Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz. Ziel dieses Verfahrens ist es, ein optimiertes Protokoll für die schnelle und einfache Hochleistungs-Kapillarsäulenpackung für die LC-MS-Proteomik-Analyse einzuführen. Die moderne Proteomik basiert auf Massenspektrometrie in Verbindung mit ultrahochleistungsfähiger Kapillarflüssigkeitschromatographie.
Die Peptidtrennung erfolgt meist in Kapillarsäulen mit einem Innendurchmesser von 75 Mikrometern. Auf Augenhöhe mit kommerziellen Produkten ist es möglich, Kapillarsäulen im eigenen Haus vorzubereiten. Speziell vorbereitete Säulen weisen ähnliche Trenneigenschaften wie kommerzielle Analogien auf, sparen viel Geld und ermöglichen die Anpassung von Sorptionsmitteln und Säulengrößen.
Hier demonstrieren wir ein optimiertes Packverfahren für die hauseigene Kapillarsäulenfertigung, das wir FlashPack nennen. Die Idee hinter der Optimierung besteht darin, von einer sehr hohen Sorptionsschlammkonzentration zu packen und gleichzeitig den gleichen üblichen 100 bar Druckbombenpackungsaufbau zu verwenden. Dies erfordert ein kontinuierliches Aufbrechen von Sorptionsmittelclustern, die sich bei hoher Sorptionsmittelkonzentration um den Säuleneingang bilden und verhindern, dass neues Sorptionsmaterial in die Kapillare gelangt.
Technisch erreichen wir dies, indem wir eine Magnetstange als Hammer verwenden, die Kapillare im Inneren des Sorptionsdrahtes ständig erhitzt und bewegt. Richtig angewendetes FlashPack erhöht die Packrate um das bis zu 10-fache. Das macht es geeignet für das Verpacken von Ultrahochleistungssorbentien von weicherer Mikrometrikbeat-Größe und für die Herstellung sehr langer Säulen bis zu einem Meter Länge in angemessenen Zeiten.
Das Verfahren zur Säulenvorbereitung besteht aus fünf Schritten. Drei vorbereitende Schritte, die die Montage der Packstation und die Vorbereitung von Kapillar- und Sorptionsschlämmen umfassen. Dann wird die Kapillare zunächst bei 60 bis 100 bar Druck in die Druckbombe gepackt.
Es folgt der Anschluss der verpackten Kapillare an das HPLC-System, das Verpacken des Sorptionsmittels bei hohem Druck und das Schneiden der Säule auf die Größe. Das FlashPack-Verfahren erfordert Änderungen in den Schritten drei und vier des gemeinsamen Protokolls. Zuerst bereiten wir eine Packstation vor.
Es besteht aus einem Stickstoffgastank mit mindestens 50 bar Ausgangsdruck. Der Tank ist mit dem Entlüftungsventil der Druckbombe verbunden, das sich im Magnetrührer befindet. Der Auslass des Entlüftungsventils wird durch eine schmale ID PEEK-Kapillare in eine Wasserflasche eingeführt, die eine Feinkontrolle der Druckentlastung ermöglicht.
Als nächstes bereiten wir eine Kapillare vor. Die Verpackung kann entweder in eine gestreue Kapillare mit einer integrierten Glasfritte aus Kasil und Formamid erfolgen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, in eine gezogene Kapillare zu packen, die mit einem Sutter-Laser-Puller hergestellt wird.
Die Kapillare muss 10 bis 15 Zentimeter länger als die vorgesehene Säulenlänge sein. Das folgende Video wird am Beispiel einer gezogenen Emitterkapillarpackung erstellt. Schützen Sie ein gezogenes Emitterende mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit Gelbeladung.
Weitere Informationen finden Sie in der Textversion des Manuskripts. Die nächste Stufe ist die Vorbereitung von Sorptionsschlämmen. Geben Sie zunächst etwa 50 Milligramm trockenes Sorptionsmittel in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Das wird ein Sorptionsfläschchen sein. Dieses Video wurde unter Verwendung des mikrometrischen Sorptionsmittels Reprosil Pur C18 AQ 1.9 von Dr.Maisch erstellt. Einen Milliliter Methanol in die Durchstechflasche mit Sorptionsmittel geben.
