Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. Anzucht und Polarisationsknochenmark-Makrophagen <ol><li> Tag 0: Isolieren Oberschenkel und Schienbein Knochen 6-10 Wochen alten Mäusen von Interesse (C57BL / 6 in diesem Test). </li><li> Entfernen Muskelgewebe aus den Knochen und legen Sie die Knochen in einer 9 cm Petrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in eine 9 cm Petrischale mit 70% Ethanol gefüllt und schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in eine frische 9 cm Petrischale mit eiskaltem sterilem PBS gefüllt. </li><li> Schneiden Sie die Oberschenkel und Schienbein an beiden Enden mit einer sterilen Schere. </li><li> Spülen Sie die Knochen mit 10 ml eiskaltem sterilem PBS mit einem 10-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel. Sammeln Sie das Knochenmark in einem 50-ml-Tube. </li><li> Übertragen Sie die Knochenmarkszellen zu einem neuen 50-ml-Röhrchen mit einer 23 G-Nadel. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer 25 G-Nadel. Anmerkung: Diese Schritte sind erforderlich, um Zellklumpen und Knochenreste zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie die supernatant und Resuspendieren der Zellen in 40 ml Zellkulturmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-Glutamin, 10% FCS, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 15% filtriert L-929-Zellen ( ATCC, CCL-1) -conditioned Medium anstelle enthaltenden M-CSF (oder alternativ 10 ng / ml rekombinantem M-CSF von L-929-Zellen konditionierten Medium). Hinweis: Die Erzeugung von L-929-Zellen konditionierten Medium wurde zuvor in dieser Zeitschrift im Jahr 2013 11 detaillierte </li><li> Kultur die Zellen von einer Maus in zwei 15 cm Petrischalen (keine Zellkultur-behandelten Platten, da Makrophagen nicht aus diesem Kunststoff lösen) in 20 ml Kulturmedium pro Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. </li><li> 10 ml frisches Zellkulturmedium an Tag 3, ohne Entfernen der 20 ml älteren Zellkulturmedium. </li><li> Ersetzen Sie die alte mittel jeder Platte mit 20 ml frischem Kulturmedium an Tag 6. Auf diese Weise wird nicht haftenden Zellen entfernt werden. </li><li> Tag 8: <ol><li> Trennen Sie die Zellen durch Inkubation 5 min bei 37 ° C in 10 ml einer Citratsalzlösung (135 mM Kaliumchlorid plus 15 mM Natriumcitrat in H 2 O, autoklaviert) und wasche mit 10 ml PBS. Graf reifen Knochenmark-Makrophagen (BMDM) am Tag 8 mit Hilfe eines Zellzählers. </li><li> Stellen Sie sicher, die Bildung von reifen (CD11b + F4 / 80 +) BMDM durch visuelle Inspektion oder durch Durchflusszytometrie. Block 10 5 Zellen, die mit anti-CD16 1/100 / CD32 in PBS für 20 min in 100 ul PBS, inkubiert mit 1/200 Anti CD11b-FITC und 1/200 Anti-F4 / 80-APC-Cy7 bei RT Wasch und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Hinweis:. Das Kultivieren der Maus Knochenmark-Makrophagen im Detail weiter oben in dieser Zeitschrift, die von Ying et al 11 erschienen. </li></ol></li><li> Samen 50.000 Zellen (optimale Zellzahlen optimiert werden müssen) pro Vertiefung in einer Zellkulturmikroplatte in 100 &amp; mgr; l Kulturmedium. Saatgut nicht Zellen in Untergrundkorrektur Brunnen (A1, A12, H1, H12) und legte nur Medium (keine Zellen) in diesen Brunnen. Tipp: Halten Sie die Pipette in einem Winkel aKampf auf halber Höhe der Seite der Vertiefungen für die meisten homogenen Zellschicht. </li><li> Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur in einer Zellkultur Haube für 1 Stunde zu begleichen. Dies wird auch zu fördern Zellverteilung und Randeffekte zu reduzieren. Überwachen Anhaften unter Verwendung eines Mikroskops und Kultur in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Drei Stunden nach dem Plattieren stimulieren Zellen für 24 h mit 10 ng / ml LPS, oder 20 ng / ml rekombinantes Maus-IL-4 an M1 oder M2 Makrophagen erzeugen sind. Schließen unbehandelte naiv (M0) Makrophagen als Kontrolle. Beurteilen richtigen M1 und M2 Makrophagen Polarisation durch Messen LPS-induzierte Sekretion von IL-6, IL-12, TNF (ELISA) und IL-4-induzierte Arginase-1-Aktivität und / oder MMR (CD206) und MGL (CD301) Oberflächenexpression (Durchflusszytometrie), wie zuvor beschrieben, 3,11. Anmerkung: An diesem Punkt können die Zellen (vor) sein -behandelten pharmakologische Verbindungen von Interesse oder Makrophagen können mit anderen Faktoren stimuliert werden. Da könnte die Variation zwischen getrennten Vertiefungen subs seintantial, ist es ratsam, mindestens 4 und idealerweise 6 Vertiefungen pro Bedingung verwenden. </li></ol> 2. Herstellung der extrazellulären Flux Assay <ol><li> Hydrat der Sensorkartusche einen Tag vor der Durchführung des Assays: <ol><li> Legen Sie die Sensorkassette auf den Kopf neben der Versorgungsplatte. </li><li> Füllen jeder Vertiefung der Versorgungsplatte mit 200 ul Kalibrierlösung und senken Sie die Sensorkartusche auf die Versorgungsplatte Eintauchen der Sensoren in der Kalibrierlösung. </li><li> Stellen Sie sicher, das Kalibrierungslösung hoch genug ist, um die Sensoren eingetaucht und in eine nicht-CO 2 Inkubator bei 37ºC O / N zu halten. </li></ol></li><li> Vorbereitung Assaymedium am Tag des Assays wie folgt: <ol><li> Warm 50 ml XF Basismedium auf 37 ° C. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l 200 mM L-Glutamin, eine 2 mM Endkonzentration zu erhalten. </li><li> Einstellen des pH auf 7,4 mit 1 N NaOH und Sterilisieren mit einem 0,2 um Filter und halten das Assay-Medium bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium von den polarisierten Makrophagen und speichern Sie sie bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung (zB ELISA, um die ordnungsgemäße Makrophagenpolarisation zu untersuchen). Die Zellen mit 100 &amp; mgr; l Assay-Medium zu waschen, fügen Sie 180 ul Assay-Medium pro Vertiefung und unter dem Mikroskop die Zellen wurden nicht abgewaschen zu überprüfen. Setzen Sie den Zellkulturplatte in einem 37 ° C Inkubator ohne CO 2 für 1 h vor dem Testlauf. </li><li> Bereiten Sie 10 x Injektionsmischungen A bis D wie in Tabelle 1 auf 37 ° C beschrieben, warm, den pH-Wert auf 7,4 und Filter zu sterilisieren. <ol><li> Stellen alle Verbindungen, die in diesen Gemischen bei 10-facher Endkonzentration in der Zellkulturvertiefungen und diese Konzentrationen zu optimieren für jeden Zelltyp. </li></ol></li><li> Laden Sie die Sensorkartusche mit den mitgelieferten Ladeführungen mit angegebenen Volumen (Tabelle 1) der vorbereiteten 10x Spritzmischungen in Anschlüsse A, B, C und D, welche nach Süctively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Gemisch / Einspritzung </td><td> Verbindungen </td><td> Volume hinzugefügt zu 10x Mischung (ul) zu erhalten </td><td> Volume Assay-Medium (ml) </td><td> Volume während der Lauf injiziert (ul) </td><td> Endkonzentration im Test </td></tr><tr><td> EIN </td><td> 2,5 M (45%) Glucose </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> B </td><td> 5 mM Oligomycin A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> C </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM Natriumpyruvat-Lösung </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 mM Antimycin A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM Rotenon (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 &amp; mgr; M </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Injection Mischungen. 