Wir danken Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) für die großzügige Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit und Herrn Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) für kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von Research UK (CR-UK) Grant-Nummer C147/A6058 (AO) unterstützt

1. Isolation von Primär-kultivierten humanen Fibroblasten normaler Brustdrüse Experimentelle Verfahren zur Isolierung von primären kultivierten humanen normalen Mamma Fibroblasten sind in Abb. dargestellt. 1A. <ol><li> Bereiten Sie die Zelle Dissoziationspuffer, wie zuvor beschrieben 12: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin-Streptomycin (200 Einheiten / ml), Kollagenase Typ I (1 mg / ml) und Hyaluronidase ( 125 Einheiten / ml). </li><li> Waschen Sie die Brustgewebe eine Reduzierung mammoplasty (~ 0,5 Gramm) mehrmals in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) seziert. Mince das Gewebe in kleine Fragmente (&lt;1,5 mm 3) mit sterilen Rasierklingen. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeteile in einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer entsprechenden Menge der obigen Zelle Dissoziation Puffer (10 ml pro 0,5 Gramm Gewebe) und Vortex für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Digest die Gewebestücke in der Zelle Dissoziationspuffer foder 12-18 h bei 37 ° C unter langsamem Rühren. * Hinweis, dass es noch viele Stücke von unverdauten Gewebeteilen übrigen in die Röhre. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Übertragen Sie die daraus resultierenden Stromazellen angereicherte Überstand in ein neues konisches Rohr mit einer 5 ml serologische Pipette. </li><li> Centrifuge der stromalen Fraktion für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in PBS. Zentrifuge erneut für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in DMEM mit 10% FCS. Kultur der Zellen in DMEM mit 10% FCS in einer 15 cm Petrischale bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid. </li><li> Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz. Es dauert in der Regel 8-10 Tage. Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium (10% Dimethylsulfoxid und 20% FCS in DMEM). Bereiten Sie 5 Frozen Fläschchen als Original verfügbar. Tauwetter ein Fläschchen und erweitern Sie die Zellen zu 5 Ampullen für die sekundäre Lager mit Fibroblasten passagiert Vorbereitung innerhalb von 5 BevölkerungVerdopplungen (PDS) für die nachfolgenden Experimente. Diese Verfahren minimieren klonale Selektion und Kultur betont werden, dass bei längeren Gewebekultur auftreten könnten. * Beachten Sie, dass P1.1-7 kann auch zur Isolierung von CAF von Mammakarzinomen durch eine Brustamputation 12 erhalten werden. </li></ol> 2. Generierung von GFP-markierten, Puromycin-resistente, immortalisierten humanen normalen Mamma Fibroblasten <ol><li> Um unsterblich zu den primären humanen normalen Mamma Fibroblasten in P1.7 isoliert), die Einführung einer retroviralen pMIG (MSCV-IRES-GFP) Vektor 12, Ausdruck sowohl hTERT und GFP. Kultur der Zellen für 4-5 Tage und dann sortieren Sie die GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie. </li><li> Einführung eines retroviralen pBABE-puro Konstrukt, das eine Puromycin-Resistenz-Gen in die GFP-markierten verewigt Fibroblasten. Kultur der Zellen für 5-7 Tage in Gegenwart von Puromycin (Endkonzentration: 1 pg / ml) zur Isolierung des GFP-positive (GFP +), Puromycin-resistente (puro R </sup&gt;) menschlichen Brustdrüse Fibroblasten verewigt. </li><li> Als nächstes zu prüfen, ob diese Fibroblasten aktiven Viren, die den horizontalen Transfer von Genen, GFP und Puromycin Resistenz führen, wachsen kann 2.5x10 5 GFP + puro R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in einer 6 cm Petrischale für 2 Tage. Produzieren </li><li> Filtermedium durch diese Fibroblasten mit einer Spritze (Porengröße: 0,45 um) konditioniert und fügen Sie ihn auf 10T1 / 2 Maus Fibroblasten-Zellen für 12h in Anwesenheit von Protaminsulfat (5 pg / ml), die Effizienz der Virus-Infektion erhöht. Das Medium wird dann auf 10% FCS-DMEM für weitere 2 Tage gewechselt. </li><li> Die Zellen werden durch ein Fluoreszenz-Mikroskopie. 