Wirbel für 10 Sekunden. Und beschallen Sie in einem Ultraschallbad für weitere 10 Sekunden. Lassen Sie das Sorptionsmittel 20 bis 30 Minuten lang gründlich einweichen, dann wirbeln und beschallen Sie es erneut.
Bereiten Sie eine funktionierende Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor. Es muss sich um ein konisches Fläschchen mit Boden handeln, das in die Bombe passt. Es kann sich entweder um ein weiteres 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr oder ein anderes Fläschchen handeln, abhängig von der jeweiligen Druckbombenkonstruktion.
Wir verwenden ein konisches Schraubverschlussrohr mit Schraffur, das auf die Höhe der Druckbombe zugeschnitten ist. Suspendieren Sie das Sorptionsmittel in der Durchstechflasche mit Sorbens erneut und übertragen Sie 500 Mikroliter zusammen mit einer zwei mal drei Millimeter großen Magnetstange in das Arbeitssorbenstechflasche. Auf die Arbeitsflasche auf einen Milliliter mit Methanol aufschlagen.
Lassen Sie die Arbeitsflasche 10 Minuten lang auf dem Tisch stehen, damit sich das Sorptionsmittel durch Schwerkraft absetzt. Das Ergebnis dieses Schritts muss eine konische untere Durchstechflasche sein, deren untere Schicht aus losem Sorptionsmittel etwa vier Millimeter hoch ist. Wenn die Schicht zu niedrig ist und etwas mehr Sorptionsmittel aus der Durchstechflasche.
So ist die vorbereitete Arbeitsfläschchen für die Vorbereitung mehrerer Säulen über Monate bestimmt. Wenn die Arbeitsstechflasche mit Sorptionsmittel länger als zwei Stunden ohne Rühren bleibt, muss sie vor dem Verpacken durch Schwerkraft erneut vorgewirbelt, beschallt und abgesetzt werden. Wenn alles vorbereitet ist, fahren Sie mit Stufe vier fort und packen Sie die Druckbombe ein.
Tragen Sie immer eine Schutzbrille, wenn Sie mit Quarzglaskapillaren und der Druckbombe arbeiten. Gleichzeitig werden Schutzhandschuhe nicht empfohlen. Sie reduzieren den Tastsinn, der für den richtigen Umgang mit Kapillaren mit kleinem Durchmesser erforderlich ist, erheblich und führen zu Fehlern.
Legen Sie die Durchstechflasche in die Druckbombe und fixieren Sie alle Knoten fest. Beginnen Sie die Rotation mit 60 bis 100 Schuss pro Minute, setzen Sie die gefohlene oder gezogene Emitterkapillar in die Bombe ein. Schieben Sie es bis zum Boden der Durchstechflasche, heben Sie es dann zwei bis drei Millimeter an und fixieren Sie den Knoten.
Wenden Sie die erforderliche Mindestkraft an, um die Kapillare zu fixieren. Überprüfen Sie, ob die Kapillare richtig fixiert ist. Es muss unmöglich sein, die Kapillare zu bewegen, indem man sie von Hand herauszieht.
Öffnen Sie das Druckbombenventil sehr langsam, während Sie das offene Ende der Kapillare von Ihrem Gesicht weg zeigen. Beobachten Sie die ersten Schritte des Verpackungsprozesses. Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung füllt das Sorptionsmittel die Kapillare und wird für die gesamte Länge undurchsichtig.
Sobald sich das Sorptionsmittel im distalen Ende einzupacken beginnt, steigt der Gegendruck, der Fluss verlangsamt sich und die gleichmäßige Sorptionsschlämme im Kapillar bildet sich in mehrere Sorptionsmittelpakete um, die durch sorptionsfreie Lücken getrennt sind. Bereits gepacktes Sorptionsmittel ist als dicht gefärbtes, kontinuierlich wachsendes Gebiet sichtbar. Halten Sie die mit Sorptionsmittel gefüllten Bereiche während der gesamten Dauer des Verpackungsprozesses auf mindestens 70% der Kapillarlänge mit kleinen sorptionsmittelfreien Lücken.
Es gibt mehrere häufige Probleme, die während des Verpackungsprozesses zu beachten sind. Sie erfordern eine Anpassung des Aufbaus während des Fluges, um eine effiziente Sorptionsmittelabgabe in die Kapillare zu gewährleisten. Das häufigste Problem ist, wenn neues Sorptionsmittel aufhört, in die Kapillare einzudringen, während das Sorptionsmittel, das sich bereits im Inneren befindet, in Bewegung bleibt.
