The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

Hinweis: Dieses Protokoll beginnt, nachdem man Mitochondrien aus roten Skelettmuskel isoliert. Mitochondrien wurden isoliert, wie zuvor von ~ 75 beschrieben - 100 mg rote Skelettmuskel 13. Zwischen 5-10 ug / ul der mitochondrialen Protein aus dieser Menge an Gewebe durch Resuspendieren des endgültigen mitochondriale Pellet in ≤50 ul Isolationspuffer für Mitochondrien (IBM) 2 (Siehe Frisard et al 13) erreicht werden. 1. Setup- <ol><li> Bereiten Sie Arbeitsstammlösungen (Tabelle 1) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Mischungen (Tabelle 2) für nachfolgende Tests. Hinweis: Die meisten der Vorbereitung auf die Tests können im Voraus erfolgen, da die meisten Aktien-Lösungen und MAS gespeichert werden können, werden. </li><li> Die Nacht hydratisieren eine respirometrischen Analysenkartusche in 1 ml Kalibrierungslösung vor dem Experiment in einem nicht-CO 2 Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Der Tag des Experiments, take aus gefrorenen Beständen (Substrate und mitochondriale Modulatoren, MAS-Mix, MAS W / O-BSA, Tabelle 1) und Tauwetter in 37ºC Bad oder Inkubator. </li><li> Bereiten Sie alle Substratlösungen (Tabelle 3) und Injektionen (Tabelle 4-5) und stellen pH nach Wunsch (pH 7,4). Nachdem der pH-Wert eingestellt, gespeichert auf Eis. </li><li> Programmieren Sie die Multi-Well-Sauerstoffverbrauch Messmaschine die richtige Mischung, warten, und messen Parameter (siehe Tabelle 6) und Label Hintergrund und Gruppe / Zustand Vertiefungen durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von dem Modus &quot;Standard&quot;. <ol><li> Geben Sie in das &quot;Gast&quot; Forums und klicken Sie auf die &quot;Test-Assistent&quot;. Einmal in der &quot;Test-Assistent&quot;, klicken Sie auf &quot;Protokoll&quot;, um Mischung zu ändern, warten Sie, und messen Parameter. Beschriften Sie die Hintergrundbrunnen unter dem &quot;Back. Correction &quot;Registerkarte und sicher sein, die Option&quot; Do Grundkorrektur &quot;. </li><li> Label conditions indem Sie zuerst auf die Registerkarte &quot;Gruppen &amp; Labels&quot;, gefolgt von der Registerkarte &quot;Gruppen-Info&quot;. Nachdem diese Parameter eingegeben haben, klicken Sie auf &quot;Ende&quot;, gefolgt von &quot;Vorlage speichern&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Der Testlauf <ol><li> Laden Sie die Injektionslösungen in einen Testlauf Patrone und starten Sie die Kalibrierung durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von der Eingabe der &quot;Standard&quot; Modus. Geben Sie in das &quot;Gast&quot; Forum. Öffnen Sie die Vorlage in Schritt 1.5 unter der &quot;XF&quot; Platte gespeichert, auf der Registerkarte &quot;Vorlagen&quot;. Einmal geöffnet, klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Kalibrierung zu starten. Hinweis: Der Testlauf Patrone muss mit der abgeschrägten Ecke nach links unten in die Maschine eingegeben werden. Dies dauert etwa 30 min. Achten Sie darauf, Lösungen in die richtigen Anschlüsse zu injizieren. Injektionen in Tabelle 4-5 werden in der Reihenfolge der Lade aufgeführt. </li><li> Sanft, aber gründlich mischen die mitochondria Lager durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die seine Öffnung durch Schneiden ~ 3 mm vom Ende der Spitze mit einer Schere erweitert hatte. </li><li> Führen Bicinchoninsäure (BCA) Assay, um die Proteinkonzentration der mitochondrialen Lager zu bestimmen. </li><li> Verwendung der aus Schritt 2.3 erworbene Stoffkonzentration resuspendieren 10 ug mitochondrialen Protein / 200 ul des Succinat / Rotenon Substratmischung (Tabelle 3). Resuspendieren 14 ug mitochondrialen Protein / 200 &amp; mgr; l der verbleibenden Substratmischungen (Dies muss für jedes Substrat Mischung durchgeführt werden) (Tabelle 3). Legen Sie alle mitochondrialen Protein / Substratmischungen auf Eis. Anmerkung: Die optimale Menge an Mitochondrien-Protein pro Well für jeden Assay wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. 