This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

1. Molekülkonstrukt und Erdnuss-Transformation <ol><li> Kombinieren DNA-Fragmente von fünf A. flavus Gene AFL2G_07223 (AFLs oder aflJ), AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (PES1) und AFL2G_05027 (Aflatoxin Effluxpumpe, aflep). Verwenden Sie hierzu die folgenden Primer und ultramers: DIR-1, Kurz Dir1-R, DIR-2-invertiert, Kurz Dir2-R, DirAll-Nco-Rv und DirAll-Bameco-Fw, Tabelle 1. <ol><li> Machen DIR-1-Doppelstrang durch die 5 PCR-Zyklen (25 &amp; mgr; l Reaktion, 95 ° C 2 min, gefolgt von 5 Zyklen bei 94 ° C 45 sec, 55 ° C 30 sec, 68 ° C 15 s) unter Verwendung von DNA-Polymerase nach Hersteller Anweisungen und Primer Kurz Dir1-R, um einen 3&#39;-Überhang CCCGT zu verlassen. Wiederholen Sie diese Schritte, um DIR-2-invertierten Doppelstrang bilden unter Verwendung von Primer Kurz Dir2-R, um einen 3&#39;-Überhang ACGGG komplementär zu DIR-1 zu verlassen. </li><li> Ligieren der beiden 199 bp Fragments mit T4 DNA Ligase nach Herstellerangaben. PCR-Amplifikation des resultierenden 393 bp-Fragment, wie in 1.1.1 unter Verwendung von Primern DirAll-CACC-Fw und DirAll-Nco-Rv (Tabelle 1) angegeben ist, und zu klonen, um ein Produkt mit Standardtechniken in pENTR1A Plasmid p2 + 4ENTR zu machen. </li><li> Rekombinieren p2 + 4ENTR in pCAPD 29 (NCBI Zugangs: KC176455.1) mit LR Clonase II Enzymmischung gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Plasmid p5XCAPD zu machen, und verwandeln es in Escherichia coli DH5a Verwendung von Standardtechniken, gefolgt von partieller Sequenzierung. Hinweis: Der komplette RNAi Einsatz ist in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol></li><li> Transform Agrobacterium-Stamm C58C1 30 mit Plasmid p5XCAPD wie bereits berichtet 30, und verwenden Sie die resultierende Bakterium Erdnuss-Pflanzen zu transformieren, wie folgt: <ol><li> Wachsen bei 30 ° C das Agrobacterium p5XCAPD verwenden dafür, 50 ml LB-Brühe, ergänzt mit 500&amp; mgr; g ml -1 Streptomycin, 25 &amp; mgr; g ml -1 Gentamicin, 10 &amp; mgr; g ml -1 Kanamycin, und schütteln Sie die Kultur bei 250 Upm bis zur 1 OD 260. </li><li> Ernten Sie die Agrobacterium Zellen durch Zentrifugation (6000 × g) für 10 Minuten, Resuspendieren in 50 ml AB-Minimalmedium 31 mit 100 uM Acetosyringon 1 h, und in der Bakteriensuspension die Explantate von 10 bis 14 Tage alte Keimlinge Exp27-1516, Läufer -Typ Erdnusszuchtlinie. Trocken tupfen die Explantate auf 3MM Löschpapier nach 30 Minuten, und legen sie auf shoot-Induktionsmedium (SIM) [MS-Salz 32, 3% Saccharose, 20 uM Benzylaminopurin (BAP), 10 &amp; mgr; M Thidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3 % Gellangummi] ohne Antibiotika im Dunkeln drei Tage. </li><li> Haben Gewebeauswahl und die Regeneration nach wie vor 33 gemeldet. Bewegen Sie Gewebe für Triebbildung für 2 Monate SIM (500 &amp; mgr; M Cefotaxim und 100 &amp; mgr; M Kanamycin), mit zweiwöchentlichen Transfers. Dann legenAusbau Triebe auf Schießen Dehnung Medium (SEM) [5 uM BAP, 1 uM Gibberellinsäure (GA 3)], alle zwei Wochen für mehrere Monate. </li><li> Zeigen einzelne Triebe, 2 cm in der Größe, in Wurzelinduktionsmedium (RIM) [1/2 MS, 1,5% Saccharose, 5 &amp; mgr; M α-Naphthalin-Essigsäure (NAA), 2,5 um Indol-Buttersäure (IBA)], dann akklimatisieren die Sämlinge und sie auf dem Gewächshaus. </li></ol></li></ol> 2. Identifizierung der Erdnuss Pflanzen beherbergen RNAi to Silence Aflatoxin Synthesegene <ol><li> Verwenden Werk Mini-Kit in einem Roboter-Arbeitsstation mit 200 ul Elutionspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers, um DNA aus jungen Blättern von Erdnusspflanzen, die dem Prozess der Transformation waren extrahieren (wie zuvor beschrieben) mit RNAi-Konstrukt p5XCAPD (Abbildung 1), die als Grundgerüst Plasmid pCAPD 29 für Gen-Silencing. </li><li> Bildschirm des DNA-Proben von Einrohr-nested PCR (STN-PCR), wie beschrieben Previlaufend 34, um den selektierbaren Marker NPTII erkennen und die RNAi-Insert aus p5XCAPD. Klonal fortpflanzen von Kürzungen (3-4 Knoten) PCR-positive Pflanzen, genügend Saatgut für Tests in dieser ersten Generation herzustellen. <ol><li> Verwenden vier 2-fache Verdünnungen von DNA (50-100 ng ul -1 vor der Verdünnung) in allen STN-PCR-Reaktionen. Für NPTII, externe Primer PCAPD 5714F: 5&#39;-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 &#39;und PCAPD 6446R: 5&#39;-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3&#39;, und interne Primer PCAPD 5730F: 5&#39;-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 &#39;und PCAPD 6249R: 5&#39;-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3&#39;. </li><li> Für den Nachweis von RNAi stecke in STN-PCR-Reaktionen externe Primer 35S-PDSFw: 5&#39;-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 &#39;und DirAll-Nco-Rv: 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3&#39;, und interne Primer Probe_5027_Fw: 5&#39;-gtatttgtgaccatgtttctg-3 &#39;und Probe_7228_Rv: 5&#39;-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3&#39;. </li></ol></li><li> Ernte-Erdnusshülsen von STN-PCR positiven Pflanzen und der con<html> trol Pflanzen unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Entscheidender Schritt: Stellen Sie sicher, dass die Kontrollpflanzen sind in den gleichen Bedingungen und der gleichen Jahreszeit wie die RNAi-Pflanzen angebaut. Wasserböe die Schoten mit einem Hochdruckreiniger bei geringer Intensität oder kratzen mit der Hand, um Exokarp indem die Hülsen auf einer Laufplatte und separater Schoten in Gruppen (gelb, orange, braun und schwarz) 35 (Bild entfernen, bestimmen die Farbe des Mesokarp 