3. Bioenergetische Charakterisierung polarisierte M1 und M2 BMDM mit einem extrazellulären Flux Analyzer <ol><li> Erstellen Sie einen Test-Vorlage mit der Assay-Assistent mit 2 Minuten und MIX 3 Minuten MEASURE Zeiten und (mindestens) 3-Mix und Geschwindigkeitsmessungen Schleifen vor jedem der 4 Injektionen (Tabelle 1) und nach der letzten Injektion. Anmerkung: Diese Konzentrationen gelten für Knochenmark stammenden Makrophagen und Raw264.7 Makrophagenzellinien, sollte aber für jeden Zelltyp optimiert werden. Zugabe Pyruvat in FCCP Mischung benötigt wird, um eine maximale Atmungs Kraftstoff. </li><li> Starten Sie den Lauf durch Drücken der Start unten und folgen Sie den Anweisungen des Gerätes. Ersten Last das AutoRidge Platte mit den hydratisierten Sonden, um die Kalibrierung von Vorrichtungen und nächste Ladung der Zellplatte zu ermöglichen. </li><li> Nach der Verwendung sorgfältig verwerfen alle Assaymedium und Speichern der analysierten Zellkulturmikro bei -20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung unter Verwendung der Zell-Proliferation-Assay-Kit, wie im einzelnen durch den Hersteller beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, bereiten eine 1x Zell-Lyse-Puffer durch Verdünnen Komponente B 20-fach in destilliertem Wasser und verdünnte Verbindung A 400-fach in der 1x Zell-Lyse-Puffer. Fügen Sie 200 ul pro Vertiefung inkubieren 5 min bei RT und messen Fluoreszenz mit ~ 180 nm Anregung und ~ 520 nm Emissionsmaxima. Hinweis: Bei der Arbeit mit nicht-haftenden Zellen oder wenn schlechte Haftung ist ein Anliegen, das direkte Zellproliferation Kit kann als Alternative verwendet werden, da dieses Protokoll nicht löschen dabei alle Testmedium erfordert. Doch dies ist direkte Protokoll etwas weniger empfindlich gegenüber der in dieser Übung verwendete Protokoll. </li></ol></li><li> Nach Fluoreszenzmessung, zu normalisierendie Zellzahl in jeder Vertiefung als ein Verhältnis, in welchem ​​die durchschnittliche Zellzahl aller naiven Makrophagen Vertiefungen auf 1 gesetzt wird. Achtung: Die Proteinquantifizierung (zB unter Verwendung eines BCA-Assay) könnte als eine Alternative, um Zellen zählt Normalisierung verwendet werden. Doch in unseren Händen dieser Test war weniger empfindlich gegenüber dem Zellproliferationsassay-Kit. </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. 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Das Ziel unserer Labor ist zu verstehen, wie Makrophagen-Polarisation und Funktion kann mit dem Ziel, den Ausgang von Arteriosklerose und anderen Entzündungskrankheiten 12 verbessern beeinflusst werden. Makrophagen Polarisation bewerten, misst man typischerweise die LPS (+ IFN &amp; ggr;) induzierte IL-4-induzierte Genexpression von M1 und M2 Markergene (qPCR), bestimmt IL-6, IL-12, TNF und NO-Sekretion (durch ELISA und Griess-Reaktion) und untersucht, IL-4-induzierte CD71, CD206, CD273 und CD301 Oberflächenexpression (durch Durchflusszytometrie) und Arginaseaktivität 3,13. Zusätzlich kann die Apoptose-Assays (von Annexin-V / PI-Färbung), Phagozytose Assays (mit fluoreszierenden Latexkügelchen und / oder pHrodo E. coli) und Schaumzellbildung Assays (von Dil-oxLDL-Aufnahme, LipidTOX neutralen Lipid-Färbung) durchgeführt werden soll evaluieren Makrophagen-Funktionalität 14. Zusätzlich kann die extrazelluläre Flussanalyse durchgeführt, um zu messen, Bioenergetik Profile der polarisierten mac werdenrophages als eine neue und alternative Funktionsanzeige. Dieses Manuskript zeigt, dass Makrophagen-Polarisation induziert Stoffwechsel Umprogrammierung mit LPS-induzierte Makrophagen Umstellung auf erhöhte Glykolyse als Energiequelle. Umgekehrt, IL-4-induzierte Makrophagen M2 verwenden mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung als die Hauptquelle von ATP. Wichtiger ist, metabolische Anpassung bietet nicht nur Energie für die besonderen Anforderungen von M1 und M2 polarisierten Makrophagen. In der Tat, metabolische Veränderungen beeinflussen Metabolitenkonzentrationen, die direkte Aufsichtsbehörden des Makrophagen-Phänotyp 10,15,16 sind. Daher ist Makrophagen-Stoffwechsel nicht nur ein Merkmal, sondern auch einen Fahrer deutliche Makrophagen Polarisationszustände (wie hier in 2 gezeigt), und dieses neue