The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Für Gewebeproben, die herkömmliche histologische Färbung, die Identifizierung und Analyse von Metalloxid-Nanopartikeln unterworfen wurden, durch eine Kombination von EDFM, HSI Mapping und Bildanalysetechniken erreicht werden. Während es die Flexibilität bei der Probenvorbereitung für die Histologie und Immunhistochemie (zB mit festen oder gefrorenen Geweben, die Art der Färbung), ist es wichtig, dass die Proben mit einer Dicke von 5-10 um für eine optimale Visualisierung geschnitten. Proben wurden hier mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten vor dem Schneiden mit einem Rotationsmikrotom bis 6 &amp; mgr; m Dicke, die auf Glasobjektträgern angebracht, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und mit einem Deckglas. Schweinehautgewebe von einem Ex-vivo-Hautpenetrations Toxikologie Zusammenarbeit wurden für diese Studie verwendet. Die Gewebe wurden zu Metalloxid-Nanopartikel (Aluminiumoxid, Siliziumdioxid, Ceroxid) in wässrige Suspensionen belichtet. Der Nachweis der Region (en) von Interesse (hoher Kontrast elemeNTS) mit EDFM ist ein entscheidender erster Schritt, die nachfolgenden HSI-Mapping und Analyse erleichtert. Positive und negative Kontrollproben müssen abgebildet werden und zunächst analysiert, um eine spektrale Bibliothek für Referenz erstellen. Die gesammelten Spektren der Positivkontrolle mit einer positiven Steuerspektrenbibliothek exportiert. Dann werden alle Spektren der negativen Kontroll Bilder von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle ist, um die Spezifität zu verbessern subtrahiert (Fehlalarme zu reduzieren). Die sich ergebende gefilterte Spektrenbibliothek gilt als der RSL, die für die Analyse von Materialien von Interesse dient. Alle Gewebeproben durchlaufen die gleichen Abbildungsverfahren und gegen die RSL abgebildet. Das resultierende Bild wird nur Bereiche mit Elementen von Interesse über einen schwarzen Hintergrund enthalten. Dieses Bild könnte dann mit ImageJ mit seinen Schwellenwert und Partikelanalysefunktionen, die Fläche der abgebildeten Partikel pro Sichtfeld zu erhalten, analysiert werden. Von ImageJ erhaltenen numerischen Daten können Export seined in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse. Es ist wichtig zu beachten, dass als biologische Proben sind von Natur aus unterschiedlich voneinander und Färbeverfahren kann Visualisierung durch EDFM und HSI beeinträchtigen, sollten die Belichtungseinstellungen entsprechend, was das beste Bild mit hohem Kontrast für eine bestimmte Art der Probe bestimmt werden. Obwohl Reduktion von Fehlalarmen durch die Filtration von Spektrenbibliotheken erreicht werden kann, ist es von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige negative Kontrollen, die Kontamination mit dem Element von Interesse vermieden werden können, zu erhalten, wie die Spektren entsprechend dieser Verunreinigung könnte möglicherweise von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle die gefiltert werden , die Erhöhung der falsch negativen Ergebnisse. Auch kann das Spektrum Intensitätsbereich, der mit der hyperspektralen Bildbearbeitungssoftware nachweisbar ist die Grenze der bestimmten Software nicht überschreiten (für diese Studie ist, dass 16.000 Einheiten): Gebiete mit einer hohen Anzahl von angesammelten Partikel, die sp produzierenectral Intensitäten über der Intensitätsgrenze werden aus der Spektrenbibliothek gelassen, da die Gefahr einer Erhöhung der Anzahl von falschen Negativen. Während die HSI System verleiht viele Vorteile gegenüber traditionellen Verfahren gibt es einige Nachteile und Einschränkungen zu berücksichtigen. Einer ist, dass die große Menge von optischen Daten gesammelt werden, können erhebliche Rechenleistung erfordern. Ein weiterer Grund ist, dass HSI kann zeitintensiv sein, vor allem im Anfangsstadium, wenn Referenzspektrenbibliotheken werden geschaffen. Auch kann Bildgebungszeit mehrere Minuten pro Bildaufnahme erfordern, so dass es langsamer als einfache Dunkelfeld-Bildgebung; jedoch ist es immer noch schneller als eine Abtastung Herstellung und Visualisieren durch Elektronenmikroskopie. Zusätzlich