In den meisten Fällen wird der Kapillareingang durch selbstaggregierende Sorptionscluster blockiert. Wenden Sie diese Schritte nacheinander an, bis der Sorptionsmittelfluss wiederhergestellt ist, und überspringen Sie dann die restlichen problembezogenen Schritte. Erhöhen Sie die Drehzahl auf 500 Schuss pro Minute und reduzieren Sie sie sofort wieder auf 60 U / min.
Meistens stellt es den Sorptionsmittelfluss wieder her. Überprüfen Sie die Drehzahl für den Rest des Verpackungsprozesses auf mindestens 60 U / min. Wenn es nicht hilft, entlüften Sie die Packbombe kurz und setzen Sie sie sofort wieder unter Druck.
Wenn es nicht hilft oder die Blockierung erneut auftritt, positionieren Sie die Kapillare in der Sorptionsschicht neu. Das Fehlen des Sorptionsmittels kann darauf zurückzuführen sein, dass das kapillare offene Ende entweder zu hoch über der Magnetstange liegt, so dass das Säulenende es nicht berührt. Oder die Kapillare ist zu niedrig positioniert und klebt in den Fläschchenboden.
Entlüften Sie zuerst die Bombe vollständig, lösen Sie dann die Mutter, drücken Sie die Kapillare nach unten und ziehen Sie sie dann zwei Millimeter zurück. Befestigen Sie die Mutter. Öffnen Sie das Ventil, um die Bombe unter Druck zu setzen, und fahren Sie mit dem Packen fort.
Weitere Details zu den Packproblemen sind in der Textversion der Methode beschrieben. Packen Sie die Säule weiter, bis die Zielsäulenlänge plus fünf bis sieben Zentimeter erreicht ist. Stoppen Sie die Rotation und verringern Sie die Bombe sehr langsam.
Öffnen Sie das Bombenventil ein wenig und warten Sie, bis die Blase in der Wasserflasche platzt. Öffnen Sie dann das Ventil etwas weiter und warten Sie erneut, bis die Blase platzt. Lösen Sie also in inkrementellen Schritten den Druck, bis kein Gas mehr aus dem Ventil austritt.
Öffnen Sie das Ventil nicht ganz auf einmal. Es führt zu einem Blubbern in der Kapillare und dem Sorptionsmittel, das in die Durchstechflasche zurückkehrt. Wenn das passiert, setzen Sie die Bombe unter Druck und warten Sie, bis die Säule wieder gepackt ist.
Wenn das Gas nicht mehr aus dem Entlüftungsventil kommt, nehmen Sie die gepackte Kapillare aus der Druckbombe. Lassen Sie die Säule nicht austrocknen. Wenn sie nicht sofort zur weiteren Verpackung an das HPLC-System angeschlossen sind, lagern Sie die verpackte Kapillare ein, indem Sie sie als Ganzes in 10% ige Ethanollösung tauchen.
Getrennte HPLC-Säulen werden auf die gleiche Weise gespeichert. Wenn für heute keine Verpackung mehr geplant ist, nehmen Sie das Sorptionsmittelfläschchen aus der Bombe heraus und schließen Sie es fest. Halten Sie es für die weitere Sammlung der Säule.
Stufe fünf, HPLC packt zusammen. Verbinden Sie die gepackte Kapillare über eine HPLC-Verbindung mit dem HPLC-System. Starten Sie den Fluss von hohem organischem Lösungsmittel.
Passen Sie den Durchfluss entsprechend der Packlänge an, die auf etwa 300 Balken abzielt. Für 40 Zentimeter verpackte Kapillare verwenden Sie die Durchflussrate von 200-300 normalen Litern pro Minute. Achten Sie auf loses Sorptionsmittel in der Kapillare, das verpackt wird, was die Gesamtpacklänge erhöht.
Ohne den Fluss zu stoppen, tauchen Sie den Säulenkörper zweimal in das Beschallungsbad ein. Es ist wichtig, nur einen Teil des Säulenkörpers einzutauchen. Stützenenden und Kapillarverbindungen nicht eintauchen lassen.
