Hyperspektrale Bildgebung ermöglicht die Erfassung spektroskopischer Informationen an präzisen Stellen innerhalb einer Probe. Zum Beispiel für die Enthüllung der optischen Anisotropie auf einer einzigen Kristallebene. Die Generierung sowohl spektraler als auch räumlicher Daten einer Probe ermöglicht eine detailliertere Untersuchung der Probe, als dies allein durch Spektroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie möglich ist.
Eine große Anzahl von einstellbaren Parametern, die die Auflösung beeinflussen, kann auf den ersten Blick überwältigend erscheinen. Das Erstellen einer Checkliste kann jedoch bei der Vertrautheit mit dem System helfen. Diese Technik erfordert eine manuelle Abstimmung der Imaging-Hardware sowie Softwaremanipulationen.
Es ist wichtig, beide Aspekte visuell zu veranschaulichen, um zu zeigen, wie sich beide Methoden ergänzen. Das Verfahren mit Nelson Rutajoga demonstriert Emily Rodrigues, Postdoktorandin in meinem Labor. Um die Imager-Konfiguration für die hyperspektrale Bildgebungskartierung einzurichten, beginnend mit der Mikroskopstufe und dem Emissionsstrahlweg in Richtung der Detektoren, lassen Sie die Position für einen optischen Würfel direkt neben dem optischen Mikroskop frei und platzieren Sie den konfokalen optischen Würfel des Mikroskops in dieser Position, die die Emission von der Probe durch den sichtbaren Lichtpfad leitet.
Wenn Sie den optischen Pfad zum Detektor betrachten, platzieren Sie den sichtbaren optischen Würfel mit dem dichroitischen Spiegel und Filtern, um die sichtbare Emission auf den Detektionspfad in seiner Position zu lenken. Wenn Sie den Pfad zum Detektor fortsetzen, platzieren Sie den konfokalen optischen Pinlochwürfel in die richtige Position, um das Licht durch den sichtbaren Lichterfassungspfad zu lenken, und stellen Sie nach diesem Pfad den optischen Kubokometerwürfel in die entsprechende Position, damit das emittierte Licht den Detektor erreicht. Wenn alle Würfel vorhanden sind, passen Sie die Schlitzöffnung des Detektors manuell an die Größe des ausgewählten Lochs an.
Wählen Sie dann in der PHySpec-Software die Blende des Lochs aus. Positionieren Sie für die hyperspektrale Abbildungskartierung von Terbium Europium bipyrimidin trifluorcetylacetonate Einzelkristall manuell das 20-fache objektiv des optischen Mikroskops unter der Probe und drücken Sie den weißen Knopf auf der linken Seite des Mikroskops, um das weiße Licht einzuschalten. Drehen Sie den Knopf unter der Taste, um die Helligkeit einzustellen.
Stellen Sie den Vorwärtsknopf auf der rechten Seite des Mikroskops auf R, um 20 % des Signals an die Kamera und 80 % des Signals an den Detektor zu senden. Drücken Sie die Wiedergabe im Farbkamerafenster der PHySpec-Software, um einen Live-Scan zu starten. Wenn das Farbkamerafenster ein zu dunkles oder schwarzes Bild anzeigt, erhöhen Sie die Belichtungszeit und/oder den Verstärkungswert unter der Registerkarte Farbkamera.
Wenn das Bild zu hell ist, verringern Sie die Belichtungszeit und/oder den Gain-Wert. Um sich auf die Probe zu konzentrieren, drehen Sie die Regler des Mikroskops, um den Abstand zwischen dem Objektiv in der Bühne einzustellen, und öffnen Sie den Breitband-Lampenverschluss, um eine UV-Erregung der Probe zu ermöglichen. Drehen Sie dann den Intensitätsknopf in die gewünschte Position, um die Intensität der Breitband-Lampenerregung zu steuern.
Klicken Sie auf Maßstabsleiste anzeigen/ausblenden, um dem optischen Mikroskopiebild des Kristalls mit hellem Feld eine Maßstabsleiste hinzuzufügen und ein Bild des Kristalls unter UV-Voll- oder eingeschränkter Beleuchtung zu beobachten. Um zwischen der eingeschränkten Beleuchtung oder einer Breitenfeldbeleuchtung zu wählen, verwenden Sie den Stick und die Knöpfe, um die Größe der UV-Lampenfeldöffnung anzupassen. Wählen Sie unter der Registerkarte SpectraPro SP 2300 eine Wellenlänge aus, um die Probenemission zu beobachten und die Belichtungszeit des Detektors anzupassen.