2). </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig2.jpg" /> Abbildung 2. Herstellung von Erdnusshülsen für die Analyse. Links: Verschiedene Erdnuss Größen bei der Ernte fand wie Erdnuss ist eine unbestimmte Wachstum Pflanze; Center: Platzieren Erdnüsse in Metallkorb für die Wasserdruck Entfernung von Exokarp; Rechts: Reifegruppen Mesokarp Farbe auf einer Erdnuss Profilplatte (gelb, orange, braun und schwarz).98fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. Versuchsaufbau <ol><li> Entfernen Sie die Rümpfe, Prozess gelben und braunen Samen getrennt. Berechnen Sie die Anzahl der Samen in dem Experiment gemäß Tabelle 2 zu verwenden. Beachten Sie, dass mindestens drei Samenstücke (1 Saatgut Stück = Halbkeimblatt) pro Erdnusslinie und Probenahmedatum ist erforderlich, um statistische Analysen durch und den Standardfehler zu reduzieren. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="33"><td height="33" style="height:33px;width:147px;"> Name </td><td colspan="3" style="width:421px;"> Sequenz </td></tr><tr height="124"><td height="124" style="height:124px;"> DIR-1 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Kurz Dir1-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 &#39; </td></tr><tr height="126"><td height="126" style="height:126px;"> DIR-2-invertierten </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 &#39; </td></tr><tr height="29"><td height="29" style="height:29px;"> Kurz Dir2-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 &#39; </td></tr><tr height="30"><td height="30" style="height:30px;"> DirAll-CACC-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-Nco-Rv </td><td colspan="3"> 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-Bameco-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="197"><td height="197" style="height:197px;"> Komplette RNAi Einsatz </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 &#39; </td&gt; </tr></tbody></table> . Tabelle 1 Oligonukleotide und ultramers verwendet, um die RNAi-Konstrukt p5XCAPD Phos bauen: phosphoryliert 5&#39;-Ende; &quot;/&quot; Trennt verwendet die fünf Genfragmente; Komplette RNAi Einsatz: 2-Sequenz als inverted repeats zur p5XCAPD bilden. <ol start="2"><li> Platzieren gesamte Erdnuss Samen in einer einzelnen Schicht, so dass sie den Boden einer sterilen Becher zu bedecken. Hinzufügen 75% Ethanol / Wasser (v / v) Lösung, um die Samen zu bedecken und dann das gleiche Volumen der gleichen Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Sekunden und dann mit sterilem, deionisiertem Wasser (SDW) zu spülen. </li><li> Mit 2% Natriumhypochlorit in das Becherglas, welches den Ethanol behandelten Samen wie folgt: Add genug 2% Natriumhypochloritlösung, um die Samen zu bedecken, dann das gleiche Volumen der gleichen Lösung und Inkubation für 5 min. Entscheidender Schritt: mit einem Volumen von SDW entspricht Gründlich dreimal 5-fache des Volumens des Hypochlorit verwendet (Abbildung 3). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig3.jpg" /> Abbildung 3. Versuchsaufbau. Top: Oberflächensterilisation von Erdnusskernen vor und nach Hypochlorit, Entfernung der Samenschale (Testa); Mitte: Entfernung von Embryo und nahe Ansicht der Embryo, dann schneiden Keimblatt in der Mitte; unten: halbe Keimblätter in sterilem destilliertem Wasser, Lösch auf sterile saugfähigen Papier, Druckstellen auf Wasser-Agar, und Platzieren von Halbkeimblätter (Schnittseite nach oben) auf der Agar-Oberfläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> Lassen Sie die Oberflächen-sterilisierten Samen in SDW für 2 Stunden unter Wasser aufsaugen. Legen Sie die Samen auf eine sterile Petrischale, entfernen Sie die Samenschalen mit einer Pinzette, trennen Sie die Keimblättern und mit einem Skalpell entfernen Sie die Embryonen. Hinweis:Embryonen können verworfen oder verwendet werden, um neue Pflanzen zu regenerieren. </li><li> Schneiden Sie die einzelnen Keimblatt in der Mitte mit einem Skalpell. Um Austrocknung zu vermeiden, halten Sie die Schnittsamenstücke in sterilem Wasser, bis alle Samen verarbeitet werden. </li><li> Haben vorbereitet Petrischalen mit sterilem Wasser-Agar (1,5% Agar / Wasser; w / v), eine für jeweils drei Samenstücke. Machen Sie kleine Dellen im Agar mit einer Pinzette, kurz tupfen Sie das überschüssige Wasser von Saatgut Stücke auf sterile Papierhandtücher, und legen Sie dann die Samenstücken (Schnittfläche nach oben) auf den Wasser / Agar-Platten. </li><li> Aus einer frischen Kultur von Aspergillus flavus aflatoxigenic NRRL 3357 in Czapeks Agarmedium bei 25 ° C für 10 Tage gezüchtet, Eine Suspension von 50.000 Sporen pro ul SDW mit einem Hämocytometer gezählt. </li><li> Legen Sie 2 ul der Sporensuspension auf den Schnittflächen jedes Halbkeimblattstück vermeiden Abfluss an den Seiten, um sicherzustellen, dass die Sporen gehen auf das Samengewebe, die RNAi (Abbildung 4) birgt ausgesetzt. </li&gt; </ol><img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig4.jpg" /> Abbildung 4. Inokulation und Inkubation für Aflatoxin-Analyse. Top: Halbkeimblatt, Inokulation mit Sporensuspension und Aspergillus flavus Mycelwachstum Halb cotyledon nach 24-stündiger Inkubation Unten: links:. Inkubation von 48 h auf 1,5% Agar; Zentrum: Inkubation für 72 Stunden auf 1,5% Agar; rechts:. Beispiel falsche Versuchsaufbau, Inkubation für 72 Stunden auf 0,5% Agar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="9"><li> Die Petrischalen geimpft, und nicht-inokulierte Halb Kotyledonen Inkubieren bei 30 ° C im Dunkeln bis zur Probenahme. </li></ol> 4. Probenahme für die Analyse auf Aflatoxine und Genexpression <ol><li> Proben