9 Es wurde festgestellt, daß das Pyruvat / Malat, Palmitoylcarnitin / Malat, Glutamat / Malat eind Elektronenfluss Assays verwendet 3,5 ug des mitochondrialen Proteins, während das Succinat / Rotenon Assay verwendet 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung. Daher muss der Forscher genug mitochondrialen Protein resuspendieren 4 repliziert in diesem Schritt, da entweder 2,5 ug oder 3,5 ug pro 50 ul pro Vertiefung geladen (siehe Schritt 2.6). </li><li> Mischen Sie die Mitochondrien / Substratlösungen sanft, aber gründlich durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die ~ 3 mm von seinem Ende gehabt hat abgeschnitten. </li><li> Legen Sie eine Zellkulturplatte auf Eis und in dreifacher Ausfertigung, Last 50 ul / Vertiefung von jedem der Mitochondrien / Substratmischungen. Die Entwickler des auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assay empfehlen Verlassen ein Minimum von zwei Leerprobe (ohne Mitochondrien) Brunnen, vorzugsweise auf beiden Seiten auf der Zellkulturplatte. </li><li> Spin der Zellkulturplatte bei 2.000 g für 20 min bei 4 ° C. Während die Platte sPinning, Aufwärmen der Substratlösungen in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Nach der Spin vollständig ist, sorgfältig 450 ul jeder Substratlösung auf seiner entsprechenden Wells laden (dh, legen Sie das Pyruvat / Malat-Substrat in die Vertiefungen, die Mitochondrien zunächst in der Substratlösung resuspendiert haben). Achten Sie darauf, die Platte bei RT zu laden. Hinweis: Blank Brunnen sollte mit 500 ul Substrat geladen werden. Für den Elektronenfluss Assay bezeichnet leere Vertiefungen sollten mit dem Elektronenfluss Substrat (Pyruvat / Malat + FCCP) geladen werden, während die gekoppelten Assay Blindvertiefungen mit jedem Kopplungsassay Substrat geladen werden. Hinweis: Bei der Durchführung der gekoppelten und Elektronenfluss-Tests auf der gleichen Platte, muss der Forscher Hintergrund Brunnen an die jeweiligen Tests neu zuweisen, nachdem der Testlauf abgeschlossen ist, mit Hilfe der &quot;XF Reader&quot; Plattform über den Reiter &quot;Instrument&quot;. Einmal in der &quot;Instrument&quot; Einstellung, klicken Sie auf die &quot;Verwaltung&quot;Reiter, gefolgt von &quot;Background Correction&quot;. Hit &quot;Geräte Setup beenden&quot;, wenn Sie fertig. Dies ist, weil die Kombination von Ascorbat / TMPD können O 2, wodurch eine separate Hintergrundkorrektur für jeden Assay benötigten Typ zu verbrauchen. </li><li> Nachdem das 450 &amp; mgr; l Substrat zu jeder Vertiefung zugegeben, Ansicht der Schicht aus Mitochondrien in der Vertiefung zu gewährleisten, die Mitochondrien sind gleichmäßig in einem einzigen Monoschicht dispergiert (20-facher Vergrößerung [siehe Rogers 9, 4]). Wells, die scheinbar nicht um eine gleichmäßig verteilte Monolage haben können post hoc entfernt werden. </li><li> Nach der Überprüfung für mitochondriale Einhaltung, legen Sie die Mikroplatte in die respirometrischen Assay Instrument und starten Sie den Test, indem Sie auf &quot;OK&quot; ausgeführt werden. Hinweis: Die Kalibrierung von Schritt 2.1 muss abgeschlossen sein, bevor der Lauf beginnt. Sobald die Forscher klickt &quot;OK&quot;, wird die Maschine das Dienstprogramm Platte, die für die Kalibrierung verwendet wurde ausgeworfen. <ol> &lt;li&gt; Entfernen Sie das Dienstprogramm Platte und setzen Sie den Zellkulturplatte, die die Mitochondrien auf dem Tablett enthält. Die blaue Kerbe auf der Zellkulturplatte sollte in der unteren linken Ecke des Behälters platziert werden. Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, um den Testlauf zu starten. </li></ol></li><li> Nach dem Durchlauf abgeschlossen ist, werfen die Zellkulturplatte und Kassette mit der Taste &quot;Auswerfen&quot; auf dem Bildschirm. <ol><li> Sobald die Platte ausgeworfen wird, entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturplatte und Kassette und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot; auf dem Bildschirm. Der Lauf wird automatisch als .xls-Datei in der Datei &quot;Data&quot; gespeichert werden. </li></ol></li><li> Öffnen Sie diese Datei und ändern Sie die Anzeige von &quot;O2&quot; auf &quot;OCR&quot;, indem Sie auf den Abwärtspfeil unter dem &quot;Y1:&quot; Marker. <ol><li> Nächste Änderung &quot;Middle Point&quot; auf &quot;Punkt-zu-Punkt-Preise&quot; unter dem &quot;Rate Daten angezeigt, wie:&quot; -Option. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um diese Änderungen zu übernehmen. </li></ol&gt; </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Nun Gruppen-Modus&quot; auf unten links auf dem Bildschirm, um Gruppe Näpfe ähnlichen Bedingungen zusammen. Schließlich klicken Sie auf &quot;Probe Mittelwert / Standardfehler&quot; Registerkarte in Richtung auf die Mitte des Bildschirms, auf der linken Seite. Alternativ können diese Befehle eingerichtet werden, bevor der Test beginnt in der &quot;Test Wizard&quot; -Einstellung. Hinweis: Jeder Zustand wird ein Mittelwert ± Standardabweichung für jede Rate und jede Bedingung anzuzeigen. Es gibt Rate Messungen pro Zustand (State 2 [Kupplung] / State3u [Elektronenfluss] Atmung durch vier Injektionen folgten) übernommen. Verwenden Sie den Mittelwert des Staates 2 Rate der zweiten Messung zu bestimmen Staat 4o bei der minimalen Punkt nach Oligomycin Injektion, verwenden Sie den Maximalpunkt für Zustand 3 und Zustand 3U nach ADP und FCCP Injektion, bzw., und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für die Kopplung Assays. Verwenden Sie den Maximalpunkt für die Pyruvat / Malat-induzierten Zustand 3u Atmung, verwenden Sie die MindestPunkt für Rotenon induzierte Respiration, verwenden Sie den Maximalpunkt für Bernsteinsäure-induzierte Staat 3u Atmung, und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für den Elektronenfluss-Assay. Alle Versuche wurden 3-mal durchgeführt, und die gezeigten Daten sind die Ergebnisse einer repräsentativen Verfolgung. </li></ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

George W. Rogers ist Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die das Instrument für die diese Tests wurden entwickelt, produziert.

Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mitochondrien aus 75 isoliert - 100 mg Maus-Skelettmuskel. Diese Tests können mit hoher Präzision durchgeführt werden, wie durch die enge Standardabweichung zwischen den drei Vertiefungen belegt. Wichtig ist, dass diese respirometrischen Assays erlauben die Ermittlung von wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der ETC, TCA-Zyklus, β-Oxidationswegs, Substrat-Transporter etc. auftreten werden, in einem häufig verwendeten Tiermodell. Es ist wichtig, den Grund für die Verwendung verschiedener Brennstoffe und Inhibitoren in diesem Protokoll verwendet markieren. Pyruvat / Malat und Glutamat / Malat respirometrischen Assays erlauben die Beurteilung komplexer I vermittelte Atmung, sowie die Beurteilung der jeweiligen Transporter, und im Fall von Glutamat, Desaminase 15. Alternativ kann die Kombination vonSuccinat / Rotenon ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Atmungsfluss durch Complex II des ETC seit Rotenon hemmt Komplex I und Succinat bietet Elektronen-Komplex II über die Reduktion von Flavinadenindinucleotid (FADH 2) 15. Diese Untersuchungen liefern substratspezifischen Information, die Kopplungseffizienz und maximale Atmung. Der Elektronenstrom Assay ist, daß die Kombination von Substraten und Inhibitoren ermöglicht die Bewertung von Mehrfachkomplexen in mitochondrialen Atmungsfluss 9 einzigartig. Das Ausgangssubstrat Mischung von Pyruvat / Malat + FCCP