Die DIC-Mikroskopie ist dem Dunklen Feld bei bildgebenden plasmonischen Nanopartikeln in komplexen Umgebungen überlegen. DIC erfordert jedoch auch mehr Wissen und Geschick, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die DIC-Mikroskopie bietet sowohl eine hohe seitliche Auflösung als auch eine geringe Schärfentiefe.
Beide Merkmale sind bei der Überwachung von Nanopartikeln in Zellen oder in komplexen Umgebungen äußerst wichtig. Verwenden Sie zunächst einen Schreibstift, um eine flache und kurze Kratzmarkierung auf die Mitte jedes Glasdeckels zu legen, und reinigen Sie dann das Glas, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als Nächstes entfernen Sie mit einer Mikropipette 100 Mikroliter einer 05-Milligramm-pro-Milliliter-Gold-Nanopartikellösung aus ihrem ursprünglichen Lagerbehälter und werfen Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr aus.
Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 6.000-facher Schwerkraft. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette, um das überschüssige Tensid aus der Nanopartikellösung loszuwerden. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter ultrareines Wasser in das Zentrifugenrohr.
Die Probe kurz wirbeln, um das Pellet aufzubrechen, und beschallen Sie es dann unmittelbar danach für 20 Minuten, um die Nanopartikelaggregate vollständig wieder aufzuhängen. Mit einer Mikropipette werfen sie sechs Mikroliter Nanopartikellösung auf den gereinigten und zerkratzten Glasdeckel. Dann den Deckelrutsch vorsichtig umdrehen und auf ein zweites größeres Stück Mikroskopglas legen.
Der Tropfen sollte sich schnell gleichmäßig zwischen den beiden Glasstücken ausbreiten. Achten Sie darauf, dass Luftblasen zwischen den beiden Glasstücken nicht eingeklemmt werden. Verwenden Sie eine schmale Linie von Nagellack, um die Kanten des Deckels abzudichten, um eine Verdunstung der Flüssigkeit zu verhindern.
Legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe, und richten Sie das Objektiv und den Kondensator des Mikroskops aus. Passen Sie den Fokus an, um die Fokusebene mit der Probe darauf zu finden, und suchen Sie die zuvor erstellte Scratch-Markierung. Konzentrieren Sie sich darauf und verfeinern Sie den Fokus, bis die Nanopartikel sichtbar werden.
Um die genaue Platzierung des Kondensators zu bestimmen, verwenden Sie die Kohler-Beleuchtungsmethode, indem Sie mit dem 20-fachen Objektiv beginnen und sich dann zu hohen Vergrößerungen wie 80 oder 100x bewegen. Wählen Sie als Nächstes einen Bereich aus, der für die Bildgebung innerhalb der Stichprobe von Interesse ist. Zentrieren Sie den Bereich im Sichtfeld der Kamera, und passen Sie den Fokus bei Bedarf an.
Wenn das Mikroskop das de Senarmont-Design hat, beginnen Sie mit dem Polarisator, der in der Nähe des maximalen Hintergrundaussterbens eingestellt ist, und drehen Sie den Polarisator nach und nach in Richtung abnehmendes Hintergrundaussterben. Die Hintergrundintensität wird allmählich zunehmen. Die ideale Einstellung wird erreicht, wenn die Nanopartikel ihren größten Intensitätsunterschied im Vergleich zum lokalen Hintergrunddurchschnitt erreichen.
Bei plasmonischen Nanopartikeln wird der größte Kontrast in der Regel mit einem relativ dunklen Hintergrund an oder in der Nähe des maximalen Hintergrundaussterbens erreicht. Deaktivieren Sie die Raumbeleuchtung, um zu verhindern, dass streunende Beleuchtung mit dem Prozess interagiert. Setzen Sie einen 10-Nanometer-Vollbreiten-Filter mit halbmaximalem Bandpassfilter mit seiner zentralen Wellenlänge zusammen mit der wichtigsten lokalisierten Oberflächen-Plasmon-Resonanzwellenlänge ein, um den Interessenbereich zu betrachten.
Passen Sie als Nächstes die Lampenintensität oder Belichtungszeit an, bis der Hintergrundpegel bei 5 % bis 40 % des maximalen Kapazitätspegels der Kamera liegt. Keine Objekte innerhalb des Interessenbereichs sollten Signalintensitäten aufweisen, die 90 % des maximalen Intensitätsniveaus der Kamera überschreiten. Bildn die Probe mit einer Reihe von Bandpassfiltern, die jeweils eine volle Breite von maximal 10 Nanometern haben und die als Ganzes eine Bildgebung über den gesamten Bandbreitenbereich ermöglichen.