werden indreifach an den 24, 48 und 72 Stunden (optional 96 hr) Inkubation, sowohl für die RT-PCR und Analysen auf Aflatoxine, jede Wiederholung als ein Stück (Hälfte Keimblatt). Wählen Sie Stichproben aus verschiedenen Platten an jedem Probenahmetermin. Verwendung eines Gewebes, Agar und überschüssige Pilzsporen leise, bevor Samenstücke in Fläschchen oder Röhrchen entfernen. </li><li> Für die Analyse auf Aflatoxine, platzieren Sie jede Wiederholung (ein Stück) in einer 4-ml-Glas Schraubverschluss Fläschchen und bei -80 ° C. Hinweis: Aufgrund der chemischen Stabilität von Aflatoxinen, Proben können in diesem Zustand für mehrere Monate (in den aktuellen Experimenten in der Regel 1-2 Monate) gelagert werden. </li><li> Für RT-PCR Ort jedes Replikat (ein Stück) in bereits vorbereitete 2 ml Schleif Röhrchen mit zwei Edelstahlkügelchen (2,5 mm Durchmesser) und drei Zirkoniumkügelchen (2 mm Durchmesser). </li><li> Sofort einzufrieren (vorzugsweise in flüssigem Stickstoff) aller Proben und halten sie bei -80 ° C bis zur Verarbeitung. </li></ol> 5. Aflatoxin Analyse einzelner Halb Cotyledon Stück <ol><li> Verwenden Sie die A. flavus beimpften Proben für diese Analyse. Bringen Proben auf Raumtemperatur für etwa 30 Minuten, fügen Sie vier Bänden (in der Regel 2-3 ml; w / v) Methanol (halten Eintrag zur späteren Berechnungen), schließen Sie die Kappen, und Inkubation O / N (~ 16 Stunden) in der dunkel ohne Rühren. </li><li> Legen Sie eine Fritte in einen passenden 1,5 ml Propylenminisäule, 200 mg Grund Al 2 O 3 und die Kappe mit einem anderen Fritte wie zuvor 36 beschrieben; Dann setzen Sie ein Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) Autosamplergefäß unter der Spalte nahe genug, um mögliche Verdampfung des Eluats zu vermeiden. </li><li> In einer Einwegglasteströhrchen (keine Kunststoff), legen Sie 0,5 ml der in Schritt 4.1 erhaltene Methanolextrakt, 0,5 ml Acetonitril, mischen mit einer Pipette und gelten 0,5 ml der Mischung in die in Schritt 4.2 vorbereitet Spalte. Erlauben Elution in die Autosamplergefäß durch die Schwerkraft (nicht Druck ausüben). Elution dauert in der Regel 2-4 min, in der Nähe the Ampulle sofort mit einem UPLC kompatibel Kappe mit Septum. Die Durchstechflaschen bei Raumtemperatur und noch am selben Tag zu analysieren auf einer UPLC. </li><li> Zur Trennung von Aflatoxinen, Ort, Autosampler-Fläschchen, die Probe Eluate und Autosampler-Fläschchen mit Aflatoxin-Standards (B 1 und B 2 bei Verwendung von A. flavus) in einem UPLC Instrument mit einem passenden UPLC Quartär Solvent Manager, UPLC Probenmanager, UPLC Fluorescent-Detektor ausgestattet, und ein C 18 2,1 mm x 50 mm, 1,7 &amp; mgr; m-Säule. <ol><li> Verwenden einer isokratischen mobilen Phase aus Wasser / MeOH / CH 3 CN (64:23:13, v / v / v) Mischung besteht, bei einer Fließrate von 0,30 ml min -1. Erhalten Chromatogramme Sicherstellung einer stabilisierten Basislinientrennung für die genaue Berechnung der Aflatoxin-Konzentration nach Herstellerangaben 37. </li><li> Bestätigen die Identität von Aflatoxin durch den Erhalt ihrer massenspektralen Daten und deren Vergleich mit den veröffentlichten Daten 38. Verwenden Sie ein iam Fallenmassenspektrometer mit einer ESI-Schnittstelle und entsprechender Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgestattet. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie Konzentrationen von Aflatoxinen durch Bezugnahme auf Eichkurven durch die Injektion von verschiedenen Mengen von entsprechenden kommerziellen Standards der Aflatoxine B 1, B 2 erhalten, G 1 und G 2 wie von der UPLC Hersteller vorgeschlagenen und von der Software 37 bestimmt. </li><li> Platz Samenstücke bereits mit Methanol für O / N (~ 16 Stunden) Gefriertrocknung gewonnen, in Einzelglasfläschchen, um ihre Trockengewicht zu bestimmen. Dann berechnen Aflatoxin-Konzentration in ng. G -1 Trockengewicht von Saatgut Stück. </li><li> Für die Analyse der Daten, wandeln Aflatoxin Ergebnisse zur Anmeldung (ng. G -1 +1), gefolgt von Tukey-Test für Mittel Vergleiche. </li></ol> 6. Gene Expression, RT-PCR-Verarbeitung von Proben <ol><li> Nehmen Sie die 2 ml Schleif Röhrchen enthaltening Proben aus dem -80 ° C Gefrierschrank und unmittelbar (ohne Auftauen) schleifen sie in einer Perlmühle Homogenisator bei 3.100 Upm für 40 sec, dann auf die RNA-Extraktion mit Trizol verfahren nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Vorbereitung cDNA aus jeder Probe unter Verwendung von 1 ug RNA und gleiche Mengen von Oligo dT und zufälligen Hexameren, stellen eine 1: 8-Verdünnung der cDNA und verwenden 2 ul pro Reaktion in RT-PCR (wie zuvor beschrieben, 39). <ol><li> Zum Nachweis der Expression von RNAi INSERT Primer: RT_5X_1_105F: 5&#39;GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 &#39;, RT_5X_1_232R: 5&#39;-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3&#39;; und RT_5X_2_95F: 5&#39;-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 &#39;, RT_5X_2_229R: 5&#39;-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3&#39;. </li><li> Zum Nachweis der Expression des auswählbaren Marker NPTII, die Verwendung von Primern: RT_NPTII_1_6871F: 5&#39;-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 &#39;, RT_NPTII_1_7004R: 5&#39;-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3&#39;. Verwenden Sie das Housekeeping-Gen Actin zur Standardisierung und Primer: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. </li></ol></li><li> Analysieren Sie die Ergebnisse nach Delta-Delta-C-T-Verfahren 41 für Actin Expression standardisiert. Repräsentieren die Ergebnisse als Zunahme verglichen mit der Kontrolle. </li></ol>