10T1 / 2 Zellen durch GFP-Virus infiziert wird GFP-positiv. Gönnen auch Sie die Zellen mit Puromycin (1 pg / ml) für 5-7 Tage und beobachten Sie die Platte, wenn eine puro R 10T1 / 2 Zellen vorhanden und bilden Kolonien nach dem Puromycin-Behandlung sind. </li><li> Beachten Sie, dass die horizontalen Gen-tranSFER von aktiven Viren durch den elterlichen GFP + puro R menschlichen Brustdrüse Fibroblasten könnte den umliegenden murine Zellen und / oder Karzinom-Zellen GFP + puro R innerhalb Tumorxenotransplantaten. Dies kann zu behindern den Prozess der Isolierung der ursprünglich injizierten GFP + puro R menschlichen Brustdrüse Fibroblasten aus dem Tumorxenotransplantaten. </li></ol> 3a. Koinjektion der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten mit Mammakarzinom-Zellen in einem immundefizienten Maus Experimentelle Verfahren zur Erzeugung von exp-CAF sind in Abb. dargestellt. 1Ba. <ol><li> Mix 1x10 6 MCF-7-ras menschlichen Brustkrebszellen und 3x10 6 GFP + puro R, immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in P2.2 generiert). Bereiten Sie die Zellen in 400 ul Kulturmedium mit 50% (v / v) Matrigel pro Injektion. </li><li> Spritzen Sie die Zelle Mischung subkutan in eine immundefizienten Nacktmaus. Wenn CAF sind unabhängig von verschiedenen extrahiertTumoren, Implantat jeder Mischung in rechte und linke Flanke von mehreren Mäusen. </li></ol> 3b. Die Injektion von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten in einer immundefizienten Maus <ol><li> So generieren Kontrolle Fibroblasten gegen exp-CAF, bereiten 3x10 6 GFP + puro R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten in P2.2 in 400 ul Kulturmedium generiert mit 50% (v / v) Matrigel pro Injektion (Abb. 1Bb). Mischen Sie die Fibroblasten mit Karzinomzellen. </li><li> Implant die Fibroblasten in P3b.1 in subkutanes Websites von Nacktmäusen vorbereitet. </li></ol> * Beachten Sie, dass die geimpften Fibroblasten werden die Fibroblasten Gewebe, aber nicht Tumor unter der Haut bilden. 4a. Präparation Tumorxenotransplantates <ol><li> Einschläfern mit der Maus beherbergt eine subkutane menschliche Brustkrebszellen Xenograft 42 Tage nach der Implantation (Abb. 1Ba). * Beachten Sie, dass, wenn andere Karzinom-Zellen und / oder Fibroblasten coimplanted sindKann Fibroblasten müssen länger als 42 Tage innerhalb der Tumorxenotransplantates inkubiert werden, um ihre myofibroblastischer Phänotyp initiieren. </li><li> Ernten Sie die Tumorxenotransplantates von der Flanke der Maus durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette und Schere. Tauchen Sie das Tumorgewebe in PBS. </li></ol> 4b. Dissection von Fibroblasten Xenograft <ol><li> Einschläfern mit der Maus beherbergt die Fibroblasten-Xenograft 42 Tage nach der Implantation (Abb. 1Bb). </li><li> Präparieren Sie die subkutane Fibroblasten Xenograft mit einer Pinzette und Schere. Legen Sie die Fibroblasten Gewebe in PBS. * Beachten Sie, dass eine Fibroblasten-Xenograft, die als winzige durchsichtige Gewebe erscheint, kann schwierig sein, unter der Haut zu finden. </li></ol> 5. Herstellung von primären Zellkulturen aus Xenotransplantate <ol><li> Verwenden Sie eine sterile Biosicherheitswerkbank, um den Tumor (~ 0,5 Gramm) oder Fibroblasten Gewebe (~ 0,1 Gramm) zu sezieren. Übertragen Sie die herausgeschnittenen Gewebe auf der Spitze eines 15 cm Kultur dish mit 1 ml PBS. Mince das Gewebe in kleine Gewebestücke (&lt;1,5 mm 3) mit sterilen Rasierklingen. * Beachten Sie, dass, wenn die Fibroblasten-Xenograft wiegt weniger als 0,1 Gramm, sammeln ein paar zusätzliche Fibroblasten Xenotransplantate und mischen sie zusammen, um die Anzahl der Zellen für die Isolierung zu erhöhen. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeteile in einem 15 ml konischen Röhrchen mit der Zelle Dissoziation Puffer (10 ml pro 0,5 Gramm Gewebe) und Vortex für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension für 3 h bei 37 ° C mit kontinuierlichem langsamem Rühren. </li></ol> 6. Isolation von Puromycin-resistente Zellen in Kultur <ol><li> Centrifuge der Zellsuspension dissoziiert entweder aus Tumor-oder Fibroblasten-Xenograft für 5 min bei 250 X g und Zellpellet in PBS. Zentrifuge erneut für 5 min bei 250 x g. Resuspendieren resultierende Zellpellet in 10% FCS-DMEM. Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml) bei 37 ° Cund 5% Kohlendioxid in Ordnung zu beseitigen jede Verunreinigung Karzinomzellen und / oder murinen Stromazellen. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (2-4 Wochen). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. * Beachten Sie, dass die daraus resultierenden puro R-Zellen, bezeichnete 42-Tage alten exp-CAF1 (Abb. 1Ba) oder Kontroll-Fibroblasten-1-Zellen (Abb. 1Bb), sind unsterblich und positiv für GFP. Es wird empfohlen zu prüfen, ob diese Zellen aktiv Viren produzieren mit 10T1 / 2 Zellen, wie in P2.3-6 beschrieben. </li></ol> 7a. Isolierung von exp-CaF2-Zellen in Kultur Zur weiteren Stärkung der aktivierten myofibroblastischer Phänotyp der CAF, mischen Sie die 42-Tage alten exp-CAF1 Zellen mit MCF-7-ras-Zellen und injizieren sie wieder subkutan in einer Nacktmaus für einen weiteren Zeitraum von 200 Tagen. Sezieren und distanzieren die Tumorxenotransplantates in einen Ein-Zell-Suspension und Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale mit 10% FCS-DMEM in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml), wie in P6 angegeben.1. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (8-10 Tage). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. Die daraus resultierende puro R-Zellen genannt 242-Tage alten exp-CaF2-Zellen (Abb. 1Ba). 7b. Extraction der Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen in Kultur So generieren Kontrolle Fibroblasten gegen exp-CaF2 Zellen injizieren 42-Tage alten Kontrolle Fibroblasten-1-Zellen allein ohne Karzinom-Zellen subkutan in einer Nacktmaus zusätzlich für 200 Tage. Sezieren und distanzieren die Fibroblasten Gewebe in einer einzigen Zellsuspension und Kultur der Zellen in einer 15 cm Petrischale mit 10% FCS-DMEM in Gegenwart von Puromycin (1 pg / ml) als in P6.1 angezeigt. Propagieren der Zellen bis zur Konfluenz (3-4 Wochen). Lagern Sie die Zellen bei -80 ° C mit Einfriermedium. Die daraus resultierende puro R-Zellen genannt Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Abb. 1Bb). 8. Repräsentative Ergebnisse: Control-Fibroblasten-2 und exp-CaF2 cells, die von der Brust Tumorxenotransplantaten extrahiert wurden, gebeizt stark positiv für mesenchymale Marker, einschließlich der menschlichen spezifischen Vimentin, Prolyl-4-Hydroxylase, Kollagen 1A, Fibronektin, S100A4 und Fibroblasten Oberflächenprotein (Abb. 2A) 11, was darauf hinweist menschlichen Herkunft und mesenchymalen Natur dieser Zellen. Im Gegensatz dazu war die Zytokeratin, einem Marker für Epithelzellen, nicht in diese GFP +-Fibroblasten (Abb. 2B) angefärbt. Diese Ergebnisse schlagen daher vor, dass die extrahierten exp-CaF2 und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen wurden aus dem elterlichen menschlichen Brustdrüse Fibroblasten zunächst in der Maus Xenotransplantate eingeführt hatten. Wichtig ist, befleckt einen höheren Anteil an exp-CaF2-Zellen für α-SMA und extrazellulären Matrix-Glykoprotein Tenascin-C 5, die beide Marker für Myofibroblasten im Vergleich zum 42-Tage alten exp-CAF1 und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Abb. sind positiv . 