Um den hyperspektralen Cube im Sequenzer abzuerhalten, klicken Sie auf Plus, um einen neuen Knoten hinzuzufügen, und klicken Sie auf Konfokales Imager. Klicken Sie auf Multi-Spectrum Acquisition und geben Sie die gewünschte X- und Y-Positionsanzahl sowie die gewünschte Schrittgröße ein. Wählen Sie die Hardwareoption für die Kamerasynchronisierung und für die sichtbare Emissionszuordnung aus, und klicken Sie auf "Okay".
Klicken Sie im Sequenzer auf die neu hinzugefügte Multispektrum-Erfassungslinie, um den Knoten hervorzuheben, und klicken Sie auf Wiedergabe, um den ausgewählten Knoten auszuführen. Wählen Sie für die Analyse der erfassten hyperspektralen Bildgebungsdaten, z. B. für eine spektrale Verteilung eines Bildes, im Menü Verarbeitung Daten und Zuschneiden und Biegen aus, um das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes zu erhöhen. Für ein Emissionsintensitätsprofil klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Cubebild und wählen X-Profil erstellen für die Analyse einer Linie.
Ziehen Sie das Ziehen, um den Bereich auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Interessenbereich. So wählen Sie Hinzufügen zu Diagramm aus. Um die Emissionsintensität in Abhängigkeit von der physikalischen Position des Ziels anzuzeigen.
Das Intensitätsprofil wird im neuen Diagramm angezeigt. Um ein Emissionsspektrum eines bestimmten Bereichs der Stichprobe zu erhalten, bewegen Sie den Mauszeiger über das Cubebild, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und klicken Sie auf Rechteckauswahl. Ziehen und klicken Sie, um das Auswahl-Shape über den gewünschten Bereich zu zeichnen.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Interessenbereich und wählen Sie Auswahl zu Diagramm hinzufügen aus. Wählen Sie im Fenster Zum Diagramm hinzufügen die Option Neues Diagramm erstellen aus, um die Emissionsspektren des Ziels anzuzeigen, und klicken Sie auf "Okay". Speichern Sie dann das erworbene Spektrum, bevor Sie eine neue Region auswählen.
Hier wird ein helles Feldbild eines Kristalls gezeigt, das nach dem Einstellen der Probe im richtigen Fokus aufgenommen wurde. Die nadelartige Morphologie des Kristalls kann deutlich beobachtet werden. Hier können Bilder desselben Kristalls unter UV-Erregung mit voller Oder lokal begrenzter Beleuchtung beobachtet werden.
Die eingeschränkte Beleuchtung kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Energie oder Lichtübertragung innerhalb des Kristalls zu untersuchen, die wellenführungsartiges Verhalten auslösen können. In diesem Bild wird beispielsweise eine starke Emission an einem Punkt festgestellt, der nicht direkt unter Anregung steht, was darauf hindeutet, dass eine effiziente Energiemigration durch den Kristall stattfindet. Aus dem erworbenen hyperspektralen Würfel ist es auch möglich, die Spektralverteilung in Form eines Bildes zu erhalten, das eine bestimmte Wellenlänge darstellt.
Das Intensitätsprofil einer bestimmten Emissionswellenlänge und die Emissionsspektren an jedem Pixel oder Bereich des erworbenen hyperspektralen Würfels. Beispielsweise zeigen die Emissionsspektren für diese Analyse die charakteristischsten Emissionsbänder des Europiums. Darüber hinaus weist das räumliche Profil entlang der verschiedenen Kristallflächen auf eine hellere Emission an der Spitze und an den Seitenflächen hin und kann mit den Lanthanid/Lanthanid-Ionenabständen in den drei räumlichen Richtungen korreliert werden.
Um ein gutes Signal in einer angemessenen Aufnahmezeit des hyperspektralen Würfels zu erhalten, ist es wichtig, die Mikroskopkonfigurationen, den Fokus und die Belichtungszeit des Detektors anzupassen. Emissionen UV-Erregung und sichtbare Emission, kann diese Technik mit Nah-Infrarot-Erregung und Nahinfrarot-Emissionserkennung durchgeführt werden. Dies ermöglicht es, für eine große Auswahl an leuchtmfenden Materialien anwendbar zu sein.
Die Korrelation optischer Signale mit einer Reihe abhängiger Merkmale macht diese Technik für die Untersuchung von Struktur-/Eigenschaftsbeziehungen, einschließlich der In-vitro-Bewertung von Nano-Bio-Wechselwirkungen, sehr interessant.