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Pflanzenwirts RNAi-vermittelte Silencing von Genen in Pilzerreger wurde gezeigt, 27,43, jedoch gibt es keine Veröffentlichungen, die die Durchführbarkeit von RNAi-vermittelte Kontrolle Mykotoxin Anhäufung in Pflanzen. Ein begrenzender Faktor für diese Studien in Erdnuss war der Mangel an einer Methode, um eine nicht-Aflatoxin Akkumulation Phänotyp in einzelnen Anlagen zu bewerten, wie Blätter zeigen keine Symptome auf Pilzinfektion der U-Bahn-Schoten. Darüber hinaus wurden die nicht-normal verteilten Ansammlung von Aflatoxinen, und der Bedarf an großen Proben für die chemische Analyse 15,16 die Quantifizierung von möglichen RNAi Wirkung auf einer einzigen Anlage behindert. Die hier vorgestellte Methode besteht aus 72 Stunden Experimente mit fünf Samen zu drei 24-Stunden-Intervall Abtastungen in dreifacher Ausfertigung (Tabelle 1, Abbildung 7) durchzuführen. Vergleich zu den typischen Aflatoxinanalyse, die nicht weniger als 100 g Samen erfordert Unsere Methode ist besonders geeignet für individual transgenen Events Erdnusspflanzen, die anfangs produzieren nicht mehr als zwei oder drei Schoten. RNA-vermittelte Silencing von Aflatoxin-Synthese wurde von genetischen Transformation von Aspergillus flavus und A. nachgewiesen parasiticus. Seit AFLR ist ein Hauptregulator von Aflatoxin-Produktion in A. flavus und A. parasiticus 44,45, wird es ein interessantes Ziel für die RNA-vermittelte Silencing in Pflanzen. Allerdings haben genetische Variationen in AFLR unter Aspergillus-Arten 46 gezeigt, und diese genetischen Varianten konnten entkommen Schweigen, wenn es keine perfekte Sequenz pass mit der in der Wirtspflanze produziert RNAi-Signal. So war AFLR eines der Ziele für Silencing in vector p5XCAPD, war aber nicht die einzige. Invertierten Wiederholungen des AFLR Gens in A. eingeführt flavus und A. parasiticus durch Transformation führte zu Schweigen und minimale oder keine ProduktIonen von Aflatoxinen 47 (McDonald et al., 2005b). Außerdem verhindert Silencing ufld Gen Aflatoxin Produktion um bis zu 98% in A. flavus und A. parasiticus in direkte Transformation 48. Um die Erfolgswahrscheinlichkeit in unserem System zu erhöhen, wurde Erdnuss mit inverted repeat Fragmente von fünf Gene in Aflatoxin-Produktion in A. beteiligt transformiert flavus. Hier wird gezeigt, dass die Verwendung von p5XCAPD, die für mehrere Gene Silencing in der Aflatoxin-Synthese abzielt, 90% -100% geringere Gehalte an Aflatoxin B 1 und B 2 in Zeile 288 bis 72 erreicht, und 60-100% niedrigeren Ebenen im kumulierten Linie 288 bis 74 im Vergleich zur Kontrolle, wenn die Hälfte Keimblätter wurden mit A. impft flavus, die Figuren 4, 7. Am wichtigsten ist, detektiert dieses Verfahren statistisch signifikanten Unterschiede in Aflatoxin Akkumulation durch Leitungen 288-72, 288-74 gegenüber der Kontrolle während des gesamten Experiments durch Anlegen para STATISTMTics, 7. Angesichts der geringen Stichprobengröße, ist es wichtig, die Notwendigkeit für die Verwendung eines leistungsfähige Methode, um Aflatoxine wurden diese Experimente von UPLC, die eine hohe Auflösung, fünffach höhere Leistung und drei Mal höhere Empfindlichkeit als hat analysiert erkennen markieren HPLC 49. Die Expression des RNAi Einsatz in 288-74 wurde erst im unreifen Keimblätter (gelb) bei 24-stündiger Inkubation nachgewiesen. Die RNAi Einsatz wurde durch RT-PCR auf reifen Keimblätter von 288 bis 74 bei 24 Stunden festgestellt wird, oder auf einem Laufzeit-Gruppe an 48 Stunden, 6. Das gleiche Phänomen wurde in anderen RNAi transgenen Erdnusslinien beobachtet (Arias, RS 2015 unveröffentlicht), wo in der Regel RNAi-Transkripte wurden nur von unreifen Keimblätter bei 24 Stunden nachgewiesen. RNA-Proben wurden mit DNAse vor der cDNA-Synthese behandelt wurden Daten, normiert auf die Ebene der Actin-Expression und keine Hinweise auf eine DNA-Kontamination wurde beobachtet. Sollten DNA in den Proben vorhanden ist, sollte eswurden in den 48 Stunden Proben nachgewiesen wurden als gut, aber konsequent das war nicht der Fall. Expression unter der Kontrolle des 35S-Promotors nicht immer gleichmäßig ist; sie kann durch Umgebungsbedingungen 50, Art des Gewebes und des Entwicklungsstadiums 51,52 betroffen sein. Zur gleichen Zeit, in der Bahn der RNA-Interferenz, die Rate der mRNA-Zerfall und die Rate der siRNA Zerfall deutlich 53 variieren. Es ist möglich, dass der rasche Abbau der mRNA durch den Mechanismus der RNA-Interferenz kann mRNA-Detektion bei 48-stündiger Inkubation verhindert. Ob Abwesenheit der Expression in 48 Stunden wegen der niedrigen 35S-Promotor angetrieben Transkription war, oder um schnelle Verschlechterung der dsRNA durch Dicer bleibt zu beantworten. So Erkennung von kleinen RNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung einen besseren Einblick auf die Prozesse durch RNAi 54 stattfinden würde in diesen Experimenten. Da RNA silencing breitet systemisch, insbesondere über das Phloem von photosynthasse Quellen sinkt Saccharose (in diesem Fall Erdnusssamen) 55, das Silencing von Aflatoxin-Synthese kann in Saatgut ohne lokale Expression des RNAi Einsatz kommen. Viel Forschung bleibt noch zu tun, um den Schwellenwert von small interfering RNAs (siRNAs) notwendig, Aflatoxin Ansammlung im Samen zu verhindern, zu ermitteln. Es ist wichtig, die Tatsache, dass sowohl die mRNA-Expression der RNAi-Konstrukt (Abbildung 6) zu unterstreichen, und die Ansammlung von Aflatoxin B 1 und B 2 (Figur 7) zeigten unterschiedliche Ergebnisse für unreife (gelb) vs. reife (braun) Keimblätter. Peanut Pflanzen haben unbestimmte Wachstum, das heißt, bei der Ernte eine Reihe von Reife Schoten, 2 präsentieren sie. Darüber hinaus Körner verschiedener Reifegruppen unterscheiden sich in ihrer chemischen Zusammensetzung, z. B. 2,4% Saccharose in unreifen Samen, und 1,9% reifen Samen unter dem gleichen Feldbedingungen 56,57. Um somit den tatsächlichen efficienc versteheny der RNA-vermittelten Kontrolle von Aflatoxin Akkumulation, ist es wichtig, bis zur Endfälligkeit zu Gruppen getrennt zu analysieren. Eine natürliche Abwehr von Erdnusskernen ist die Herstellung von Phytoalexine, die in der Vielfalt der Verbindungen hergestellt und ihre relativen Mengen je nach Laufzeit der Samen und Umweltbedingungen 58-61 variiert, und es ist in Embryonen besonders höher im Vergleich zu 62 Keimblätter. Embryos haben auch deutlich höhere Konzentrationen von Nukleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, als die Keimblätter (Arias RS, nicht veröffentlicht). Wie Erdnuss Samen reifen, Veränderungen in ihrer Physiologie und chemische Zusammensetzung auftreten 63. Phenolischen Antioxidantien in Erdnuss testa Form kondensierte Tannine mit fungistatische Aktivität 64; Dies zeigt sich auch in der Mesokarp Farbe, die Reifestadien, gelb bis schwarz 35 reflektiert, wie der Gehalt an Tanninen und phenolische Verbindungen mit einer Laufzeit 65 erhöht. Somit Gegenwart tESTA und Embryonen im Versuch aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften konnten Pilzwachstum begrenzt sind und daher überschätzt die Wirkung von RNAi silencing daher wurden sie entfernt. Auch die Entfernung der Samenschale und Embryonen hilft den Quellen der Variation in der Analyse zu begrenzen, als die Hälfte Keimblatt, die der Embryo mehr Phytoalexine und RNA-Gehalt haben, trägt. Zusätzlich zu der Analyse durch Reife Gruppen und die Entfernung der Samenschale und Embryo in diesen Experimenten ist es wichtig, darauf hinzuweisen, einige Bemerkungen: a) wenn Ergebnisse sind bis zu 96 h Inkubation zeigt, ist es ratsam, nicht mehr als 72 verwenden, hr, um konsistente Ergebnisse zu erhalten, wie Samen bekommen von 96 Stunden abgebaut; und b) der Erwägung, dass die Hälfte Keimblätter aus dem gleichen Samen, wenn auch zufällig abgetastet werden, nicht vollkommen unabhängige Stichproben darstellen, RT-PCR und Aflatoxin Akkumulation im transgenen Ereignisse zeigten minimale Unterschiede zwischen den Samen. Auch eine genaue Pilzsporen zählen, Inokulum Volumens von 2 &amp; mgr; l, und die Anwendung von Sporen an der Schnittfläche der Cotyledonen Vermeidung tropft auf den Seiten sind wichtig, um sicherzustellen, dass die gekeimten Sporen werden dem Pflanzengewebe freigelegt. Das Wasser / Agar auf den Platten sollte in 1.5% (w / v), bewirkt weichere Agar Abfluss von Sporen wie im letzten Bild von Figur 4 (unten) gezeigt ist. , Sollte die Verfügbarkeit von einem bestimmten Ereignis transgene Saatgut beschränkt ist, kann die Probenahme in doppelter Ausführung statt dreifacher Ausfertigung zu erhalten ähnliche Ergebnisse (dh 7) durchgeführt werden jedoch wird dreifachen Proben helfen, den Standardfehler zu reduzieren. Die einzige Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es ein hochempfindliches System (UPLC) Aflatoxin Erkennung / Quantifizierung erfordert, aber gleichzeitig verringert dies die Wahrscheinlichkeit einer Überschätzung der Wirkung von RNAi sollte Aflatoxine nicht weniger empfindlichen Verfahren nachgewiesen werden. Abschließend bietet diese Methode zum ersten Mal einen zuverlässigen Ansatz für die UntersuchungWirkung von RNAi bei der Kontrolle von Aflatoxinen. Reduzierung der Zeit für ein Experiment von einer gesamten Anbausaison um weniger als eine Woche, wird diese Methode enorm beschleunigen die Forschung über RNAi-Erdnuss / Aspergillus Pathosystem in Richtung der Abschwächung und / oder Beseitigung von Aflatoxinen.