2C, D) 11. Diese Daten zeigen an, dass Resident menschlichen Brustdrüse FIBRoblasts schrittweise in CAF Myofibroblasten in Tumorxenotransplantaten entwickeln. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung der Isolation der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. A) Die Reduzierung mammoplasty Gewebe wurde zerkleinert mit sterilen Rasierklingen (P1.2) und in ein 15 ml konischen Röhrchen (P1.3). Der kleine Gewebestücke wurden in der Zelle Dissoziationspuffer (P1.4) verdaut und bereit für die Kultur in vitro (P1.5-7). Um unsterblich zu den isolierten primären humanen Mamma-Fibroblasten, eine retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP)-Vektor, Ausdruck sowohl hTERT und GFP, eingeführt wurde, und die daraus resultierenden GFP-positive Zellen wurden sortiert mittels Durchflusszytometrie (P2.1). Eine retrovirale pBABE-puro Vektor kodierend für eine Puromycin-Resistenz-Gen wurde dann in diese Zellen eingeführt. Nach dem Puromycin-Behandlung, GFP-markierten (GFP +) Puromycin-resistente (Puro R), immortalised menschlichen Brustdrüse Fibroblasten isoliert wurden (P2.2). Ba) zu generieren exp-CAF, verewigt GFP + puro R menschlichen Mamma-Fibroblasten wurden mit MCF-7-ras Brustkrebszellen subkutan in eine immundefizienten Nacktmaus (P3a) coinjected. Der Tumor Xenograft wurde 42 Tage nach der Implantation (P4a) reseziert und dissoziiert in ein Single-Cell-Suspension (P5). Diese Zellen wurden dann in vitro in Gegenwart von Puromycin kultiviert werden, um jede Verunreinigung Karzinomzellen und Maus Stromazellen (P6) zu beseitigen. Die daraus resultierende Puromycin-resistente Zellen wurden experimentell erzeugten CAF1 (exp-CAF1)-Zellen bezeichnet. Diese Zellen, die reseziert 42 Tage nach der Implantation wurden erneut gemischt mit MCF-7-ras-Zellen und subkutan in eine Host-Maus wie zuvor (P7a) implantiert. Die daraus resultierende Tumor wurde für weitere Zeiträume von jeweils 200 Tage wachsen, dann seziert, dissoziiert, und kultiviert in Gegenwart von Puromycin. Die isoliertePuromycin-resistente Zellen wurden exp-CaF2-Zellen (242-Tage alten) bezeichnet. Bb) Kontroll-Zellen gegen exp-CAF isolieren, GFP + puro R immortalisierten humanen Mamma-Fibroblasten wurden subkutan in eine Nacktmaus als Reinkulturen ohne MCF-7-ras-Zellen (P3b) injiziert. Die Fibroblasten Gewebe, seziert 42 Tage nach der Implantation (P4b), wurde in den Single-Zellsuspensionen (P5) und Puromycin-resistente Zellen, benannt Kontrolle Fibroblasten-1-Zellen dissoziiert, wurden isoliert, wie oben beschrieben (P6). Diese Fibroblasten wurden noch einmal subkutan in einer Nacktmaus ohne MCF-7-ras Zellen zusätzlich für 200 Tage (P7b) implantiert. Die Fibroblasten Gewebe wurde seziert, dissoziiert, und kultiviert in Gegenwart von Puromycin. Die isolierte Puromycin-resistente Zellen wurden Kontroll-Fibroblasten-2-Zellen (242 Tage alten) bezeichnet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> Abbildung 2 <strong&gt; Exp-CAF und die Steuerung Fibroblasten aus dem elterlichen menschlichen Brustdrüse Fibroblasten stammen. (A) Immunfluoreszenz-Analysen der Kontrolle Fibroblasten-2 (Kontrolle f.) und exp-CaF2-Zellen. Die