erlaubt die Auswertung von maximal Atmung durch Komplex I angesteuert, während die Injektion von Rotenon gefolgt von Succinat ermöglicht die Beurteilung maximale Atmung durch Complex II angetrieben. Die Injektion von Antimycin A, ein Inhibitor der Komplex III, gefolgt von der Injektion von Ascorbat / TMPD ermöglichen die für die Auswertung der Atmung durch Komplex IV da die Ascorbate angetrieben / TMPD istElektronendonor zu Cytochrom C / Complex IV. Während keine Informationen über die Kopplungseffizienz erreicht wird, ist das Verfahren ideal für sehr kleine Probengrößen, die das Ausführen mehrerer Substrate unabhängig auszuschließen. Schließlich ermöglicht die Analyse der Koordinierung zwischen β-Oxidation und die ETC da die aus der Oxidation von Palmitinsäure (β-Oxidation) hergestellt Reduktionsäquivalent der Einsatz von Palmitoylcarnitin / Malat Einspeisung ins ETC durch das Elektronenübertragungs Flavoprotein 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Kupplung und die Elektronen fließen Assays können auch in Tandem aufgrund einiger Eingriff (medikamentöse Behandlung, genetische Manipulation) verwendet werden, um Veränderungen in der mitochondrialen Funktion identifiziert werden. Die hohe Präzision für diese Assays erreicht ist vor allem eine gute Durchmischung der Mitochondrien, sei es vor der Proteinbestimmung, bzw. mit den Substratlösungen ist. In diese Richtung einmal den Mitochondrien in das Substrat solutio resuspendendns, ist es wichtig, diese Lösung gut vor dem Laden der Zellkultur-Platte, wie in Schritt 2.2 mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze beschrieben mischen. Die Nichtbeachtung der Mitochondrien gründlich mischen wird, um große Variation innerhalb des Assays führen. Zusätzlich mit einer schmalen Öffnung Pipettenspitze wird Scherkräfte zu erzeugen, während das Mischen der Mitochondrien und erhöht das Potential, um die Membranen der Mitochondrien und die Freisetzung von Cytochrom C. Die Einhaltung der Schritt (2.7) ist ebenfalls ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll zu beschädigen. Bei Nichtbeachtung der geladenen Zellkulturplatte lang / schnell genug drehen wird in unvollständiger Einhaltung der Mitochondrien zum Brunnen führen, so führen erhöhte Variabilität zwischen den Bohrlöchern und Messungen. Die beschriebenen Protokoll wurde optimiert, um die folgenden: Laden eine optimale Menge an mitochondrialer Protein pro Loch, mit den richtigen Konzentrationen / Herstellungsverfahren, um Lager und Substratlösungen zu machen, die Änderung der Testlauf, um mitochondriale Zustand pla sicherzustellen,teaus und geeignete Durchmischung der mitochondrialen Lager und mitochondriale / Substratmischungen. Vor diesen Optimierungsbemühungen stießen die Autoren Fallstricke in der Testlauf. Im Folgenden beschreibt Methoden zur Problembehandlung / Änderungen, die hilfreich bei der Optimierung dieses Protokoll gab. In Bezug auf die optimale Beladung wird geladen zu wenig Mitochondrien nicht eine robuste Reaktion hervorzurufen, während das Laden zu viel Mitochondrien wird die Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer erschöpfen und führen zu ungenauen Messungen. Rogers et al 9 enthält Beispiele für die Bestimmung der optimalen Beladungsmengen der Mitochondrien pro Vertiefung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays. Häufiger zu viel Mitochondrien pro über 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten&gt; 1500 pmol / min / Vertiefung geladen sowie durch staatliche belegt 2 Raten. Wenn über Laden auftritt, ein Experiment mit verschiedenen Konzentrationen von mitochondriales Protein (beispielsweise zwischen 1 -. 