Etwa 4,5 Milliarden Menschen sind chronisch zu Aflatoxinen 1, der stärksten Karzinogene in der Natur 2 bekannte ausgesetzt. Diese Mykotoxine kontaminiert 25% der Nahrungsmittelgetreide in der Welt 3, einschließlich Mais, Maniok, Reis, Nüsse, Getreide und Gewürze. 4. Aflatoxine Ursache Wachstumsstörungen bei Kindern 5, beeinträchtigt das Immunsystem 6, sind in 58% der Leberzellkarzinome-Gegenwart in der menschlichen Biopsien 7,8, und töten Hunderte von Menschen während der periodischen Ausbrüche von Aflatoxikose 9,10. Aflatoxine sind Polyketid-abgeleiteten Mykotoxine in der Regel durch Aspergillus flavus und A. hergestellt parasiticus; Aflatoxin B 1 und B 2 werden durch A. hergestellten flavus, während A. parasiticus produziert auch G 1 und G 2. Die chemische Struktur dieser Verbindungen und ein Chromatogramm, das die Trennung von UPLC sind in Abbildung 1 dargestellt. </strong&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Abbildung 1. Aflatoxine und RNAi einfügen Top:. Chemische Struktur (links) und Beispiel-Chromatogramm (rechts) der vier häufigsten Polyketid-abgeleiteten Aflatoxine: B 1, B 2, G 1 und G 2, die von Aspergillus parasiticus, A hergestellt . flavus produziert B 1 und B 2 unten: Schematische Darstellung der Genfragmente in der RNAi-Konstrukt p5XCAPD Erdnuss Transformation verwendeten Zahlen unter Pfeile sind Gen-Fragment-Zugangsnummern in der Aspergillus flavus Genoms;. PIV2: Kartoffel Intron; bp: Basenpaare; RT_5X_1 und RT_5X_2:. Real-Time-PCR-Primer-Sites <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die volkswirtschaftlichen Schäden bei den Exporten aufgrund von Aflatoxinen in Erdnüssen allein überschreiten $ 450 Millionen US-Dollar, wenn auf der Grundlage des 4 ng. G -1 Limit von Aflatoxin für den menschlichen Verzehr in der Europäischen Union 11 erlaubt. Aflatoxine sind seit 60 Jahren 12 bekannt; aber wenn viele landwirtschaftliche Methoden wurden entwickelt, um ihre Wirkung, einschließlich der Anwendung von anderen Pilzstämme 13,14 mildern, keine einheitliche Methode der Steuerung vorhanden ist, und resistente Pflanzensorten nicht verfügbar sind. Testing Pflanzenkeimplasma für die Resistenz gegen Aflatoxine ist besonders schwierig, weil auch unter förderlichen Bedingungen für Erreger Invasion ist Mykotoxin Akkumulation unberechenbar und nicht einer Normalverteilung folgen. So Versuche erfordern in der Regel große Pflanzflächen, Hunderte von Samen und mehrere Proben von 100-1,700 g, um die Variabilität der Daten 15,16 reduzieren. RNA-Interferenz warentdeckte im Jahr 1998 17; und die Vorteile der &quot;Silencing&quot; werden derzeit in einer Reihe von neuen Anwendungen, beispielsweise erforscht., in der menschlichen Therapien gegen metastasierendem Brustkrebs 18, Leberkrebs 19, myeloische Leukämie 20 und im Pflanzenschutz gegen Insekten und Nematoden 22 21. In Pflanzen können RNA-Interferenz-Signale von Zelle zu Zelle zu reisen, mit small interfering RNA (siRNA) und hohe Gewichts RNA Molekular wobei für die systemische posttranskriptioneller Gen-Silencing 23,24, auch im Inneren Pilzerreger, die in engem Kontakt mit der Wirtspflanze 25 verantwortlich sind. Die Wirksamkeit der RNAi für Pflanzen-vermittelte Silencing pilzlicher-Pathogen-Genen wurde in wenigen Pflanzen Pathosystemen beschrieben wurde, für diese, visuelle Untersuchung der Symptome in der oberirdischen Teile der Pflanzen (Blätter) erlaubt Krankheit Quantifizierung, dh, Oomyceten Bremia in Kopfsalat 26 Puccinia in Weizen <sup&gt; 27 und Fusarium in Bananen 28. Viel schwieriger ist es, RNAi Wirksamkeit zu Mykotoxinen in Pflanzen, insbesondere Aflatoxinen in Erdnüssen steuern zu bewerten, wie die Blätter zeigen keine Symptome der Infektion, sind die Organe eingedrungen (Samen) unter mehreren Zoll Erde, ist das Auftreten von Infektionen unberechenbar und nur chemische Analyse kann das Vorhandensein von Aflatoxinen zu bestimmen. Darüber hinaus erhält jedes transgene Ereignis in Erdnuss produziert normalerweise wenige Samen (4-6 pro Pflanze); daher traditionellen Tests für eine no-Aflatoxin Akkumulation Merkmal in großen Feldparzellen, dauerhafte gesamte Anbau Jahreszeiten und mit Hunderten von Samen ist nicht machbar. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um in weniger als einer Woche analysiert RNAi Erdnusskerne zum Vorhandensein Transgen und für eine nicht-Aflatoxin Akkumulation Merkmal, mit nur wenig Samen.