beiden Zelltypen Fleck für mesenchymale Marker (rot), einschließlich der menschlichen Vimentin, Prolyl-4-Hydroxylase, Kollagen 1A, Fibronektin, S100A4 und Fibroblasten Oberflächenprotein positiv. (B) Im Gegensatz dazu pan-Zytokeratin, einem Marker für Epithelzellen , ist nicht in exp-CaF2-Zellen, die GFP (grün) nachgewiesen. Zellkerne sind mit 4&#39;-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blau) gefärbt. Scale-bar, 50 um (im Sinne von Kojima et al. 11) (C) Immunfluoreszenz von exp-CaF2-Zellen und Kontrolle Fibroblasten-2-Zellen (Kontrolle f.) mit Antikörpern gegen α-SMA (rot) oder Tenascin-C (TN-C) (rot). Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Scale-bar, 50 pm. (D) 48% der exp-CaF2-Zellen Färbung für α-SMA positiv, wohingegen 14% der 42-Tage alten exp-CAF1 und 2,5% der Kontrollgruppe Fibroblasten-2 Zellpopulationen sind für α-SMA positiv. (Bezogen von Kojima et al.11)

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	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Fehlen von CAF-spezifischen Markern und das Niveau der Heterogenität beobachtet unter CAF die Charakterisierung dieses Zelltyps eine Herausforderung an sich zu machen. Studieren CAF in vitro wurde auch durch die zusätzliche Komplikation verhindert worden, dass diese Zellen und senesce stoppen proliferierenden, wenn über einen längeren Zeitraum kultiviert. Unsere erste Anlauf, direkt verewigen primäre CAF mit einem retroviralen hTERT cDNA-Konstrukt war nicht erfolgreich. Deshalb zur weiteren Untersuchun...

<table border="1"><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin (V9) Antikörper </td><td></td><td> Novocastra Laboratories </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC-8) Antikörper </td><td></td><td></td><td></td><td> ein Geschenk von Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4)-Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-Hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) Antikörper </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagen Typ1 1A-Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-Zytokeratin Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin Antikörper </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (Fibroblasten- spezifisches Protein-1) Antikörper </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast Oberflächenprotein (Klon 1B10) Antikörper </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP-Konstrukt </td><td></td><td></td><td></td><td> Anfrage an den die Autoren </td></tr><tr><td> pBABE-puro konstruieren </td><td></td><td></td><td></td><td> Kauf von Addgene </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Nude-Maus </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Female NCr nude </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 Zellen </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Karzinome sind komplexe Gewebe von neoplastischen Zellen und einer nicht krebsartigen Fach bezeichnet als &quot;Stroma&quot; zusammen. Das Stroma besteht aus der extrazellulären Matrix (ECM) und eine Vielzahl von mesenchymalen Zellen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, Perizyten und Leukozyten 1-3. Der Tumor-assoziierten Stroma reagiert auf erhebliche parakrine Signale von benachbarten Krebszellen freigesetzt. Während des Krankheitsverlaufs, das Stroma wird oft von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF), einschließlich einer großen Anzahl von Myofibroblasten besiedelt. Diese Zellen haben bisher von vielen verschiedenen Arten von humanen Karzinomen wurden für ihre in-vitro-Kultur extrahiert. Eine Subpopulation von CAF unterscheidet sich durch ihre Hochregulation von α-smooth muscle