können komplexe Systeme in mehreren charakteristische Spektren, die die Entwicklung von hochspezialisierten Kontrollen erfordern und machen die Einrichtung von standardisierten, Universalbibliotheken schwierigen 26 führen. Schließlich ist die Tech-nique zu einer geringeren Auflösung als Sonden- oder elektronenmikroskopische Techniken wie Rasterkraftmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie, die einzelne Atome auflösen kann. Auflösung dieses Verfahren ist begrenzt aufgrund seiner photonische Natur, die es entfernt, ein hochpräzises Instrument zur Messung der Partikelgrößen im Nanometerbereich oder für die präzise Platzierung von Materialien bei einer Sub-Mikrometer-Ebene verhindert. Während die Technik in der Lage, Partikel in bestimmten Gewebekammern oder Zellorganellen zu lokalisieren größer als 1 um (wie Zellkerne), kleiner Organellen oder Merkmale sind schwierig genau zu diesem Verfahren zu visualisieren. Auch der Hinweis, aufgrund seiner räumlichen Auflösung kann diese Methode nicht zwischen den einzelnen Nanopartikeln und Agglomerate 11 zu differenzieren. Andere Überlegungen sind: bestimmte Materialien (zB Edelmetalle) haben viel höhere Reflektivität und unterschiedliche spektrale Profile, die machen sie leichter zu Analyze und spektral Karte mit diesem Tool. Andere, wie den Halbmetalloxide in dieser Studie untersucht und Kohlenstoff-Nanomaterialien 24, 27 kann eine größere Herausforderung aufgrund ihrer elementaren Zusammensetzung, Form haben, und in Abhängigkeit von der Matrix. In zwei murinen Inhalationsstudien von Mercer et al., Wurde ein ähnliches System, das in dieser Studie verwendet, um Kohlenstoff-Nanoröhren in der Lunge und in sekundäre Organe auf der Grundlage ihrer bemerkenswert hohen Kontrast mit umgebendem Gewebe zu lokalisieren verwendet. Jedoch wurde hyper Zuordnung nicht in beiden Studien zeigten, wahrscheinlich, weil die einzigartige Form von Kohlenstoff-Fasern war eine ausreichende Eigenschaft zur Identifizierung. Eine weitere Überlegung betrifft speziell auf Gewebe: seit Abscheiden Nanopartikeln interessieren bestimmten Organen durch normale biophysikalischen Prozesse unvorhersehbar ist (und oft selbst das Thema der Studie) kann die Bestimmung eines anwendbaren positive Kontrolle schwierig sein und erfordert Überlegung, wie Erzeugung des Steuer might beeinflussen den Zustand eines Materials von Interesse. Wenn beispielsweise ein Spektrenbibliothek aus unberührten Nanopartikel von Interesse erzeugt, kann es schwierig sein, um die Bibliothek zu denselben Nanopartikel in Geweben oder Zellen der Karte aufgrund von Änderungen in den Spektren von Veränderung des Teilchens (z resultiert, aufgrund einer Änderung in pH, Auflösung, Agglomeration, Proteinbindung) und die Gesamtmikroumgebung oder Matrix. Schließlich ist das Verfahren in seiner semi-quantitative Natur beschränkt: sie kann nur als quantitative andere zweidimensionale Mikroskopietechniken ähnlicher Auflösung, das heißt, sie kann nicht einfach verwendet werden, um Aufgaben wie die Charakterisierung Gesamtorgan Last eines Materials durchführen zu können. Insgesamt EDFM und HSI bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Nano Bildgebung und Charakterisierungstechniken, wie TEM HAADF und DIC. EDFM / HSI ermöglicht eine schnellere Bildaufnahme und Analyse, die Zeit und Kosten spart im Vergleich zu intensiveren convenlen Techniken. Außerdem ist die Probenvorbereitung für EDFM / HSI typischerweise sowohl minimal als auch zerstörungsfrei, das spart Zeit und ermöglicht eine flexiblere Analyse einer bestimmten Probe, da es dann für andere Techniken eingesetzt werden. Weiterhin ist HSI vielseitig, so für die Analyse von nanoskaligen Materialien vieler Zusammensetzungen und in einer Vielzahl von Matrizen. Das Forscherteam arbeitet daran, die für andere Materialien und Probentypen, einschließlich einer eingehenden Beurteilung der Spezifität der Technik beschriebene Verfahren zu verfeinern. Eine kritische nächste Schritt untersuchte das Forscherteam ist die Validierung dieser Verfahren gegen die traditionelle Goldstandards (zB Raman, TEM, SEM) für die Materialien und Gewebetypen von Interesse.