<table><tbody><tr><td>Primers, oligonucleotides</td><td>DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Czapek Dox agar medium</td><td>Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>CM0095</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>BP 1423</td><td></td></tr><tr><td>Freezer -80&amp;nbsp;&amp;deg;C</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Oxide, Al&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>SPE Reservoirs 1.5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>Frits for 1.5 ml SPE reservoir</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>211401</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler vials</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td>186005221</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1&amp;nbsp;mm x 50&amp;nbsp;mm, 1.7&amp;nbsp;mm column</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td><td>Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin standards, B&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;, B&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, G&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and G&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A6636; A9887; A0138; A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 Real-Time PCR</td><td>Lifetechnologies, Grand Island, NY</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube robot workstation</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td><td>Goldbio, St. Louis, MO</td><td>cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

Die Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen schätzen, dass 25% der Nahrungsmittelgetreide in der Welt sind mit Aflatoxinen kontaminiert. Das entspricht 100 Millionen Tonnen Lebensmittel vernichtet oder nicht-menschlichen Verzehr pro Jahr umgeleitet. Aflatoxine sind leistungsfähige Karzinogene normalerweise durch die Pilze Aspergillus flavus und A. parasiticus Getreide, Nüsse, Hackfrüchte und andere landwirtschaftliche Erzeugnisse angesammelt. Silencing von fünf Aflatoxin-Synthesegene durch RNA-Interferenz (RNAi) in Erdnusspflanzen wurde verwendet, um Aflatoxin Kumulkontrolle nach der Inokulation mit A. flavus. Bisher gab es keine Methode, um die Wirksamkeit der RNAi in einzelnen Erdnuss transgenen Ereignisse zu analysieren, da diese in der Regel produzieren paar Samen und traditionellen Methoden der großen Feldversuchen unter Aflatoxin-förderlichen Bedingungen wurden keine Option. In diesem Bereich, ist die Wahrscheinlichkeit, natürlich kontaminierten Samen oft 1/100 bis 1/1,000. Zusätzlich wird Aflatoxinverteilung nicht gleichmäßig verteilt. Unsere Methode verwendet paar Samen pro transgenes Event, mit kleinen Stücken für Echtzeit-PCR (RT-PCR) verarbeitet oder kleine RNA-Sequenzierung und für die Analyse von Aflatoxin Akkumulation durch ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC). RNAi-exprimierenden Erdnusslinien 288-72 und 288-74, zeigten bis zu 100% Reduktion (p ≤ 0,01) in Aflatoxin B 1 und B 2 im Vergleich zur Kontrolle, die bis zu 14.000 ng angesammelt. G -1 von Aflatoxin B 1, wenn mit aflatoxigenic A. impft flavus. Als Referenz, die insgesamt maximal zulässige Aflatoxine für den menschlichen Verzehr in den Vereinigten Staaten ist 20 ng. G -1. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von RNAi-vermittelten Kontrolle von Aflatoxinen in transgenen Erdnusssamen und Verfahren zu ihrer Auswertung. Wir glauben, dass ihre Anwendung in der Zucht von Erdnuss und andere Feldfrüchte werden rasche Fortschritte in diesem wichtigen Bereich der Wissenschaft zu bringen, Der Medizin und der menschlichen Ernährung und wird wesentlich zur internationalen Bemühungen, Aflatoxine und möglicherweise anderen Mykotoxinen in wichtigen Nahrungspflanzen zu kontrollieren beizutragen.