Wenn das Sorptionsbett aufhört zu schrumpfen, tauchen Sie den Säulenkörper noch zweimal in das Beschallungsbad ein, ohne den Fluss zu stoppen. Führen Sie die Spalte weitere 10 Minuten bei 300 Balken aus. Stoppen Sie den Durchfluss, warten Sie, bis der Druck unter drei Balken fällt, und trennen Sie die Säule.
Überprüfen Sie die Säule visuell auf fehlende Lücken und Verfärbungen. Wenn welche gefunden werden, kann die Beschallung unter der Strömung wiederholt werden. Erwägen Sie für kritische Experimente, eine neue Spalte zu erstellen.
Schneiden Sie die Spalte auf die gewünschte Länge aus. Richtig ausgeführtes Schneiden ist eine Voraussetzung für die Säuleneffizienz. Machen Sie eine Kerbe in Polyamidbeschichtung mit dem Schreiber.
Spalten Sie die Kapillare teilweise und ziehen Sie zwei Stücke auseinander. Polieren Sie das Säulen-Frontend auf einem Keramikwafer oder mit Läppfolie. Schließen Sie die Säule über einen Ultrahochdruckanschluss wieder an das LC-System an.
Beginnen Sie den Arbeitsdurchfluss bei 2% B. Der Arbeitsfluss wird entsprechend den Spaltenparametern angepasst. Zum Beispiel werden 100 Mikrometer-ID-Säulen mit 500 Nanolitern pro Minute betrieben.
Warten Sie, bis sich der Druck ausgeglichen hat, und überprüfen Sie den Gegendruck der Säule. Eine richtig vorbereitete Säule gibt Einen Gegendruck, der proportional zu ihrer Länge und ihren Sorptionseigenschaften ist. Zum Beispiel hat eine 30-Zentimeter-Kapillarsäule, die mit zwei Mikrometern Sorptionsmittel gefüllt ist, einen Gegendruck von 450 bis 500 bar bei 2% Lösungsmittel B. Wenn die produzierte Säule einen Gegendruck innerhalb des erwarteten Bereichs ergibt, ist sie gebrauchsfertig.
Wenn der Gegendruck weit außerhalb des erwarteten Bereichs liegt, stimmt etwas entweder mit der Säule oder mit dem LC-System nicht. Die Verpackung mit FlashPack erzeugt eine 50 Zentimeter lange Kapillare mit 1,9 Mikrometer Sorptionsmittel in weniger als einer Stunde bei 100 bar Packdruck. Als Beispiel produzieren wir eine 30 Zentimeter 100 Mikrometer ID Ultrahochdrucksäule, die in eine gezogene Emitterkapillare mit 1,9 Mikrometer ReprosilPur C18 AQ Sorptionsmittel verpackt ist.
Die Verpackung erfolgte bei 60 bar in eine 50 Zentimeter lange gezogene Emitterkapillare. Die Kapillare wurde in 40 Minuten auf 40 Zentimeter gepackt, wobei etwas mehr Sorptionsmittel in der Kapillare nicht gepackt war. Die gepackte Kapillare wurde an das HPLC-System angeschlossen und mit 300 Nanolitern pro Minute mit dem Lösungsmittel B betrieben, das in unserem Fall 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure war.
Die endgültige Packlänge betrug 43 Zentimeter. Die Säule wurde um 30 Zentimeter geschnitten. Bei 500 Nanoliter pro Minute Arbeitsfluss mit 99% Lösungsmittel B ergab die Säule den Gegendruck von 275 bar, was nahe am erwarteten Wert liegt.
Um die Säule zu testen, trennten wir 50 fmol eines tryptischen Digests von Cytochrom-C-Protein in einem 15-minütigen Gradienten von 2-50% B. Chromatographische Peaks waren hochsymmetrisch mit minimalem Tailing. Die durchschnittliche FWHM betrug etwa drei Sekunden.
Das beschriebene Protokoll ist in der Lage, UHPLC-Säulen in einer gängigen 100-bar-Packung in angemessener Zeit herzustellen. Kurze HPLC- oder UPLC-Säulen können in wenigen Minuten verpackt werden, während lange 30-50-Zentimeter-Säulen in weniger als einer Stunde verpackt werden. Die Methode ist effizient zum Verpacken von Sorbentien mit RP und jeder anderen Chemie in beliebige Spalten-IDs.
Produzierte Säulen sind reproduzierbar so effektiv wie jede andere kommerzielle Säule ähnlicher Größe und Sorptionsparameter.