10 ug) zu OCR innerhalb des dynamischen r hervorrufenange des Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine. Herstellung und Verwendung der richtigen Konzentrationen von Substraten und Aktien ist von größter Bedeutung. Verwenden Sie immer die Säureform von Substraten / Injektionen und der pH-Wert mit Kaliumhydroxid oder HCl; Natrium-Puffer / Lösungen sind nicht zu empfehlen. Darüber hinaus Resuspendieren Substrate / Aktien in DMSO oder 100% Ethanol wird in der Messfehler oder Fehler. Achten Sie darauf, 95% Ethanol zu verwenden, wo gemerkt. Es ist üblich, Palmitoylcarnitin, um aus dem 95% Ethanol nach dem Auftauen des gefrorenen stock auszufällen, wodurch große Variabilität. Seien Sie sicher zum Aufwärmen der Palmitoylcarnitin Lager und Wirbel vor Gebrauch gut. Darüber hinaus kann ein sehr variables Pyruvat / Malat-Assay-Ergebnis durch die Pyruvat stock Befinden&gt; 2 Wochen alt sein. Achten Sie darauf, gefrorenen Aliquots von Pyruvat alle 2 Wochen erneuern. Der Testlauf wurde auf 2-min-Messungen modifiziert, um mitochondriale Staatsebenen zu gewährleisten. Wenn Beobachtung der Erschöpfung der ADP gewünscht wird, kann der Forschererstrecken sich die Messzeit auf der Registerkarte &quot;Protokoll&quot; unter dem &quot;Test Wizard&quot; Forum. Schließlich tritt große Variabilität bei der mitochondrialen Lager und Mitochondrien sowie Substratlösungen sind nicht vollständig vor dem Verladen homogenisiert. Wenn Variabilität zwischen Brunnen hoch ist nach dem Testlauf, müssen Sie vollständig vor dem nächsten Versuch mischen die Substratlösung. Nie vortexen die Mitochondrien / Substratlösungen, sondern rühren, Maische, und sanft verreiben mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze. Es gibt einige Einschränkungen dieser Technik, die erwähnenswert sind. Erstens ist die Anzahl der Vertiefungen auf der Zellkulturplatte für diese Assays verwendeten relativ niedrig ist (dh., Mit 24 Vertiefungen und die Blindvertiefungen bezeichnet mindestens 2). Wenn es gewünscht ist, alle 5 dieser Assays auf einer Platte durchzuführen, ist der Forscher nur in der Lage, die Reaktionen aus einer Maus zu einem Zeitpunkt zu untersuchen. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass 96 auch Instrumente zur Verfügung steht higher Durchsatz. Zweitens gibt es inhärente Stärken und Schwächen bei der Beurteilung mitochondriale Dysfunktion in isolierten Mitochondrien im Vergleich zu intakten Zellen 1. Einige Schwachstellen sind mit weniger physiologische Relevanz im Vergleich zu intakten Zellen und induzieren Artefakte aus dem Isolationsprozess. Schließlich ist der Erfolg dieser Methode abhängig von der Qualität der mitochondrialen Isolationsprozesses. Obwohl einige dieser Assays wurden entweder in verschiedenen Systemen entwickelt haben oder in anderen Tiermodellen validiert, die hier vorgestellten Verfahren sind die ersten, alle zuvor erwähnten Tests für die optimale Verwendung in einer Multi-Well-Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine mit Maus synthetisieren Skelettmuskulatur. Wichtiger ist, daß alle 5 dieser Assays mit der Menge an Mitochondrien aus ~ 75 getrennt durchgeführt werden, - 100 mg Maus Skelettmuskel, wodurch hohen Durchsatz bei geringen Material. Von großer Bedeutung ist die Fähigkeit der MultiwellSauerstoffverbrauch Technologien auf Assays mit minimalen Mengen von Mitochondrien, in Kombination mit einer optimierten Isolierungsverfahren durchzuführen, ermöglicht es dem Forscher, eine Vielzahl weiterer Experimente mit dem Rest des Skelettmuskelgewebe (z. B. Western-Blots durchzuführen, RT-PCR, enzymatische Assays, etc.), die oft ein Kampf mit diesem Tiermodell. Abschließend können die hier vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden benötigen nur minimale Mengen von Gewebe und Mitochondrien. Einmal gemeistert werden die hierin beschriebenen Techniken können die Forscher einen potentiellen Mechanismus, einer Verbindung oder eines Genprodukts mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem üblicherweise verwendeten Tiermodell zu bestimmen.