Stellen Sie sicher, dass die Hintergrundintensität in den Bildern innerhalb von 5 % der anderen bleibt, indem Sie die Belichtungszeit und nicht die Lampenleistung anpassen. Nachdem Sie die Filter gewechselt haben, richten Sie das Beispiel neu aus, bevor Sie Bilder aufnehmen. Speichern Sie die Bilder als unkomprimierte TIFF-Dateien und/oder im nativen Dateiformat der Software, um alle relevanten Informationen zu erhalten.
Öffnen Sie das Bild mit ImageJ, um mit der Analyse zu beginnen. Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um ein Rechteck um den Hauptbereich von Interesse zu zeichnen. Wählen Sie dann auf der Symbolleiste Bild aus, gehen Sie zum Zoomen und wählen Sie die Auswahl aus.
Das Bildgebungsfenster wird auf den ausgewählten Bereich vergrößert. Wählen Sie als Nächstes Bild aus, passen Sie an, und wählen Sie Helligkeit/Kontrast aus. Um die Ansicht des Beispielbereichs zu verbessern, passen Sie das Minimum, das Maximum, die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an.
Diese Anpassungen ändern nichts an den wissenschaftlichen Daten, sie ermöglichen lediglich eine bessere Sichtbarkeit des Stichprobenbereichs. Verwenden Sie nun erneut das Rechteckwerkzeug, und zeichnen Sie eine Box um das erste zu messende Nanopartikel. Die Box sollte nur geringfügig größer sein als die luftige Scheibe des Nanopartikels.
Nach der Auswahl gehen Sie zu analysieren, und wählen Sie Kennzahl aus. Es wird ein neues Fenster angezeigt, das die minimalen, maximalen und mittleren Intensitäten für die Pixel innerhalb des ausgewählten Felds meldet. Wenn Sie die ursprüngliche Größe des Feldes beibehalten, ziehen Sie die Box in einen Bereich unmittelbar neben dem Partikel, in dem der Hintergrundkontrast relativ gleichmäßig ist und keine Partikel oder Verunreinigungen vorhanden sind.
Verwenden Sie das Messwerkzeug erneut, um die mittlere Intensität für den Hintergrundbereich zu bestimmen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Partikel in allen Bildern der Serie. Exportieren Sie dann die Daten in eine Kalkulationstabelle, um den Kontrast oder die Intensität jedes Partikels über alle Wellenlängen und Winkel hinweg zu berechnen.
Geben Sie in die folgende Gleichung ein, um den Kontrast jedes Partikels zu berechnen. Schließlich grafisch das Spektralprofil an einer bestimmten Nanopartikelposition, indem Daten mit der Wellenlänge entlang der X-Achse und dem Kontrast oder der Intensität entlang der Y-Achse dargestellt werden. Um die optimale Bildeinstellung zu bestimmen, wurden diese Gold-Nanosphären an mehreren Polarisator-Einstellungen abgebildet.
Bei null Grad erscheinen die Partikel meist weiß mit einem dunklen Streifen, der über ihren Mittelteil verläuft. Dies deutet auf eine Kreuzpolarisation für Nanosphärenproben hin. Wenn der Polarisator in verschiedene Winkel gedreht wird, werfen die Partikel dunkle Schatten in richtung einer Ecke.
Die Partikelkontrastwerte ändern sich jedoch dramatisch. Für diese Probe ist die optimale Bildgebungseinstellung mit einer Polarisatorverschiebung von 10 Grad. Hier wird die Wellenlänge gegen den Kontrast von Gold-Nanosphären dargestellt.
Jeder Datenpunkt stellt durchschnittlich 20 Nanosphären für jeden Partikeldurchmesser dar. Der Spitzenkontrast für jedes Teilchen verschiebt sich je nach Größe leicht. Die Intensität und Rotation ist bei anisotropen Formen wie dieser Gold-Nanostäbchen noch wichtiger.
Hier wird die Wellenlänge gegen die Intensität bei zwei verschiedenen Polarisator-Einstellungen dargestellt. In jedem Fall ist die Intensität der hellen Seite viel stärker als die der dunklen Seite. Das Intensitätsprofil einer einzelnen Gold-Nanostäbchen an ihrer lokalisierten Oberflächen-Plasmon-Resonanzwellenlänge während der Drehung der Bühne zeigt einen großen Intensitätsunterschied zwischen den dunklen und hellen Seiten, während die Probe um 180 Grad gedreht wird.
Die Probenabbildung ist äußerst wichtig. Es erfordert sowohl Fleiß als auch Geduld seitens des Mikroskops. Wenn Sie ein Experiment durchführen, bei dem die Stichprobe über einen Dreitage-Tag neu gefänden muss, sind Markierungen wie die Scratch-Markierungen entscheidend für die Verlagerung Ihrer Interessenregion.
Die DIC-Mikroskopie wird von Forschern, die Nanopartikel untersuchen, zunehmend interessant, insbesondere in dynamischen und zellulären Umgebungen. Denn DIC bietet eine optimale räumliche Auflösung, insbesondere in komplexen Sampling-Umgebungen.
