Hier präsentieren wir einen einfachen Kernel-Screening-Test, um Aspergillus flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion in Maiskernen zu analysieren, die ein antimykotisches Protein exdrücken. Mit einem grünen fluoreszierenden Protein, das aspergillus flavus Stamm exdrückt, überwachen wir die Infektion und Ausbreitung des Pilzes in reifen Kernen in Echtzeit. Dieser einfache Test bietet ein zuverlässiges Mittel zur Bewertung der Fähigkeit des Maiskerns, aspergillus flavus Infektion und Aflatoxin-Produktion zu widerstehen.
Die Ergebnisse dieses Labor-Assays, der unter kontrollierten Bedingungen an ausgereiften Kernen durchgeführt wird, korrelieren gut mit den Ergebnissen einer Infektion unter Feldbedingungen. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Rajtilak Majumdar, einem Postdoc aus unserem Labor, zusammen mit Christine Sickler und David Ambrosio, Bio-Technikern auch aus unserem Labor. Zu Beginn kleben Sie 20 zwei mm Fangkappen in eine Petrischale, um KSA-Kappen zu erstellen.
Lassen Sie den Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie die Kappen verwenden. In einem biologischen Sicherheitsschrank sprühen Sie eine quadratische Bioassayschale mit 70% Ethanol in Wasser. Lassen Sie die Schalenluft trocknen.
Steriles Chromatographiepapier in das trockene Fach geben. Neun der KSA-Kappen mit 70% Ethanol besprühen und an der Luft trocknen lassen. Dann legen Sie die Kappen auf das Bioassay-Tablett.
Wählen Sie für jede getestete transgene Maislinie 20 unbeschädigte Kerne aus und legen Sie sie in ein 50 ml Zentrifugenrohr. Wählen Sie mit einem Tisch-Stereomikroskop nur unbeschädigte Kerne für den Test aus. Beschädigte Kerne sind anfälliger für Aspergillus-Angriffe und produzieren mehr Aflatoxin, wodurch die Ergebnisse verzerrt werden und nicht die wahren antimykotischen oder antimikrobiellen Eigenschaften der Sorte darstellen.
Fügen Sie 70% Ethanol in jede Röhre. Lassen Sie die Kerne vier Minuten lang sterilisieren und gelegentlich sanft schütteln. Danach das Ethanol vorsichtig abgießen und die Kerne in sterilem entionisiertem Wasser dreimal sanft abspülen.
Erhalten Sie eine sechstägige Kultur von Aspergillus flavus Fleck 70 aus, die GFP ausdrückt, die auf V8-Medium angebaut werden. 20 ml steriles 0,02%Triton X-100 in entionisiertem Wasser hinzufügen. Und verwenden Sie eine sterile Schleife, um die Sporen abzukratzen.
Pipette aus dem Inokulum und übertragen Sie es in ein 300 ml steriles Becherglas. Bereiten Sie eine fünffache Verdünnung mit 0,02%Triton X-100 vor und verwenden Sie ein Hämozytometer, um eine Sporenzahl durchzuführen. Bei Bedarf erneut verdünnen, um 100 ml mit einer Konzentration von vier Millionen Sporen pro ml zu erhalten.
Gießen Sie das Inokulum in ein leeres Becherglas. Die Kerne in einen sterilen 300 ml Becher mit Rührstange geben und drei Minuten rühren. Mit Zangen übertragen Sie die Kerne auf die Bioassay-Schale und stellen sicher, dass nur ein Kernel in jede Kappe platziert wird.
Fügen Sie 30 ml entionisiertes Wasser auf den Boden jedes Bioassay-Tabletts. Und sieben Tage lang bei 31 Grad Celsius brüten. Nach sieben Tagen Impfung mit A.flavus, fotografieren Sie vier Kerne, die für mikroskopische Analyse und Fotografie bestimmt wurden.
Verwenden Sie dann ein Weichgewebe und entionisiertes Wasser, um das Äußere der Kerne zu reinigen. Führen Sie Längsschnitte von Kernen durch und fotografieren Sie sofort unter dem Fluoreszenzmikroskop. Um die Kerne für die Analyse vorzubereiten, reinigen Sie die Außenseite der verbleibenden Kerne mit einem Weichgewebe und entionisiertem Wasser.
Legen Sie vier Kerne, die einen Rep bilden, in eine 15 ml Schraubverschluss-Polycarbonat-Durchstechflasche mit zwei Edelstahlkugeln. Die Fläschchen sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei 80 Grad Celsius lagern, bis sie mit der weiteren Verarbeitung und Analyse fertig sind. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kerne aus dem Gefrierschrank und verwenden Sie einen Homogenisator, um sie drei Minuten lang bei 1500 Umdrehungen pro Minute zu mahlen.
Verwenden Sie die gleichen Bodenmaterialien für die GFP-Analyse, die Aflatoxin-Bestimmung und die molekulare Analyse, so dass alle Werte repräsentativ für die Proben sind. Während mindestens drei Replikationen empfohlen werden, ist mehr immer besser, abhängig von der Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Kerneln. In dieser Studie werden unreife Embryonen von Mais-HI-II-Linien mit dem Agrobacterium tumefaciens EHA101-Stamm transformiert, der den endgültigen Pflanzenzielvektor enthält, der das Lablab purpureus AILP-Gen unter der Kontrolle des 35S-Promotors aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus ausdrückt.
Die PCR-Verstärkung des Ziel-AILP-Gens zeigte ein 548 bp Amplikon, das nur in den transgenen Maislinien beobachtet wurde. Das AILP-Gen zeigte Expression in den transgenen Linien, während in den Kontrollpflanzen keine AILP-Expression beobachtet wurde. Keimsporen im Frühstadium sind 20 Stunden lang rohen Blattextrakten aus jungen transgenen Maispflanzen ausgesetzt.
Die hohe Gesamtlänge von Sporen, die transgenen Blattextrakten ausgesetzt sind, zeigen eine Reduktion von 58 bis 80 % im Vergleich zur Negativkontrolle. Der verwendete A.flavus-Stamm enthält einen GFP-Reporter, der die Überwachung und Quantifizierung des Pilzwachstums in Echtzeit ermöglicht. In transgenen AILP-Kernen wird eine signifikante Reduktion der GFP-Fluoreszenz im Vergleich zur isogenen Negativkontrolle beobachtet.
Bei den AILP-Linien vier und fünf, 69 % bzw. 72 % ist ein deutlicher Rückgang des Pilzwachstums zu verzeichnen. Die anderen Zeilen zeigen eine Reduktion von 35 bis 60% im Vergleich zu den Kontrollkernen. In den AILP-Kernen wurde eine Reduktion des Aflatoxingehalts um 62 bis 88 % im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.
Linie 4 hat mit 486 ng pro g den niedrigsten Aflatoxingehalt, gefolgt von anderen Zeilen, die in den Kernen einen Gehalt zwischen 640 und 1498 ng pro g hatten. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie z. B. die Verwendung eines Fluorometers zur Quantifizierung von GFP und als Pilzwachstum. Immunbasierte kommerzielle Kits oder HPLC oder EPLC können verwendet werden, um Aflatoxin-Quantifizierung durchzuführen.
Die Verfügbarkeit von KSA bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Beständigkeit gegen Aflatoxinkontamination zu bestimmen. Die verschiedenen Maiszuchtlinien lassen sich mit dieser Technik schnell beurteilen. Während der Kernel-Screening-Test nicht gefährlich ist, sollte der Bediener sich vor der Exposition gegenüber Aspergillus flavus Sporen schützen, geeignete Schutzausrüstung verwenden.