Die wichtigste physiologische Rolle von Skelettmuskel Mitochondrien ist es, ATP aus oxidative Phosphorylierung 1 zu produzieren. Wichtig ist, zu spielen Skelettmuskel Mitochondrien eine besondere Rolle bei der körperlichen Leistungsfähigkeit 2, Alterung 3, degenerative Erkrankung 4 und Diabetes Typ II 5. Als einer alternden Gesellschaft und Typ-II-Diabetes als die 7. führende Todesursache in den Vereinigten Staaten 6, der Bedarf an Methoden, die die Funktion der Mitochondrien zu beurteilen hat sich immer häufiger in der biomedizinischen Forschung 7,8. Insbesondere ist die Messung des Sauerstoffverbrauchs hat außergewöhnliche Nützlichkeit bei der Beurteilung der Mitochondrienfunktion, da sie das koordinierte Zusammenwirken zwischen mitochondrialen und nuklearen Genome stellt den funktionalen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung 9 auszudrücken. Mehrere Technologien existieren, ermöglichen die Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen und zu isolieren,d Mitochondrien 7-10. Darüber hinaus haben Tests für mehrere Zelltypen und Geweben entwickelt worden und in einer Vielzahl von Arten, die für die Messung der mitochondrialen Atmungswege und Steuer 9,11,12 ermöglichen. Allerdings gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung aller dieser Tests unter Verwendung von isolierten Mitochondrien aus Maus Skelettmuskel für die Verwendung in auf Mikrotiterplatte Sauerstoffverbrauch Technologien. Wichtig ist, dass Verwendung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays unter mitochondrialen Biologen wächst und ermöglicht hohe Durchsatzmessungen mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien 9. Daher ist eine Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests wurden entwickelt, die die Ermittlung, wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der Elektronentransportkette (ETC) auftreten werden, zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden zwei weitere auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays entwickelt, die die Analyse der Koordinierung betwee aktivierenn der Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und der ETC und zwischen ß-Oxidation und der ETC. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden liefern eine klare und präzise Art und Weise, um mechanistische Veränderungen im mitochondrialen Funktion in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Abbildung 1 für Sauerstoff Verbrauchsraten (OCR) für die Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat-Assays (Coupling-Assays). Diese Assay-Kurven werden als Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR, als Funktion der Zeit angezeigt wird, werden Hintergrund correceted und werden als Punkt-zu-Punkt-Preise angezeigt. Jedes Panel repräsentiert Sauerstoffverbrauch in verschiedenen mitochondrialen Zustände wie durch Zufall und Williams 14 beschrieben. Die erste Platte darstellt basale Sauerstoffverbrauch oder Zustand 2 der zweiten Platte, nach der Injektion von ADP stellt maximale gekoppelt Atmung oder Zustand 3 der dritten Platte nach Injektion Oligomycin A (ein Inhibitor der Komplexe V) darstellt, die Atmung durch Protonenleck oder Staats 4o. Die vierte Platte nach Injektion FCCP stellt maximale entkoppelt Atmung oder Staats 3u. Schließlich wird das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A, stellt die Hemmung der oxidativen Atmung. Bemerkenswerterweise all mitochondrialen Staaten haben minimale Standardabweichung. Dies ist auf eine gute Durchmischung der mitochondrialen Lager und den Mitochondrien / Substratmischungen und die Verwirklichung eines einzelnen Monoschicht der Mitochondrien nach der Einhaltung Spin (Schritt 2.6). Auf der anderen Seite, das Laden ungleiche Mitochondrien in jede Vertiefung geben und nicht das Erreichen einer einzigen Monoschicht aus Mitochondrien in der Vertiefung der Mikroplatte führt zu der Standardabweichung in jedem Zustand erhöht, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Kurven in Abbildung 1 Anzeigeebenen für jedes mitochondriale Staat und für jedes Substrat. Das Plateau nach zwei Meßzyklen erreicht schlägt gute mitochondrialen Qualität und die Mitochondrien bleiben an dem auch während der gesamten Dauer des Assays haftet. Zusätzlich kann das Erreichen des Maximalplateau Raten wünschenswert sein, da dies ermöglicht es dem Forscher, die durchschnittliche OCR an diesen mitochondrialen Zustände einnehmen, wodurch Vorspannung, die auftreten können Reduktionsdurch willkürliches Auswählen eines Punktes. Die Höhe der Mitochondrien pro Vertiefung wurde durch Optimierungsversuche ermittelt. Die optimale Menge an Mitochondrien pro Vertiefung sollte in State 2 Raten zwischen 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten &lt;1,500 pmol / min / Loch, da diese Werte in dem dynamischen Sauerstoffmessbereich des Multiwell-Sauerstoff- Verbrauchsmessung Maschine. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Well in OCRs über den dynamischen Bereich des Instruments (3A) führen. 3 veranschaulicht das Laden mit 3,5 ug des mitochondrialen Protein pro Well (blaue Spur) im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (red Tracing) für die Succinat / Rotenon Assay. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Vertiefung kann auch auf die Erschöpfung der Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer des Bohrlochs zu führen, wodurch eine genaue Messung der OCR für jede aufeinanderfolgende Messung 9 (3B &lt;/ strong&gt;). Punkt-zu-Punkt OCR die momentane Änderungsrate des OCR. Wenn flach, ist das OCR stetigen / stable, aber wenn abnimmt, dann kann es eine biologische oder technische Problem sein. Der starke Rückgang in OCR in Zustand 3 und Zustand 3u Atmung (3A) wird von den Mitochondrien anstrengend die Sauerstoffversorgung vor dem Ende der Messung (3B) verursacht. 4 stellt OCR gegen die Zeit für den Elektronenfluss Assay. Das Verfolgen korrigiert und angezeigt, wie für Figur 1 beschrieben wurde. Die erste Platte in diesem Test entspricht dem Stand 3u Atmung auf Pyruvat / Malat über komplexe I. die zweite Platte nach Injektion Rotenon stellt die Hemmung der Komplex I vermittelte Atmung. Das dritte Panel, nach der Injektion von Succinat, stellt Substrat angeregt Staat 3u mit Elektronen in die ETC in Complex II (Complex II vermittelten Atmung). Die vierte Platte nach Injektion Antimycin A stellt die Hemmung der Komplex III und damit insgesamt die Atmung. Schließlich wird das fünfte Panel nach Injektion von Ascorbat / TMPD stellt Komplex IV vermittelten Atmung. Ähnlich den Kurven in Figur 1 haben alle mitochondrialen Zustände minimale Standardabweichung und jeweils Rate hat oder beinahe ein Plateau erreicht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kupplung Assays. (A) 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat, (B) 10 mM Succinat / 2 uM Rotenon, (C) 40 &amp; mgr; M Palmitoylcarnitin / 1 mM Malat und (D) 10 mM Glutamat / 10 mM Malat gekoppelt mitochondriale Atmung Assay-Kurven, wie durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g für alle Tests außer Succinat / rotEnon, das 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung verwendet. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; PAL-C = Palmitoylcarnitin; GLUT = Glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Abbildung 2 sehr unterschiedlich Pyruvat / Malate Assay. Sehr variabel 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat-Test durch unvollständig Misch Mitochondrien aus der mitochondrialen Lager im Substrat / MAS-Mix, damit variable mitochondrialen pro führenden verursachtProteinbeladung in jede Vertiefung. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Abbildung 3. Überlastung mitochondriale Protein für die Succinat / Rotenon Assay. (A) Die Sauerstoffverbrauchsraten außerhalb des dynamischen Bereichs der Multiwell Sauerstoffverbrauchsmessmaschine durch Laden 3,5 ug mitochondrialen Protein pro Well (blau Verfolgung) verursacht im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung). (B ) OxyGen Spannung nähert folgenden ADP und FCCP Injektionen durch Laden übermäßige mitochondriale Protein (3,5 ug) pro Vertiefung (blaue Spur) verursacht im Vergleich zu dem Laden eine optimale Menge (2,5 ug) der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung) Null. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikate pro mitochondriale Proteinmenge. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; O 2 = Sauerstoff; mm Hg = Millimeter Quecksilber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Abbildung 4. Elektronenfluss Assay. 5 mM Pyruvat / 1 mM Malat + 4 uM FCCP, Elektronen fniedrige mitochondriale Atmung Assay Verfolgung durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; Anti-A = Antimycin A; Asc = Ascorbate; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl- p-Phenylendiamin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lizenz Konzentration </td><td> MW </td><td> Schluss Volume </td><td> Masse gegeben </td><td> Kommentare / Beschreibung </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (g oder ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml 1 M Tris-Base </td><td> 3,801 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> 250 ml DiH 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl 2, Hexahydrat </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml DiH 2 O </td><td> 50,82 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Pyruvat-pH-Wert 7,4 </td><td> 0.1 </td><td> 88.06 (Kommt als 14.11 M Lösung) </td><td> 40 ml DiH 2 O </td><td> 0,283 ml Pyruvinsäure </td><td> Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C, stellen frische alle zwei Wochen </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure pH-Wert 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 118,09 </td><td> 100 ml DiH 2 O </td><td> 9,4 g succinic Säure </td><td> Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Malate, pH 7,4, </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 100 ml 95% Ethanol </td><td> 6,7 g Apfelsäure </td><td> Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0,01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Stellen Sie 300 ul Aliquots und bei -20 ° C; Mischen Sie mit einer äquimolaren Menge