Wissen unterstützt das schnelle Wachstum des immunometabolism Forschungsbereich während der letzten paar Jahre. Allerdings robuste Messungen von Stoffwechselprofilen in MakroPhagen blieb schwierig und hatte ihre Grenzen. In dieser Studie wird ein extrazelluläres Fluss-Analysator angewendet, um robust zu messen Glykolyse Glykolyse-Schutzgebiet, maximal glykolytischen Kapazität, nicht glykolytischen Versauerung, basale und maximale Atmung, die ATP-Produktion, Ersatzatemkapazität, Protonenleck und nicht-mitochondriale Atmung in Echtzeit in einer minimalen Menge an Makrophagen. Daher modifiziert und verbessert den Protokollen des Herstellers wie folgt wir. Die Standard Mito Stress Test (# 103015-100) schlägt mit Medium mit Glukose und Pyruvat und ein Protokoll mit 3 Injektionen (OM, FCCP, AA / Rot). Wir entscheiden uns, den Test mit Glucose / Pyruvat-freiem Medium zu starten, fügen Glucose als erste Injektion im Anschluss A (wie in der Glykolyse Stress Test # 103020-100) und fügen Pyruvat zusammen mit dem FCCP Entkoppler in Port C. Auf diese Weise alle relevanten Glykolyse Parameter aus den ECAR Messungen 1-9 und allen relevanten Informationen über mitochondri abgeleitetal-Funktion von OCR-Messungen 4-15. Man beachte, dass es kritisch ist, Pyruvat zusammen mit FCCP injizieren, um eine maximale Atmungs beim Entkuppeln Kraftstoff. Vor der Verwendung dieses kombinierte Protokoll sollte man auch sicherstellen, dass 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) senkt ECAR Ebenen nach dem Test zur Bestimmung der basalen Werte (1-3), und dass die aufgezeichneten ECAR Raten 4-6 sind in der Tat aufgrund Glykolyse. Zusätzlich sollte man verstehen, dass die Konzentrationen der Verbindung, und die Zellzahlen in diesem Manuskript verwendet gelten für Knochenmark stammenden Makrophagen und Raw264.7 Makrophagenzellinien und sollte für andere Zelltypen optimiert werden. Außerdem sollte man beachten, dass M-CSF, der verwendet wird, um Knochenmark stammenden Makrophagen erzeugen fördert eine M2 artige entzündungshemmende Phänotyp. Die vorgestellten Ergebnisse aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen kann daher nicht ohne weiteres vergleichbar, Messungen mit primärem Gewebe Makrophagen oder Makrophagen-Zelllinien, die M-CSF während der Zell culturi erfordern seinng. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, dieses Protokoll erfordert nur minimale Mengen von Makrophagen und schnell liefert praktisch alle grundlegenden metabolischen Zelleigenschaften. Dies führt zu genügend überschüssige Zellen auf andere immunologische Tests und sogar die für Bioenergetik Profilierung verwendeten Zellen könnte noch für andere nach dem Test vorgesetzt werden durchzuführen. Außerdem ermöglicht die besondere 96-Well-Plattenformat Beurteilung mehrerer Bedingungen in Echtzeit gleichzeitig. Trotzdem kann die Variation zwischen den einzelnen Vertiefungen erheblich und daher die Verwendung von mindestens 4 Vertiefungen pro Zustand wird oft gewünscht. Taken diese Einschränkung berücksichtigen, können immer noch die beschriebenen extrazellulären Flussanalyse, um mehr als 10 Versuchsbedingungen ausgeführt (n = 6) auf einmal, die viel mehr als traditionelle Techniken ist. Insgesamt bietet dieser Artikel eine einfache und reproduzierbare Funktionstest, die Messung aller relevanten Glykolyse und mitochondriale param erlaubtmeter in polarisiert Makrophagen-Teilmengen. Diese Technik kann als eine zukünftige Anwendung auf Makrophagenfunktion zu beurteilen und die Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen (zB Gen-knock down, neue Arzneimittel, etc.) auf (metabolische) Phänotyp der Makrophagen zu bewerten dienen. Als solche kann die extrazelluläre Durchflussdaten in Verbindung mit anderen Tests verwendet werden, um eingehende Charakterisierung des Makrophagenaktivierungszustand zu erlauben.