Plasmid p5XCAPD wurde als ein Derivat von pCAPD 29 gemacht, und benutzte es, um Erdnuss-Pflanzen zu transformieren; Dieser Vektor trägt inverted repeats von fünf kleine Fragmente, die jeweils 70-80 bp, von Aflatoxin-Synthesegene von A. flavus durch ein Intron (Figur 1) getrennt. Fragmente AFL2G_07224 (AFLR) AFL2G_07223 (AFLs oder aflJ) AFL2G_05027 (Aflatoxin Effluxpumpe aflep) AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1) und AFL2G_07731 (PES1) wurden für das Konstrukt Zahlen auf Figur 1 entsprechen A, . flavus Genomannotation in Broad Institute, Cambridge, MA, und der Literatur 42. Eine Gesamtzahl von 99 Erdnuss-Linien wurden, nachdem sie durch den Transformationsprozess regeneriert, 50 waren PCR positiv für NPTII von STN-PCR nachgewiesen, und 33 Linien waren PCR-positiv und produziert Samen. Nur sieben PCR-positiven Linien wurden klonal vermehrt und durch die Präsentation getestett Verfahren für Aflatoxin Akkumulation, alle sieben zeigte zwischen 60% und 100% weniger Aflatoxin Akkumulation als die Kontrolle. Hier zeigen wir Ergebnisse von zwei dieser sieben Zeilen. So individuell transgenen Events zu produzieren in der Regel wenige Samen, wurde eine Methode entwickelt, um eine minimale Anzahl von Samen, während noch in der Lage, parametrischen statistischen Analyse zu tun zu verwenden. Ein Flussdiagramm der Probenvorbereitung und Versuchsaufbau ist in Figur 5 und Tabelle 1 gezeigt. Obwohl die erste Generation der transgenen Samen typischerweise hemizygot, es erwartet wird, dass die Zelle zu Zelle und systemischen Bewegung small interfering RNA (siRNA) erzeugten durch RNA-Interferenz sollte Aflatoxin-Synthese Silencing verleihen der gesamten Anlage. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Abbildung 5. Schematische Ablaufdiagramm des Verfahrens zur Wirksamkeit der RNAi in Schweigen zu analysieren </strong&gt; Aspergillus Aflatoxin-Synthesegene in Erdnusskerne. Grafische Darstellung der Arbeitsabläufe bei der Verarbeitung von Erdnuss Proben für die Genexpression oder Aflatoxin-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> RNAi Erdnusslinien 288-72 und 288-74 zeigte Präsenz des NPTII wählbaren maker, wenn sie von STN-PCR getestet, sind Gel-Abschnitte in Abbildung 6 (oben) gezeigt, original Bilder sind von den Autoren auf Anfrage. Plasmid pCAPD wurde nicht zur Kontrolle der Umwandlung verwendet, da es inverted repeats von zwei Genen Cmr (Chloramphenicol-Resistenz) und CcdB (Toxin) unbekannter Wirkung auf Pflanzen kodiert. PCR-negativ Erdnussleitung 288-9 und andere, die durch den Regenerationsprozess ging und wurde in den gleichen Bedingungen wie RNAi Linien gewachsen, wurden als negative con verwendettrol. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Abbildung 6. Nachweis von Transgenen und Echtzeit-Expression von RNAi Einsatz Top: Single-Tube, Nested PCR-Nachweis von transgenen Linien Erdnuss RNAi-288-72 und RNAi-288-74, positive Pflanzen. Kontrollen: W (Wasser), PP (positive Pflanze), MM (Master-Mix), p (Plasmid p5XCAPD); Fraktionen 2.1 4.1 8.1 16.1 stellen 2-fachen Verdünnungen von DNA Unten:. Real-Time-PCR-Nachweis der Expression des RNAi einfügen (Primer-Sets: RT_5X_1, RT_5X_2, wie in Abbildung 1, auf unreifen ( gelb) und reifen (braun) Keimblätter der transgenen Linien 24 und 48hr Inkubation; graue Linie: C T = 1. Histogramme repräsentieren die Mittelwerte und Standardfehlerbalken (T) von drei biologischen Probenmit drei technische Replikate. Die relative Quantifizierung der RNAi Einsatz normalisiert in Bezug auf das Housekeeping-Gen Actin als interne Kontrolle und Vergleichs fache Expression des Transgens, berechnet als in 5.2.2 und 5.3 beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um die Wirksamkeit von Pflanzenwirts RNAi-vermittelte Potentialsteuerung von Aflatoxin Akkumulation zu testen, wurden frisch geernteten Conidien von Aspergillus flavus NRRL 3357 an der Schnittfläche des Halb Cotyledonen aus dem die Embryonen und Samenschale entfernt worden waren aufgebracht (Figuren 3, 4). A. flavus NRRL 3357, für die das Genom sequenziert wurde und war die Grundlage für die Gestaltung p5XCAPD, wurde freundlicherweise von Dr. Horn an USDA-ARS-NPRL vorgesehen. Die sich ergebende Pilz Invasion Halb cotyledon nach 24, 48 und 72 h bei 30 ° C zeigen,<html> n in Fig. 4 Beispiele für das beimpfte Halb Kotyledonen wurden bei 24 gesammelt, 48, 72, 96 h Inkubation und durch LC-MS für die vier Haupt Aflatoxin B 1, B 2, G 1 und G 2 mit UPLC analysiert und bestätigt ; Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Aflatoxin-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines veröffentlichten Verfahrens mit Modifikationen 36 bestimmt. Bei 96-stündiger Inkubation, Keimblätter beginnen, durch die Pilzinfektion zerfallen. RNAi Linie 288-72 eine deutlich geringere Aflatoxine als die Kontrolle zu allen Stichprobendaten in unreifen Keimblätter und höchstens Probenahmetermine in den reifen Einsen. RNAi Linie 288-74 zeigten signifikant niedrigere Aflatoxinen höchstens Probenahmetermine. Signifikanzniveaus von Tukey-Tests sind mit einem Stern in der Grafik der 7 angegeben ist. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 7. Aflatoxine B 1 und B 2 in Halberdnusskeimblätter nach der Inkubation (24, 48, 72 und 96 h) mit Aspergillus flavus Steuerung: Samen 288-9 nicht-transgenen Linie; RNAi: Samen von RNAi-288-72 und RNAi-288-74, transgen für RNAi p5XCAPD zu fünf Aflatoxin-Synthesegene zum Schweigen zu bringen. (A) Aflatoxin B 1 in reifen Samen (braun); (B) Aflatoxin B 2 reifen Samen; (C) Aflatoxin B 1 in unreifen Samen (gelb) und (D) Aflatoxin B 2 in unreifen Samen. Durchschnittswerte mit den entsprechenden Standardfehlerbalken (T) von doppelten biologischen Proben dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede Tukey-Test *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Insgesamt RNAi-288-72 zeigte während des gesamten Experiments (24 bis 96-stündiger Inkubation), eine 94% bis 100% Reduktion der Aflatoxin B 2 und 90% bis 100% Reduktion der Aflatoxin B 1 im Vergleich zu der Kontrolle. RNAi-288-74 zeigte eine 63% -100% Reduzierung der Aflatoxin B 2 und 60% -100% Reduzierung der Aflatoxin B 1, Abbildung 7. Primer für die Real-Time PCR-Nachweis der Expression des RNAi Einsatz verwendet werden, in Abbildung 1 dargestellt. Die Erdnuss-Saatgut Keimblätter wurden ohne Embryonen untersucht, um ihre natürlichen Abwehrkräfte zu entfernen, und in der Lage, die potenziellen Auswirkungen von RNAi auf der die meisten exponierten Bereich erfassen Pilz-Invasion, die Keimblätter. Die Expression des RNAi Einsatz in unreifen Keimblätter (gelb) der Linie 288 bis 74 von Primersatz RT_5X_1 erkannt war das Vierfache über dem C T </sub&gt; = Schwellwert 1 der Negativkontrolle und durch Primersatz RT_5X_2 war 19-fach über der Schwelle, die alle auf 24-Stunden-Inkubation. Zumindest drei von fünf aufeinanderfolgenden Genfragmenten im Erdnuss Transformation verwendet, 5027, 7223 und 7228 (aflep, AFLs / aflJ und AFLC / pksA), wurden durch RT-PCR nachgewiesen (1, 6). Die Expression von RNAi-Insert wurde nicht in reifen Keimblätter bei 24 Stunden oder auf reife oder unreife Keimblätter bei 48-stündiger Inkubation, 6 (unten) festgestellt. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Peanut-Linie </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Zeitpunkt der Probenahme </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Proben für die RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Die Proben für die Analyse auf Aflatoxine (beimpft) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> NUmbra von Saatgut </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (nicht geimpften) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (gelb) </td><td style="width:64px;"> 24-Stunden- </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 Stunden </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 Stunden </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Steuern </td><td style="width:64px;"> 24-Stunden- </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (gelb) </td><td style="width:64px;"> 48 Stunden </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 Stunden </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Beispiel für kleine Stichproben-Setup, um die Genexpression und Aflatoxin Akkumulation in RNAi Erdnusskerne zu analysieren. Vollständige Analyse des Ausdrucks und Aflatoxine für eine Laufzeitgruppe (dh., Gelb), mit drei Abtastzeiten (24, 48 und 72 h) in dreifacher Ausfertigung würde 4,5 Samen erforderlich, jeweils die Nummer eins in der Tabelle die Hälfte Keimblatt.