von Ascorbat zu TMPD zu halten reduziert </td></tr><tr><td> Palmitoyl-L-Carnitinchlorid </td><td> 0,01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml 95% Ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 0,006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml 95% Ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Machen Sie 20 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0,01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml 95% Ethanol </td><td> 0,01 g </td><td> Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 0,001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml 95% Ethanol </td><td> 0,0039 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9,12 ml 95% Ethanol </td><td> 0,025 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0,5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml DiH 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Äpfelsäure, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Table 1. Stammlösungen <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagens </td><td> Lizenz Konzentration </td><td> Masse gegeben </td><td rowspan="2"> Endmolarität / Percent </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g oder ml) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> - </td><td> 11.98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannit </td><td> - </td><td> 20,04 g </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Monobasisches Kaliumphosphat </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2, Hexahydrat </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Im Wesentlichen Fettsäure Free- BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0,20% </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml Aliquot und bei -20 ° C * Hinweis: Ausschließen BSA für die Assay-Injektionen verwendet MAS-Mix. <table border="0"><tbody><tr><td> Substrat Medium </td><td> Endkonzentration </td><td> Lagerbestand (ul) </td><td> Anzahl der MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Pyruvat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mm / 5 mM </td><td> Pyruvat: 1.000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenon </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 &amp; mgr; M </td><td> Succinate: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenon 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Pyruvat / Malate + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mm / 1 mm / 4 &amp; mgr; M </td><td> Pyruvat: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malate: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoyl L-Carnitin / Malate </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitin: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mm / 10 mM </td><td> Glutamate: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malate: 200 </td></tr></tbody></table> Table 3. Substratlösungen pH 7,4: Stellen Sie frischen der Tag des Experiments. * Electron-Flow-Assay-Lösung. <table border="0"><tbody><tr><td> Injektionsmittel </td><td> Konzentration </td><td> Lagerbestand (ul) </td> &lt;td&gt; Anzahl der MAS (ml) </td><td> Menge in Patrone injiziert </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Nach dem in der Platte eingespritzt) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 10 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 24 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 65 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr></tbody></table> TLage 4. Injektionen zur gekoppelten Assays pH 7,4:. Machen Sie frische der Tag des Experiments. * Kupplung Tests umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat. <table border="0"><tbody><tr><td> Injektionsmittel </td><td> Konzentration </td><td> Lagerbestand (g oder ul) </td><td> Anzahl der MAS (ml) </td><td> Menge in Patrone injiziert </td><td> Endkonzentration (Nach dem in der Platte eingespritzt) </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 2,0 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure- </td><td> 50 mM </td><td> 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 65 &amp; mgr; </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbate: 0.059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Injektionen zur Elektronenfluss Assay pH 7,4:. Machen Sie den Tag des Experiments Frisch <table border="0"><tbody><tr><td> Befehl </td><td> Zeit (min) </td><td> # Von Zyklen </td></tr><tr><td> Kalibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Warte ab </td><td> 10 min (zu ermöglichen Platte aus Einhaltung Schritt erwärmen) </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Michasure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Inject A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Instrument Run Protocol.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Aufrufe.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Serie: Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Röntgenbeugung von intakten Murine Skelettmuskel als Werkzeug zur Untersuchung der strukturellen Basis von Muskelerkrankungen

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...