Während Makrophagen spielen eine zentrale Rolle in nahezu allen Krankheiten, sind die molekularen Mechanismen, die ihren Phänotyp zu regeln noch immer nicht vollständig entwirrt. Makrophagen zeigen hohe Heterogenität und in Reaktion auf die Mikroumgebung annehmen unterschiedlichen Phänotypen 1. LPS (+ IFN &amp; ggr;) induzierte klassisch aktiviert M1 oder M (LPS) Makrophagen fördern Entzündung und zum Schutz des Wirtes gegen verschiedene Arten von mikrobiellen Bedrohungen 2. Andere nutzen IFNy alleine oder in Kombination mit TNF als Reize zu M1 Polarisierung hervorzurufen. IL-4 und / oder IL-13 induziert alternative Aktivierung von Makrophagen und diese M2 oder M (IL-4) -Zellen sind potente Suppressoren und Steuerungen der laufenden Immunreaktionen 3. Polarisierten Makrophagen zeigen eine deutliche Regulation des Zellstoffwechsels mit LPS-aktivierte Makrophagen M1 sich in einem Stoffwechselschalter, um eine verbesserte Glykolyse 4-6. Umgekehrt verbessert Fettsäureoxidation (FAO) und der mitochondrialen oxidative-Phosphorylierung (OXPHOS) bietet lang anhaltende Energie in IL-4-induzierte M2 Makrophagen 7-9. Somit verändert Stoffwechsel nicht nur eine Eigenschaft von Makrophagen polarisierte Teilmengen, es ist auch eine Voraussetzung für die richtige Polarisierung und Entzündungsregelung. Wichtig ist, dass die Inhibierung der Glykolyse oder OXPHOS / FAO wurde gezeigt, M1 oder M2 Aktivierung jeweils 8,10 beeinträchtigen. Als solches könnte die Identifizierung metabolische Veränderungen in Makrophagen als ein Werkzeug, um den Polarisationszustand und Entzündungspotential abgewogen werden. Eine konsequente Assay, der Makrophagen-Stoffwechsel Maßnahmen könnte daher verwendet werden, um vorherzusagen, ob ein Medikament, Gen-knock down oder einer anderen Behandlung wirkt Makrophagenpolarisation und Funktion. In diesem Video wird ein extrazelluläres Fluss-Analysator verwendet, um die Bioenergetik Profilen von naive, M1 und M2 Makrophagen zu charakterisieren. Dieses Manuskript Details ein optimiertes Protokoll, das die Messung erlaubtaller relevanten Parameter der Glykolyse (Glykolyse, maximal Glykolyse und glykolytischen Reserve) und die Funktion der Mitochondrien Eigenschaften (Gesamtatmung, basale mitochondriale Atmung, die ATP-Produktion, Protonenleck, maximal Atmung und Ersatzatemkapazität) in einem einzigen Assay. Mit diesem Versuchsaufbau kann Bioenergetik zwischen Kontrolle und &#39;verändert&#39; verglichen werden (zB Gen-knock down, transgene Überexpression oder pharmakologische Behandlung) Zellen.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Nach Beendigung der extrazellulären Flusstest und Zellquantifizierung, können Daten für Zellzahl normiert und analysiert werden. Dies wird typischerweise ergeben ECAR und OCR-Plots, wie in 1A und 1B gezeigt. Nach der Injektion von Glucose (A), die Erhöhung der ECAR repräsentiert die Glykolyse Rate. Die zusätzliche Erhöhung ECAR nach ATP-Synthase-Hemmung mit Oligomycin (B) gibt Auskunft über die Glykolyse-Rücklage und Kapazität (Abbildung 1A). Bei der Analyse der OCR Werte oligomycin Einspritzung (B) ermöglicht die Berechnung der Sauerstoffverbrauch für mitochondriale ATP-Synthese eingesetzt. FCCP (C) entkoppelt die mitochondriale Atmung und die entsprechenden OCR Messungen ergeben Daten über die maximale und Ersatzatemkapazität. Schließlich Injektion von Rotenon (Rot) und Antimycin A (AA) zu blockieren mitochondrialer Komplex I und III und die Rest OCR steht für die nicht-mitochondriale Sauerstoff Nachteileumption (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Abbildung 1: aus einer XF Extracellular Flux Assays abgeleiteten metabolischen Parameter. (A) Die folgenden Parameter der zellulären Glykolyse von den ECAR Werten berechnet (in mph / min): Glykolyse, maximal