungen (Abbildung 2). M87A-Typ Medien wird auch das Wachstum von luminalen und Vorläuferzellen durch Durchgänge 4-8 (3C-E, 4), danach zeigen die meisten Zellen nur Myoepithelzellen Abstammungslinie Marker. HMEC auf Kunststoff kultiviert werden, behalten ihre Fähigkeit zur korrekten 3D Selbstorganisation in mikrostrukturierten 3D Mikrowells bilden, mit luminalen Zellen Innenraum zu Myoepithelzellen (4A, B), und um organisierte Strukturen bilden, wenn in Matrigel (4C, D) ausplattiert. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. HMEC Organoide und Primärkultur. (A) Organoide zeigt duktalen-Wabenstruktur nach der Verdauung und Filtration. (B, C) Organoide zeigt duktalen und Wabenstruktur 2 Tage nach der Platzierung in der primären Kultur; beachten Sie den Beginn Zelle outgrowth (weiße Pfeile). (D) kleine Blutgefäß und mit Start-Fibroblasten Auswachsen von gleichen Kulturen wie B, C. befestigt (E) Epithelzellen Auswuchs aus primären organoiden Kultur nach 4 Tagen. Abstammungslinien sind durch Färbung mit Antikörpern gegen K14 (rot) und K19 (grün) identifiziert; Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Luminal (K14-/K19 +, grün), myoepithelialen (K14 + / K19-, rot), und Vorläuferzellen (K14 + / K19 +, gelb) sind Zellen sichtbar. Ungefärbten Zellen in organoiden Kern aufgrund unvollständiger Antikörpers Eindringen beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Wachstum von HMEC Kulturen in verschiedenen Medien Formulierungen. Organoide von einem Individuum, Probe 184, gewonnen wurden in Primärkultur mit verschiedenen Medien Formulierungen eingeleitet. Beste langfristiges Wachstum wird unter Verwendung unserer jüngsten Formulierung, M87A + Oxytocin (X) 4. Dieses Medium unterstützt auchWachstum von mehreren HMEC Linien (siehe Abb. 1E). Eine frühere Medienformulierung, MM 3 vorgesehen weniger robustes Wachstum, während ein Serum-freie Medien, MCDB170 (Handelsprodukt MEGM) 17 führt eine schnelle Induktion des Cyclin-Kinase-Inhibitor p16 INK4a und Selektion für aberrante Zellen 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Vergleich der Erblinie Vielfalt in uncultured Organoide und kultivierten HMEC bei 4 th Passage. (A, B) FACS-Analyse von einem ungebildeten, enzymatisch gespalten organoide für (A) Expression von EpCAM und CD49f/alpha 6-Integrin, und (B) CD227/Muc1 und CD10/CALLA. (C, D) FACS-Analyse von 4 th Durchgang pre-Stasis HMEC zur Expression von (C) und EpCAM CD49f/alpha 6 Integrin, und (D) und CD227/Muc1 CD10/CALLA. Erkennbare populations als LEP (Ausdruck luminalen Marker EPCAM oder CD227), MdEP (Ausdruck myoepithelialen Marker CD49f oder CD10) oder PROG (angereichert in der CD49f + / EPCAM + Bevölkerung) beschriftet. Beachten Sie, dass während der Anpassung an Kultur Regulierung von EpCAM und CD49f Änderungen uncultured Organoide verglichen. (E) Unsorted HMEC und FACS-angereicherten LEP und MEP bei 4 th Durchgang für Immunfluoreszenzanalyse von Keratin K14 (MEP Marker) und K19 (LEP Marker) zur Linie Identifizierung überprüfen gefärbt. Zellkerne mit DAPI blau erscheinen. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Abbildung 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. Cultured HMEC der Lage sind, organisierte Strukturen mit in vivo-ähnlichen Linie Beziehungen, wenn in geeigneten Mikroumgebungen gelegt. (A) Pre-Stasis 4 th Durchgang HMEC wurden FACS-angereicherten into luminalen LEP und Myoepithelzellen MEP Abstammungslinien unter Verwendung von Markern für CD227 und CD10, mit diesen Linien durch Expression von K14 und K19 verifiziert (nicht dargestellt). (B) Wenn sie zusammen in mikrostrukturierten Vertiefungen gemischt wurden die kultivierten Zellen in der Lage Selbstorganisation zu Doppelschichten mit MEP auf der Außenseite und LEP internen [aus Chanson et al angepasst. 5]. Fluoreszenzmarkierten LEP (grün) und MEP (rot) wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h nach Zugabe der Kavitäten (oben) abgebildet. Steuerung HMEC wurden willkürlich mit roten oder grünen fluoreszierenden Markierungen (unten) bezeichnet. (C) Hellfeld Bild von FACS-angereicherte Progenitorzellen (cKit +) ausplattiert in 3D (Matrigel) Kultur gewachsen und für 18 Tage. Resultierenden Strukturen aufweisen können alveolären Morphogenese. (D) Die Strukturen wurden von Matrigel extrahiert und gefärbt, um K14 und K19 zu erkennen; Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Immunfluoreszenz Analyse zeigt, organisierte Strukturen mit der richtigen luminalen und basalen polaheit.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Aufrufe.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Serie: Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Forschung

Medizin

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...