Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich Metabolische Pfad Einrichtung in Leukämie-Zellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Messung des Stoffwechsels von primären Leukämiezellen in Echtzeit in lebenden Zellen ermöglicht. Beginnen Sie mit der Verdünnung einer Knochenmarkprobe, die von einem Leukämiepatienten in PBS im Verhältnis eins zu eins erhalten wurde.
Sorgfältig sechs Milliliter der verdünnten Knochenmarkprobe über sechs Milliliter frisch präpariertes Dichtegradientenmedium in einem 15 Milliliter konischen Rohr schichten und die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation trennen. Verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Schnittstellenschicht mononukleistischer Zellen sorgfältig auf ein neues 50-Milliliter-Konusrohr mit fünf MilliliterPBS für eine Zentrifugationswäsche zu übertragen. Dann setzen Sie das mononukleäre Zellpellet in zwei Millilitersterilen PBS zum Zählen wieder aus.
Verdünnen Sie die Zellen auf dreimal 10 bis die sieben Zellen pro Milliliter Konzentration. Und fügen Sie jeweils einen Milliliter Zellen zu zwei T75-Flaschen hinzu, die 20 Milliliter RPMI-Medium für eine 16- bis 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 enthalten. Um die Platten für die extrazelluläre Flussanalyse vorzubereiten, fügen Sie 12,5 Mikroliter Zellklebstofflösung in jeden Brunnen von zwei, acht gut extrazellulären Flussanalysatorplatten hinzu.
Nach 20 Minuten den Zellkleber ansaugen und jeden Brunnen zweimal mit 200 Mikroliter n. Wasser pro Wäsche waschen. Nach der zweiten Wäsche die Platten in der Haube lassen, bis die Brunnen trocken sind. Und legen Sie die Sensorpatrone auf den Kopf auf die Laborbank.
Trennen Sie die Versorgungsplatte und die Sensorpatrone des Flussanalysators. Und füllen Sie jeden Brunnen der Nutzplatte mit 200 Mikroliter Kalibrant und jeder Graben um die Außenseite der Brunnen mit 400 Mikroliter Kalibrant. Bringen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte zurück, die nun das Kalibrant enthält, und legen Sie die Patronenbaugruppe über Nacht in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator ohne CO2.
Dann schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie ihn über Nacht auf 37 Grad Celsius erwärmen. Am nächsten Morgen die Zellen aus dem Kolben auf 50 Milliliter konische Röhren zur Zentrifugation übertragen. Und die Pellets in einem Milliliter des geeigneten Versuchsmediums zum Zählen wieder aussetzen.
Setzen Sie die Zellen viermal 10 bis zu den sechs Zellen in 400 Mikrolitern experimenteller mittlerer Konzentration aus. Und fügen Sie 50 Mikroliter Zellen in Brunnen B durch G der Flussanalysatorplatte. Und 180 Mikroliter des Versuchsmediums in die Brunnen A und H als Hintergrundkontrollbrunnen.
Nach der Zentrifugation langsam und vorsichtig 130 Mikroliter des Versuchsmediums zu den Brunnen B durch G hinzufügen. Und visuell bestätigen stabile Haftung der Zellen an der Unterseite jedes Brunnens unter dem Mikroskop. Dann bringen Sie die Flussanalyseplatte 30 Minuten lang auf den befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator ohne CO2 zurück. 20 Minuten vor dem Ende der Inkubation die Verbindungen gemäß dem in der Tabelle angegebenen Versuchsprotokoll in die entsprechenden Injektoranschlüsse der Patrone laden.
Richten Sie dann das entsprechende extrazelluläre Flussanalyseprogramm ein. Starten Sie das Programm und ersetzen Sie die Kalibrierplatte bei Aufforderung durch die Assayplatte. In einem Glykolyse-Stresstest wird nur Basalmedium verwendet, so dass den Zellen Nährstoffe entzogen werden.
Der erste erhaltene Parameter ist die Basalversauerung, die die Menge an Glukose widerspiegeln sollte, die in Zellen gespeichert ist. Nach der ersten Injektion wird die extrazelluläre Versauerungsrate erhöht, da die Zellen die Glukose nutzen und die Glukose zu Laktat fermentieren können. Das Oligomycin A in der zweiten Injektion hemmt die ATP-Synthase und weist die Zellen so an, ATP hauptsächlich durch eine Glykolyse zu produzieren, die eine weitere Erhöhung der extrazellulären Versauerungsrate verursacht.
Während die Injektion von 2-Deoxy-D-Glucose die Glykolyse vollständig hemmt und die extrazelluläre Versauerungsrate sinkt. Im Zellmito-Stresstest wird ein mit Glutamin und Glukose ergänztes Medium verwendet, damit den Zellen nicht alle Nährstoffe entzogen werden. Der basale Atmungsparameter spiegelt ihren basalen Stoffwechselzustand wider.
Nach der ersten Injektion mit Oligomycin A hemmen die Zellen die mitochondriale Atmung und wechseln zur Glykolyse, die als Abnahme der Sauerstoffverbrauchsrate dargestellt wird. Die zweite und dritte Injektion von FCCP entkoppeln jedoch die ATP-Produktion von der Atmung, so dass die Zellen nun maximal Sauerstoff verbrauchen. Und der Sauerstoffverbrauch steigt auf den höchsten Wert.
Die letzte Injektion des Roton- und Antimycin-A-Gemischs hemmt die mitochondriale Atmung vollständig und senkt den Sauerstoffverbrauch auf nahezu Null. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Prozentsatz der Explosionen in der Probe zu bewerten, um sicherzustellen, dass nur die metabolischen Parameter der Leukämiestrahlen gemessen werden. Bei der Implementierung dieser Methode muss eine sorgfältige Optimierung der Anbaubedingungen und der Datennormalisierung angewendet werden.