actin (α-SMA) Ausdruck 4,5. Diese Zellen sind ein Markenzeichen der &quot;aktivierten Fibroblasten&quot;, die ähnliche Eigenschaften teilen mit Myofibroblasten commonly in verletzten und fibrotische Gewebe 6 beobachtet. Das Vorhandensein dieser myofibroblastischer CAF Teilmenge ist sehr zu hochwertigen Malignomen im Zusammenhang und in Verbindung mit schlechten Prognosen bei Patienten. Viele Laboratorien, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt, dass CAF, wenn sie mit Karzinom-Zellen in immundefizienten Mäusen injiziert, der fähig ist wesentlich fördern Tumorgenese 7-10 sind. CAF von Karzinom-Patienten vorbereitet, jedoch häufig zu unterziehen Seneszenz bei der Ausbreitung in der Kultur Begrenzung des Umfangs ihres Einsatzes im gesamten laufenden Experimente. Zur Überwindung dieser Schwierigkeit, entwickelten wir eine neuartige Technik experimentell zu erzeugen immortalisierten humanen Mamma-CAF-Zelllinien (exp-CAF) aus menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten mit einem coimplantation Brusttumor Xenograftmodell. Um exp-CAF, Kindersicherung menschlichen Brustdrüse Fibroblasten, aus der Reduktion mammoplasty Gewebe gewonnen zu generieren, wurden zuerst immortalised mit hTERT, der katalytischen Untereinheit der Telomerase Holoenzym, und ausgeführt, um auszudrücken GFP und ein Puromycin-Resistenzgen. Diese Zellen wurden mit humanen MCF-7 Brustkrebs-Zellen, die einen aktivierten Ras-Onkogen (MCF-7-ras-Zellen) in eine Maus-Xenograft coimplanted. Nach einer Inkubationszeit in vivo wurden die ursprünglich injizierten menschlichen Brustdrüse Fibroblasten aus dem Tumorxenotransplantaten auf der Grundlage ihrer Puromycin-Resistenz 11 entnommen. Wir beobachten, dass die Bewohner menschlichen Brustdrüse Fibroblasten differenziert, die Annahme eines myofibroblastischer Phänotyp und erwarb Tumor-fördernden Eigenschaften im Laufe der Tumorprogression. Wichtig ist, dass diese Zellen, definiert als exp-CAF, imitieren tumorpromovierende myofibroblastischer Phänotyp der CAF von Mammakarzinomen von Patienten seziert isoliert. Unsere Tumorxenotransplantates-derived exp-CAF daher ein wirksames Modell, um die Biologie des CAF in menschlichen Breas Studiet Karzinome. Das beschriebene Protokoll kann auch zur Erzeugung und Charakterisierung von verschiedenen CAF Populationen von anderen Typen von humanen Karzinomen abgeleitet erweitert werden.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) reichen in Myofibroblasten innerhalb des Tumorstroma, spielen eine wichtige Rolle bei der Vertreibung der Tumorprogression. Wir entwickelten ein coimplantation Tumor xengraft Modell für experimentell erzeugen CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. Das Protokoll beschreibt, wie CAF Myofibroblasten, dass die Fähigkeit zur Tumorentstehung fördern erwerben zu etablieren.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K Aufrufe.  University of Manchester. Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) reichen in Myofibroblasten innerhalb des Tumorstroma, spielen eine wichtige Rolle bei der Vertreibung der Tumorprogression. Wir entwickelten ein coimplantation Tumor xengraft Modell für experimentell erzeugen CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. Das Protokoll beschreibt, wie CAF Myofibroblasten, dass die Fähigkeit zur Tumorentstehung fördern erwerben zu etablieren.

Serie: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Forschung

Medizin

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Menschliche Arteria mammaria interna (IMA) Transplantation und Stenting: A Human Model um die Entwicklung von In-Stent Restenose Studie

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...