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Wir zeigen, ein Verfahren zur Analyse von Aflatoxinen und die Transgen-Expression in Erdnusskerne, die die RNA-Interferenz-Signale zum Dämpfen Aflatoxin-Synthesegene in dem Pilz Aspergillus flavus enthalten. RNAi-vermittelte Kontrolle von Mykotoxinen in Pflanzen ist bisher nicht berichtet worden.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

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Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.9K Aufrufe.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service.  Wir zeigen, ein Verfahren zur Analyse von Aflatoxinen und die Transgen-Expression in Erdnusskerne, die die RNA-Interferenz-Signale zum Dämpfen Aflatoxin-Synthesegene in dem Pilz Aspergillus flavus enthalten. RNAi-vermittelte Kontrolle von Mykotoxinen in Pflanzen ist bisher nicht berichtet worden. 

Serie: RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimieren Rauchgas Einstellungen, um Mikroalgen in Photobioreaktoren Wachstum über Computer-Simulationen fördern

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Forschung

Umwelt

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Ein Gusseted Thermogradient Tabelle zur Bekämpfung von Bodentemperaturen für das Pflanzenwachstum Beurteilung und Überwachung von Bodenprozessen

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

Herstellung und Messung von organischen Partikeln in der Harvard-Klimakammer

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

Die Pflanze-Infektion-Test: Spray und Wunde-vermittelten Inokulation mit Pflanzen Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Beurteilung der Feinstaub entfernen Fähigkeiten des Baumes Blätter

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

Wirksamkeit von Pestiziden gegen Krankheit Vektor Mücken im Bereich Visualisierung

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are potent carcinogens that substantially reduce crop value in maize and other oil rich crops like peanut besides posing serious threat to human and animal health. Different approaches, including traditional breeding, transgenic expression of resistance associated proteins, and RNA interference (RNAi)-based host-induced gene silencing of critical A. flavus gene targets, are being evaluated to increase aflatoxin resistance in susceptible crops. Past studies have shown an important role of &#945;-amylase in A. flavus pathogenesis and aflatoxin production, suggesting this gene/enzyme is a potential target to reduce both A. flavus growth and aflatoxin production. In this regard, the current study was undertaken to evaluate heterologous expression (under control of the constitutive CaMV 35S promoter) of a Lablab purpureus L. &#945;-amylase inhibitor-like protein (AILP) in maize against A. flavus. AILP is a 36-kDa protein, which is a competitive inhibitor of A. flavus &#945;-amylase enzyme and belongs to the lectin&#8211;arcelin&#8211;&#945;-amylase inhibitor protein family in common bean. In vitro studies prior to the current work had demonstrated the role of AILP in inhibition of A. flavus &#945;-amylase activity and fungal growth. Fungal growth and aflatoxin production in mature kernels were monitored in real time using a GFP-expressing A. flavus strain. This kernel screening assay (KSA) is very simple to set up and provides reliable and reproducible data on infection and the extent of spread that could be quantified for evaluation of germplasm and transgenic lines. The fluorescence from the GFP strain is closely correlated to fungal growth and, by extension, it is well-correlated to aflatoxin values.&#160; The goal of the current work was to implement this previous knowledge in a commercially important crop like maize to increase aflatoxin resistance. Our results show a 35%&#8211;72% reduction in A. flavus growth in AILP-expressing transgenic maize kernels which, in turn, translated into a 62%&#8211;88% reduction in aflatoxin levels.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Here we present a protocol to analyze Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in maize kernels expressing an antifungal protein.&#160; Using a GFP-expressing A. flavus strain we monitored the infection and spread of the fungus in mature kernels in real time. The assay is rapid, reliable, and reproducible.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Bewertung der Resistenz von wilden Erdnussarten gegen Aflatoxinakkumulation

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate economically important agricultural commodities, including peanuts, posing a high risk to human and animal health. Due to the narrow genetic base, peanut cultivars demonstrate limited resistance to fungal pathogens. Therefore, numerous wild peanut species with tolerance to Aspergillus have received substantial consideration by scientists as sources of disease resistance.
Exploring plant germplasm for resistance to aflatoxins is difficult since aflatoxin accumulation does not follow a normal distribution, which dictates the need for the analyses of thousands of single peanut seeds. Sufficiently hydrated peanut (Arachis spp.) seeds, when infected by Aspergillus species, are capable of producing biologically active stilbenes&#160;(stilbenoids) that are considered defensive phytoalexins. Peanut stilbenes inhibit fungal development and aflatoxin production. Therefore, it is crucial to analyze the same seeds for peanut stilbenoids to explain the nature of seed resistance/susceptibility to the Aspergillus invasion. None of the published methods offer single-seed analyses for aflatoxins and/or stilbene phytoalexins.
We attempted to fulfill the demand for such a method that is environment-friendly, uses inexpensive consumables, and is sensitive and selective. In addition, the method is non-destructive since it uses only half of the seed and leaves the other half containing the embryonic axis intact. Such a technique allows germination and growth of the peanut plant to full maturity from the same seed used for the aflatoxin and stilbenoid analysis. The integrated part of this method, the manual challenging of the seeds with Aspergillus, is a limiting step that requires more time and labor compared to other steps in the method. The method has been used for the exploration of wild Arachis germplasm to identify species resistant to Aspergillus and to determine and characterize novel sources of genetic resistance to this fungal pathogen.

Autor im Rampenlicht: Quantifizierung von Aflatoxinen und Phytoalexinen in Erdnusssamen zur Identifizierung der genetischen Resistenz gegen Aspergillus

We demonstrate a medium-throughput method for quantification of aflatoxins and stilbenoid phytoalexins in single peanut seeds using ultra performance liquid chromatography. This method was specifically developed for the analyses of wild Arachis species challenged by the aflatoxigenic Aspergillus species.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /

Zusammenfassung

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