glykolytischen Kapazität und glykolytischen Reserve. (B) OCR-Messungen (in pMol / min) werden verwendet, um die folgenden grundlegenden Parameter der Mitochondrienfunktion berechnen: Basalatmung, ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmungs und Ersatzatemkapazität. Gluc = Glucose; OM = Oligomycin A; FCCP = Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) phenylhydrazon; AA = Antimycin A; Rot = Rotenon <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach dem Lauf ECAR und OCR-Messungen 1 till 15 für jede Vertiefung kann nach Excel exportiert werden und von den ECAR Messungen die folgenden glykolytische Parameter können wie folgt berechnet werden: Nicht glykolytischen Versauerung = durchschnittl. ECAR (1,2,3) Glykolyse = durchschnittl. ECAR (4,5,6) - durchschnittl. ECAR (1,2,3) Maximale glykolytischen Kapazität = durchschnittl. ECAR (7,8,9) - durchschnittl. ECAR (1,2,3) Glykolytischen Reserve = durchschnittl. ECAR (7,8,9) - durchschnittl. ECAR (4,5,6) Von den OCR Raten kann die nächste metabolischen Eigenschaften ermittelt werden: Non-mitochondriale Atmung = durchschnittl. OCR (13,14,15) Basalatmung = durchschnittl. OCR (4,5,6) - durchschnittl. OCR (13,14,15) ATP-Produktion = durchschnittl. OCR (4,5,6) - durchschnittl. OCR (7,8,9) Protonenleck =durchschnittl. OCR (7,8,9) - durchschnittl. OCR (13,14,15) Maximale Atmungs = durchschnittl. OCR (10,11,12) - durchschnittl. OCR (13,14,15) Ersatzatemkapazität (SRC) = durchschnittl. OCR (10,11,12) - durchschnittl. OCR (4,5,6) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Fig. 2: metabolischen Eigenschaften von naiven (M0), LPS (M1) und IL-4 (M2) polarisiert Makrophagen Für jede Messung der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) von 8 einzelnen Vertiefungen dargestellt. (A) Die extrazelluläre Ansäuerung Raten (ECAR, in mph / min) und (B) Sauerstoffverbrauchsraten (OCR, in pMol / min) sind differentiell polarisiert (M1 und M2) und naiv Makrophagen (M0) gemessen. Alle Messungen wurden für die Zellzahl normalisiert (wie bei CyQUANT gemessen) und der durchschnittliche Zellzahl der naiven Makrophagen wurde auf 1 gesetzt InProjektions A = Glucose; B = Oligomycin; C = FCCP; D = Antimycin A + Rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Wie in 2A gezeigt ist, induziert die Aktivierung von Makrophagen mit LPS erhöht glykolytischen Metabolismus. Die Unterschiede zwischen LPS und IL-4-behandelten Makrophagen sind noch deutlicher, wenn man Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) in 2B. Tat, während die maximale oxidativen Metabolismus ist sehr in M (LPS) unterdrückt, IL-4 induziert die basale und insbesondere maximal Atmung M2 Makrophagen. Man sollte beachten, dass eine erhöhte glykolytische ist ziemlich einzigartig zu M (LPS) Makrophagen und ist nicht notwendigerweise ein Merkmal M1 Makrophagen, da M (IFNy) Makrophagen nicht angezeigt verbessern Glykolyse. Insgesamt zeigt dieses extrazellulären Flussanalyse that IL-4-induzierte M2 Makrophagen werden durch verbesserte oxidativen Stoffwechsel gekennzeichnet und vor allem eine hohe Ersatzatemkapazität (SRC), während LPS-aktivierten Makrophagen-Display verbessert glykolytischen Stoffwechsel und keine Ersatzatemkapazität besitzen.

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Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Aufrufe.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Serie: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

Polarisation von M1 und M2 Human Monocyte-Derived Cells und Analyse mit Durchflusszytometrie bei Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

Isolierung und In vitro Kultur von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen für das Studium der NO-Redox-Biologie

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...