Als Nanomaterialien werden zunehmend in einer Vielzahl von Branchen und Anwendungen verwendet wird, gibt es einen Bedarf für nanoskalige Bildgebung und Charakterisierungsmethoden, die eine schnellere, erschwinglich und bequemer als traditionelle Modalitäten wie Elektronenmikroskopie sind. Nanopartikel (NP) Wechselwirkungen mit Zellen, Geweben und lebenden Systemen viele optische Techniken eingesetzt worden, einschließlich der Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie 1 und abklingende Feld basierte Ansätze, wie beispielsweise innere Totalreflexion (TIR) ​​oder Nah- visualisieren Rasterlichtmikroskopie (NSOM) 2,3. Allerdings sind diese High-End-Analyseansätze, außerhalb der Reichweite der meisten Nicht-Fachlaboren 4. Elektronenmikroskopie, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), ist ebenfalls verwendet worden, um NP Wechselwirkung mit Zellen 5,6,7,8 studieren. Hohe Winkelringdunkelfeld (HAADF) Rastertransmissionselektronenmikroskop wurde genutzt, um die Wechselwirkung von Nanopartikeln untersuchenmit Viren 9. Konfokale Mikroskopie ist eine weitere beliebte Technik zur NP-Zell-Interaktionen 10 zu studieren. In den letzten Jahren haben Dunkelfeld-basierten hyperspektrale Bild (HSI) -Techniken als vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung der analytischen NPs in biologischen Matrizen 11 verwendet. HSI Systeme erzeugen eine dreidimensionale Darstellung der räumlichen und spektralen Daten, als Hypercube oder DATACUBE 12 bekannt. Die räumliche Karte von spektralen Variation für Materialidentifikation verwendet. Spektralprofile bekannte Materialien erzeugt und als Referenzbibliotheken für den Vergleich mit unbekannten Proben verwendet werden. Einer der großen Vorteile, die mit HSI Systemen ist ihre Fähigkeit, mit Abbildungsspektroskopie kombiniert realisiert und damit die Lage und Verteilung der unbekannten NPs in vivo oder ex vivo sowie deren Verknüpfung mit einem anderen Referenzpartikel von bekannten, ähnlichen Zusammensetzung. Es gibt mehrere Vorteile dermit HSI-Systeme gegenüber konventionellen bildgebenden Verfahren: minimale Probenvorbereitung erforderlich ist; Probenvorbereitung ist in der Regel nicht-destruktive in der Natur; Bildaufnahme und Analyse schneller ist; die Technik kostengünstig ist 13; und die räumliche Verteilung und die Analyse von Verbindungen mit gemischter Zusammensetzung und / oder in komplexen Matrizen leichter durchgeführt 14. Für Nanomaterialien Forschung mit wertvollen Proben, ist einer der wichtigsten Aspekte der Verfügbarkeit einer zerstörungsfreien bildgebendes Verfahren, das für das Potential wiederholt untersuchen Proben durch eine oder mehrere Methoden ermöglicht. Wiederholte oder mehrere Analysen erwünscht, um umfassende Datenbestände, die nicht wäre von einer einzigen Methode zur Verfügung zu entwickeln. Um dieser Hinsicht studiert seine optischen Eigenschaften ist der sicherste Weg, um die Probe zu analysieren. Durch Verwendung eines verstärkten Dunkelfeldmikroskop (EDFM) und HSI-System, um die optische Antwort der Probe zu untersuchen - nämlich reflectance, aber auch die Absorption und Durchlässigkeit - Funktion Identifizierung und Charakterisierung durchgeführt 15 werden. Potenzielle Charakterisierung Endpunkte umfassen eine Beurteilung der relativen Größe und Form von Nanopartikeln oder Agglomerate und Verteilung von Nanopartikeln in einer Probe. In diesem Papier beschreiben wir Mapping-Methoden, die speziell für Metalloxid-Nanopartikeln in post-mortem Gewebe mit einem HSI-System basiert auf einer Pixel-spektrale Übereinstimmung Algorithmus, um als spektraler Winkel Mapper (SAM) bezeichnet. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung, weil sie das Potenzial, um in vivo Nanotoxikologie Forschung, bei der Tiermodelle werden verwendet, um die gesundheitlichen Auswirkungen der Exposition gegenüber Nanomaterialien zu bewerten ergänzen aktuelle und zukünftige hat. Anwendung dieses Verfahrens könnte auch nanoskalige Arzneimittelabgabe Forschung, die Gewebe oder Tiermodellen verwendet zu informieren. Insbesondere Nanopartikel-Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung im gesamten organs und Geweben konnte mit diesem System untersucht werden. Eine breite Vielfalt von Anwendungen für die Verwendung in der biomedizinischen Forschung 11 untersucht. Dieses Verfahren könnte für die Beurteilung der verschiedenen biologischen Proben (wie beispielsweise verschiedene Arten Geweben, Bronchiallavage Proben und Blutausstrichen), die Nanopartikel aus einer Vielzahl von Elementzusammensetzungen 16-19 ausgesetzt worden sind, verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für die Untersuchung Nanopartikel Bioverteilung in vivo und in vitro, die einschlägigen für nanoskalige Arzneimittelverabreichungsstudien 11. Über biologische Proben kann EDFM und HSI verwendeten Nanopartikel in Umweltproben, wie beispielsweise Abwasser 20 auszuwerten. Berufliche Expositionsbewertung kann durch die Verwendung dieser Technik als auch erleichtert werden, denn es kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von persönlicher Schutzausrüstung bei der Verhinderung Nanopartikel Eindringen zu bewerten. Darüber hinaus wird die Forschung teUhr entwickelt derzeit eine ähnliche EDFM und HSI-Protokoll für die Bewertung der Filtermedien Proben von Nanopartikeln aus beruflichen Expositionsbewertungen gesammelt. Während Herstellung dieser verschiedenen Probentypen für EDFM und HSI kann variieren, ist es wichtig, dass sie in einer Weise, dass sie leicht durch das optische System visualisiert werden hergestellt. In der Regel sollte die Probe vorbereitet, als ob es über herkömmliche Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Es gibt mehrere hyperspektrale Bildgebungssysteme im Handel erhältlichen 11.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Hyperspektraler Mikroskopie nützlich ist für seine Fähigkeit, Materialien in einer ähnlichen Weise wie Spektrophotometrie identifizieren. Wie in Figur 1 angedeutet, hat jede Material mehrere charakteristische Spektren und eine Gesamtform der Reflexionsgrad, die einzigartig ist. Ferner veranschaulicht 1 die Matrix-abhängige Natur der spektralen Profilen: die spektralen Profile für jeden der drei Metalloxide in histologischen Gewebeproben (oberes Feld) verschieden von den spektralen Profilen für jede der drei Metalloxide in wässriger Suspension (sind Bodenplatte). Durch die Zuordnung der charakteristischen spektralen Profile unbekannter Proben in der gleichen Matrix, ist die Technik zum Bestimmen von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Materials und kann auch halbquantitativ vergleichen relativen Mengen des Materials in den Proben. Die Referenzspektrenbibliotheken aus positiven Kontrollhautproben erstellt für die Zuordnung zu experimentellen geeignet sindHautproben. Wie in 2 zu sehen, ordnen die Referenzspektrenbibliotheken auch zu den entsprechenden positiven Kontrollen und nicht zu den entsprechenden Negativkontrollen Karte. Der wichtigste Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, geringe Mengen von Materialien von Interesse in den Proben zu erfassen, sowie um sie von Verunreinigungen zu unterscheiden. . Beispielsweise können einzelne Nanotubes in der Lunge während der Inhalation von Dosen so niedrig wie 40 &amp; mgr; g in einem 20-30 g Ratten-25 beobachtet werden Abbildung 3 zeigt dies in histologischen Hautproben: während einige Partikel in der Dunkelfeld-optische Bild ohne weiteres auf der Hand (Spalte 2), andere mit hyperspektrale Bild (Spalte 3) mit Hellfeldmikroskopie (Spalte 1) oder andere Methoden, die verpasst haben könnte nachgewiesen. Die Verwendung von Dunkelfeld HSI dient auch dazu, die Spezifität gegenüber einfachen Hellfeldmikroskopie zu verbessern. Diese Bilder können dann einer mehr quantitativen Analyseformen sein, notably Partikelanalyse mittels ImageJ. Verbesserte Dunkelfeldmikroskopie hat verschiedene Anwendungen, auch in Abwesenheit von hyperspektrale Bild. Die erste ist die Fähigkeit, hochqualitative, hochkontrastreiche Bilder zu erzeugen. Dies wird am besten durch Figur 3 gezeigt, in der Teilchen von Interesse im Vergleich zu ihren Pendants Hell leicht identifizierbar sind. Diese Bilder können auch mengenPartikelAnalyse, wenn auch in der Abwesenheit von hyperspektrale Kartierung, ist Vorsicht geboten, um nicht zu verwirren eine Verunreinigung Partikel von einem Partikel von Interesse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bezugsspektrenbibliotheken (Gewebematrix) im Vergleich zu Spektrenbibliotheken (Nanopartikeln in Suspension). Diese Zahl zeigt die Bedeutung der Erzeugung eines Referenzspektrenbibliothek von nanomaterials von Interesse in der gleichen Matrix als Versuchsproben. Die erste Zeile zeigt die Referenzspektrenbibliothek (RSL) für jedes Material in dieser Studie (Aluminiumoxid, Siliciumdioxid und Ceroxid). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Diese RSL wurde nach dem in diesem Protokoll in dem positiven Kontrollgewebeproben wurden vor negativen Kontrollgewebeproben filtriert beschriebenen Verfahren erstellt. Die zweite Zeile zeigt Spektrenbibliotheken (SL) von den Nanopartikeln von Interesse in flüssigen Suspension auf einen Objektträger erstellt. Für Aluminiumoxid wurde eine bimodale Peak bei Wellenlängen von 500 und 650 in der RSL gefunden, wohingegen ein gekrümmter und weniger markanten Peak wurde im Aluminiumoxid NP Suspension SL bei etwa 600 für Siliciumdioxid, ein Peak bei einer Wellenlänge von etwa 650 zu sehen war in der RSL vorhanden, während eine gekrümmte und weniger markanten Gipfel wurde in der Silica-NP Suspension SL bei arou gesehennd 600. Ceroxid wurde eine bimodale Peak bei Wellenlängen von 520 und 620 in der RSL gefunden, wohingegen eine geringere Unterscheidungs ​​Peak wurde im Ceroxid NP Suspension SL bei etwa 560. Dies lässt vermuten, dass die Matrix, in der die Nanopartikel eingebettet sind, erzeugt gesehen eine Verschiebung der Spektren, die erheblich sein können, wenn Sie die Steuerelemente, um die SL für so spezifische Experiment erstellen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Abbildung 2. Referenzspektrenbibliotheken (Gewebematrix) abgebildet auf positive und negative Kontrollschweinehautgewebe. Dieser Wert dient als Bestätigung der RSLs gegebenenfalls für die Zuordnung zu experimentellen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass jedes RSL (linke Spalte) Karten auch zu seinem entsprechenden Positivkontrolle (mittlere Spalte) und nicht zu seinem entsprechenden Negativkontrolle (rechte Spalte) abzubilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken h</a>ere um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die hyperspektrale Kartierung von experimentellen Schweinehautgewebe, um Metalloxid-Nanopartikeln ausgesetzt. Zeilen von oben nach unten entsprechen verschiedenen Schichten der Haut, von oberflächlich tiefste Schicht: Epidermis, Dermis und des subkutanen Gewebes auf. Die erste Zeile zeigt das Stratum corneum der Epidermis, einer Hautprobe, die auf Aluminiumoxid-Nanopartikel in Suspension ausgesetzt war; die zweite Reihe wurde ausgesetzt, um NPs in Suspension Siliciumdioxid; und die dritte Zeile, um NPs in Suspension Ceroxid. Jede Säule stellt den gleichen Bereich der Haut mit verschiedenen Techniken abgebildet. Die erste Spalte entspricht Hellfeldmikroskopie (40X mag .; Skala bar = 50 &amp; mgr; m), wobei der Bereich in einem roten Quadrat mit wurde vergrößert (100X mag; Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m) mit einer verbesserten Dunkelfeldmikroskopie (EEFM) in der zweiten Spalte, wo weiße Pfeile auf den hohen Kontrast-Nanopartikel zeigen. Die dritte Säule wurde mit einem hyperspektralen Kamera (HSI) erzielt wurden, die die gleichen hohen Kontrast-Nanopartikel (weiße Pfeile). EDFM und HSI-Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung; Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. Die vierte Spalte zeigt die HSI Bild gegen den jeweiligen RSL für jede Expositions-Gruppe, in der Aluminiumoxid-Nanopartikel sind in grün, Silica-Nanopartikel in rot und Ceroxid-Nanopartikel in gezeigt abgebildet gelb sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identifizierung von Metalloxid-Nanopartikeln in histologischen Proben durch verbesserte Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrale Kartierung

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Aufrufe.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Serie: Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Die Herstellung einer Dipole-unterstützte Festphasenextraktion Microchip für die Spurenanalyse in Wasserproben

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.